張慧娟, 朱效剛, 毛 鵬, 牛國強(qiáng), 趙 杰, 許贛榮,*

(1.深圳萬樂藥業(yè)有限公司,廣東深圳 518029;2.山東梁山正大菱花生物科技有限公司,山東濟(jì)寧 272600;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

溶氧對紅曲菌發(fā)酵生物合成橙色素的影響

張慧娟1, 朱效剛2, 毛 鵬3, 牛國強(qiáng)3, 趙 杰2, 許贛榮3,*

(1.深圳萬樂藥業(yè)有限公司,廣東深圳 518029;2.山東梁山正大菱花生物科技有限公司,山東濟(jì)寧 272600;3.江南大學(xué)生物工程學(xué)院,江蘇無錫 214122)

研究了溶氧對紅曲菌在發(fā)酵罐中生物合成橙色素的影響。分別采用不同通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速以達(dá)到不同溶氧水平,考察不同溶氧水平下紅曲菌w1夏在10 L發(fā)酵罐中生產(chǎn)橙色素的情況,并將優(yōu)化后條件放大至50 L發(fā)酵罐中。結(jié)果表明,不同通氣量水平下底物消耗、pH值和溶氧情況相似,但最終橙色素色價(jià)不同,基本上呈現(xiàn)出隨通氣量增加,色價(jià)呈現(xiàn)上升趨勢;攪拌轉(zhuǎn)速升高,菌體量和色價(jià)均隨之升高,但漲幅不大;50 L罐中菌體生長和橙色素合成結(jié)果驗(yàn)證了10 L罐結(jié)果。在大規(guī)模生產(chǎn)時(shí)應(yīng)盡可能采用高的通氣量和適宜的攪拌轉(zhuǎn)速,達(dá)到較高的溶氧水平,以利于菌體生長和橙色素合成。

紅曲;橙色素;發(fā)酵條件;色價(jià);溶氧

隨著消費(fèi)者對合成色素在食用安全方面的潛在危害的不斷重視,近年來天然色素在食品工業(yè)中的應(yīng)用逐年增加[1]。天然色素中使用最廣泛的就是紅曲色素,紅曲產(chǎn)品在食品中的應(yīng)用已有上千年歷史[2]。在紅曲色素的混合物中,從感觀上來看,橙色素是最為鮮艷奪目的色素,因其顏色較為獨(dú)特、醒目,在眾多需要著色劑的產(chǎn)品中都可找到其應(yīng)用前景。另外,橙色素除色素本身的功能以外,還具有抑菌性及增強(qiáng)免疫力、抗疲勞、降血脂、抗肥胖及降血糖的功效[3-6],因此是值得開發(fā)的紅曲色素品種。目前國內(nèi)對紅曲橙色素的研究極少,僅限于小樣試制,尚未實(shí)現(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)。

紅曲霉生產(chǎn)紅曲色素不僅受培養(yǎng)基組成的影響,培養(yǎng)條件對色素種類和色價(jià)也有顯著影響[7-8],尤其溶氧條件是需氧發(fā)酵控制最重要的參數(shù)之一[9]。氧在水中的溶解度很小,在發(fā)酵液中亦是如此,因此,發(fā)酵過程中需要不斷通氣和攪拌,才能滿足紅曲橙色素對氧的需求。不同通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速直接影響溶氧水平的高低,進(jìn)而對菌體生長和色素生成產(chǎn)生不同的影響。從發(fā)酵工程專業(yè)的角度來說,機(jī)械攪拌發(fā)酵罐進(jìn)行放大實(shí)驗(yàn)時(shí),攪拌轉(zhuǎn)速和通風(fēng)量是影響溶氧的兩個(gè)關(guān)鍵參數(shù),因此在發(fā)酵時(shí)必須研究。

張慧娟等[10-12]最早對紅曲橙色素基本性質(zhì)、液態(tài)發(fā)酵及紅曲橙色素的制備方法等方面做了詳細(xì)的研究。近年來國內(nèi)對紅曲橙色素的研究逐漸增多,但研究方向多偏向于橙色素的合成機(jī)制、特性、檢測方法、功能、分子結(jié)構(gòu)及作用活性等方面。從橙色素的生產(chǎn)方法看,大多采用紅曲米固態(tài)發(fā)酵,通過浸提法生產(chǎn)橙色素[13-17]。雖然張慧娟等開始了液態(tài)法生產(chǎn)橙色素,但試驗(yàn)僅限于搖瓶發(fā)酵,且當(dāng)時(shí)發(fā)酵水平總體較低,關(guān)于溶氧對紅曲菌液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)橙色素的影響這一專題還缺乏深入研究。因此,為了確定溶氧對發(fā)酵生產(chǎn)橙色素的影響,本研究設(shè)計(jì)了不同通氣量及攪拌轉(zhuǎn)速等影響溶氧的條件,研究了發(fā)酵罐橙色素色價(jià)生產(chǎn)情況。

1 材料與方法

1.1 菌種

紅曲霉菌種編號為紅曲菌w1夏,江南大學(xué)固態(tài)發(fā)酵研究室保藏菌種,該菌株具有良好的橙色素生產(chǎn)能力。

1.2 材料與試劑

PDA培養(yǎng)基(g/L):馬鈴薯200,葡萄糖20,瓊脂20,自然pH值。

種子培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉40,玉米漿粉10,酵母膏10,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,初始pH值為4.0。

發(fā)酵基本培養(yǎng)基(g/L):玉米淀粉60,硫酸銨5.0,KH2PO42.0,K2HPO42.0,MgSO4·7H2O 0.5,CaCl20.1,FeSO4·7H2O 0.01,ZnSO4·7H2O 0.01,MnSO4·H2O 0.03,NaNO32.0,初始pH值為4.0。

1.3 儀器與設(shè)備

HY-G-a型回旋式恒溫調(diào)速搖床柜,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;U3900型紫外可見分光光度計(jì),日立高新技術(shù)公司;PYX-XHS-405型電熱恒溫培養(yǎng)箱,上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠;KDC-16H型臺式高速冷凍離心機(jī),Sigma公司。GS-8100型10 L發(fā)酵罐、GS-8100型50 L發(fā)酵罐,上海廣世生物工程設(shè)備有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 菌種的培養(yǎng)

將PDA培養(yǎng)基上的斜面菌種在30℃下恒溫培養(yǎng)7～10 d,刮取斜面孢子,制備孢子懸浮液,接種于種子培養(yǎng)基中,在30℃,180 r/min培養(yǎng)2～3 d后即為種子液。

1.4.2 10 L發(fā)酵罐中通氣量對橙色素發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)

紅曲橙色素液態(tài)發(fā)酵方法參照許贛榮專利[17]。

發(fā)酵罐裝液量約60%,培養(yǎng)基體積為5.6 L,種子液體積為200 mL;培養(yǎng)溫度為30℃;轉(zhuǎn)速為150 r/min;培養(yǎng)周期為6 d;在培養(yǎng)過程中分別設(shè)通氣量為0.5∶1,1∶2,1∶3三個(gè)梯度,考察不同通氣量對橙色素生產(chǎn)的影響。

1.4.3 10 L發(fā)酵罐中轉(zhuǎn)速對橙色素發(fā)酵影響實(shí)驗(yàn)

通氣量為1∶3;培養(yǎng)周期為6 d;在培養(yǎng)時(shí)分別控制攪拌轉(zhuǎn)速為100,200,300 r/min三個(gè)梯度,考察不同轉(zhuǎn)速對橙色素生產(chǎn)的影響。其他條件同1.3.2。

1.4.4 優(yōu)化溶氧條件后放大至50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵方法

裝液量約60%,培養(yǎng)基體積為28 L,種子液體積為1 L;培養(yǎng)溫度為30℃;轉(zhuǎn)速為200 r/min;通氣量1∶0.9(50 L罐最大通氣量水平);培養(yǎng)周期為6 d。

1.4.5 菌體量的測定

將發(fā)酵液充分混合均勻后精確量取10 mL過濾,濾渣用蒸餾水洗滌3次,用烘干至恒重的濾紙(m1)抽濾,105℃烘干至恒重。用電子天平稱菌體和濾紙總重量,記作m2。菌體量記作X,見式(1)。

1.4.6 發(fā)酵液色價(jià)及色調(diào)的測定[18]

將發(fā)酵液研磨混勻后取5 mL于50 mL比色管中,用75%的乙醇定容至50 mL,置于55℃恒溫水浴中浸提1 h。冷卻至室溫后在6 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心5 min。用相同濃度的乙醇稀釋,并以同種乙醇為空白對照,在465 nm處進(jìn)行全波長掃描,測定OD值,見式(2)、式(3)。

1.4.7 總糖的測定

本實(shí)驗(yàn)碳源是玉米淀粉,采用苯酚硫酸法測定發(fā)酵液中的總糖含量[19]。

1.4.8 氮源測定

采用凱氏定氮法測定發(fā)酵液中的氮源含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 10 L罐中紅曲橙色素發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析

分別對不同通氣量和不同攪拌轉(zhuǎn)速時(shí)的底物消耗、發(fā)酵過程中pH值和溶氧變化等情況進(jìn)行分析。

2.1.1 10 L罐中通氣量對橙色素發(fā)酵底物消耗及色價(jià)的影響

圖1為3個(gè)不同通氣量水平下碳氮源消耗及橙色素色價(jià)情況。由圖1(a)可見,通氣量為1∶0.5時(shí)碳氮源消耗較慢,發(fā)酵第7天時(shí)殘?zhí)琴|(zhì)量濃度依然在15 g/L以上,氮源硫酸銨也有1/3殘余;由圖1(b)、(c)可見,通氣量為1∶2和1∶3時(shí),氧的供應(yīng)相對充足,發(fā)酵第7天時(shí)發(fā)酵底物碳氮源均消耗殆盡。

另外,各通氣量情況下橙色素色價(jià)增長均呈現(xiàn)相似趨勢。48 h前基本無橙色素產(chǎn)出,色價(jià)基本持續(xù)為0;48 h后隨著菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期后,橙色素也開始產(chǎn)出,且菌體量快速增加,橙色素的產(chǎn)出速率也不斷增加。不同通氣量水平最終導(dǎo)致橙色素色價(jià)有所不同,基本上是隨通氣量增加,色價(jià)呈現(xiàn)上升趨勢。

總之,隨著通氣量的不斷增加,碳氮源消耗速率也相應(yīng)加快,底物消耗殆盡的時(shí)間也不斷提前。1∶3最大通氣量時(shí),碳源在第4天即降至接近零水平,氮源在發(fā)酵至第7天接近零水平;橙色素色價(jià)隨著通氣量增加也不斷升高,最大通氣量1∶3時(shí)發(fā)酵至第7天,色價(jià)達(dá)到369.1 U/mL。

圖1 不同通氣量時(shí)碳氮源消耗及產(chǎn)物產(chǎn)出情況Fig.1 Change of substrate consumption and production under 0.5∶1,1∶2 and 1∶3 ventilation

2.1.2 10 L罐中通氣量對橙色素發(fā)酵過程pH值和溶氧等參數(shù)的影響

圖2為3個(gè)不同通氣量水平下溶氧及pH值變化情況。由圖2可見,3種通氣水平時(shí)溶氧變化趨勢基本一致。在30 h前,菌體生長處于延滯期,生長緩慢,需氧量不大,發(fā)酵液中溶氧保持在較高水平,基本在90%以上;在30～60 h,伴隨著菌體生長進(jìn)入對數(shù)生長期,菌體的快速生長需要消耗大量氧氣,以至于發(fā)酵液中溶氧水平急劇下降。除1∶3通氣量時(shí)供氧量相對較高外,其他降低組溶氧水平在60 h后將至10%以下,說明通氣量相對于菌體生長略顯不足;在132 h后溶氧水平又呈現(xiàn)出略有回升的趨勢,這是因?yàn)榫w在生長后期,生長活力下降,菌體開始進(jìn)入衰亡期,相應(yīng)需氧量降低,在不變的通氣量情況下,發(fā)酵液中的溶氧開始回升。

圖2 不同通氣量時(shí)溶氧及pH值變化Fig.2 Change of DO and pH under 0.5∶1,1∶2 and 1∶3 ventilation

3種通氣水平時(shí)pH值變化在前期基本相似。30 h之前菌體處于延滯期,pH值基本維持在設(shè)定的4.0左右;在30～54 h,隨著菌體進(jìn)入對數(shù)生長期,發(fā)酵液中碳源大量被利用,菌體生長代謝產(chǎn)生乳酸等酸性代謝產(chǎn)物,導(dǎo)致發(fā)酵液pH值呈現(xiàn)快速下降趨勢。54 h后,隨著發(fā)酵液中碳源的不斷減少,碳源即成為菌體生長的限制性因素。在直接碳源不足的情況下,菌體會利用含氨基酸的氮源及代謝產(chǎn)物乳酸等作為碳源供菌體生長。由于氨基酸代謝及乳酸的利用均會增加pH值,所以后期pH值又呈現(xiàn)回升趨勢。發(fā)酵結(jié)束,通氣量為0.5∶1時(shí),相對于高通氣量的1∶2和1∶3組,因?yàn)橥饬枯^小,菌體生長緩慢,橙色素產(chǎn)出同時(shí)消耗的碳氮源底物相對較低。最終結(jié)束時(shí)氮源利用尚不完全,所以pH值仍維持在4.0～4.5。高通氣量組因?yàn)槿苎跻恢碧幱谙鄬Τ渥愕乃?菌體生長直至發(fā)酵液中碳氮源底物均消耗殆盡,所以最終發(fā)酵結(jié)束時(shí)pH值較低,僅有2.7左右。

2.1.3 10 L罐攪拌轉(zhuǎn)速對橙色素發(fā)酵的影響

攪拌可以防止氣泡聚集,使液體形成湍流,增加氣液接觸時(shí)間,將空氣通過攪拌槳葉端的高速剪切力破碎成小氣泡。從而明顯增大有效氣液傳遞面積,增大液體流動速度,減少雙膜理論中氣液界面滯留層的厚度,降低傳質(zhì)阻力,改善溶氧[20]。因此,需在合理范圍內(nèi)控制攪拌轉(zhuǎn)速。

在1∶3通氣條件下,分別設(shè)定發(fā)酵轉(zhuǎn)速為100,200,300 r/min,考察了轉(zhuǎn)速對菌體量和橙色素色價(jià)的影響,結(jié)果見圖3。圖3顯示,轉(zhuǎn)速升高,最終菌體量和橙色素色價(jià)也隨之升高,但漲幅不大。3個(gè)攪拌轉(zhuǎn)速下,發(fā)酵6 d,橙色素色價(jià)分別達(dá)到317,336,350 U/mL。通氣量一定的條件下,隨著轉(zhuǎn)速升高,發(fā)酵液內(nèi)的溶氧也相應(yīng)提高。紅曲菌代謝對氧的需求量大,較高的溶氧條件下,糖消耗快,相對更有利于菌體的生長及色素的產(chǎn)生。攪拌轉(zhuǎn)速達(dá)到200 r/min后,隨著攪拌轉(zhuǎn)速的增加,菌體和橙色素色價(jià)增長幅度不大,說明轉(zhuǎn)速并不是越大越好。另外,盲目提高轉(zhuǎn)速不僅會大幅增加攪拌功率,同時(shí)會使菌體受到剪切力的破壞,不利于發(fā)酵的進(jìn)行。

2.2 優(yōu)化溶氧條件放大至50 L發(fā)酵罐中發(fā)酵結(jié)果

根據(jù)10 L發(fā)酵罐中溶氧條件試驗(yàn)結(jié)果可知,通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速增加后溶氧水平會相應(yīng)提高,對菌體生長和橙色素合成有利。在此結(jié)論基礎(chǔ)上,根據(jù)50 L罐的最大允許設(shè)置條件,確定50 L罐上通氣量為1∶0.9,轉(zhuǎn)速為200 r/min,發(fā)酵結(jié)果見圖4和圖5。

圖3 不同攪拌轉(zhuǎn)速下菌體量及色價(jià)的變化Fig.3 Biomass and color value under different stirring speed

圖4 50 L罐發(fā)酵過程中總糖、菌體量和色價(jià)的變化Fig.4 Change of total sugar,biomass and color value in 50 L bioreactor

圖5 50 L罐發(fā)酵過程中pH值和溶氧變化Fig.5 Change of DO and pH in 50 L bioreactor

由圖4、圖5可知,50 L罐中底物消耗(總糖)情況與10 L罐中1∶2和1∶3通氣量時(shí)相似。72 h前底物隨著菌體量的對數(shù)生長期快速增加而迅速消耗,總糖濃度快速下降;72 h后隨著菌體量達(dá)到最大值且處于穩(wěn)定期后,橙色素色價(jià)開始快速增加;直到144 h底物消耗殆盡,菌體生長處于衰亡期,色價(jià)已沒有明顯增加趨勢。結(jié)束發(fā)酵時(shí)最終橙色素色價(jià)達(dá)到347 U/mL。

發(fā)酵過程中,pH值和溶氧變化也基本與10 L罐中相似。發(fā)酵全程中pH值維持在3.0以上,在24 h之前菌體處于延滯期,pH值變化不大;24～40 h菌體處于對數(shù)生長期,隨著菌體的快速生長及底物碳源的不斷利用,pH值迅速下降;隨著氮源的不斷利用及發(fā)酵過程中乳酸的再利用,使得pH值呈現(xiàn)波動狀況,最終結(jié)束時(shí)pH值為3.4。溶氧全程在15%以上,說明所采用的通氣量和攪拌轉(zhuǎn)速足以維持菌體生長所需的溶氧。同樣在菌體達(dá)到最大值時(shí),溶氧最低為17%;隨著菌體生長變慢,需氧量降低,溶氧逐漸呈現(xiàn)回升狀態(tài),最終結(jié)束發(fā)酵時(shí)溶氧在62%左右。

總之,50 L罐中菌體生長和橙色素生產(chǎn)情況與10 L罐中采用較高通氣量和適宜轉(zhuǎn)速時(shí)結(jié)果一致。

3 討 論

紅曲橙色素的液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)具有機(jī)械化、自動化程度高,易于控制,生產(chǎn)色素含量高,雜質(zhì)少,應(yīng)用范圍廣等優(yōu)點(diǎn)。液態(tài)發(fā)酵時(shí)采用的培養(yǎng)基、培養(yǎng)液pH值及溶氧等水平都會影響菌體生長和橙色素的合成,因此,需要針對不同菌種及色素種類優(yōu)化相應(yīng)的發(fā)酵條件。

發(fā)酵液中的溶氧濃度是影響發(fā)酵的關(guān)鍵因素,對菌體的生長和色素的合成都有重要的影響,需要根據(jù)氧的溶解特性及菌體對氧的需求,分析溶氧對發(fā)酵和產(chǎn)物的影響,進(jìn)而確定溶氧量的控制,使生產(chǎn)效益最大化[21]。

紅曲橙色素生物合成過程為典型的好氧發(fā)酵,溶氧水平的高低會直接影響色素色價(jià),因此,在發(fā)酵過程中需要不斷通風(fēng)和攪拌。本實(shí)驗(yàn)通過在10 L發(fā)酵罐中分別采用不同通氣量和不同攪拌轉(zhuǎn)速獲得不同溶氧水平,考察不同溶氧水平對紅曲菌w1夏生產(chǎn)橙色素的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同通氣量水平時(shí),底物消耗、pH值和DO的變化趨勢相似,但最終橙色素色價(jià)不同,基本上呈現(xiàn)出隨通氣量增加,色價(jià)呈現(xiàn)上升趨勢;攪拌轉(zhuǎn)速升高,色價(jià)也隨之升高,但漲幅不大;該結(jié)果同樣在50 L罐中得到驗(yàn)證。50 L罐采用所能設(shè)置的最大通氣量(1∶0.9)和200 r/min攪拌轉(zhuǎn)速,菌體生長和橙色素合成結(jié)果均達(dá)到10 L罐結(jié)果。50 L罐中橙色素色價(jià)達(dá)到347 U/mL,遠(yuǎn)超過目前文獻(xiàn)上報(bào)道的液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)紅曲色素的色價(jià)123.8 U/mL[22]和170.6 U/mL[23]。

4 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明,在紅曲橙色素生產(chǎn)時(shí),溶氧是關(guān)鍵影響因素之一,而提高溶氧的措施就是提高攪拌轉(zhuǎn)速和增加通氣量。應(yīng)盡可能在不影響菌體生長的前提下采用高的通氣量和適宜的攪拌轉(zhuǎn)速。較高的通氣量和適宜的攪拌轉(zhuǎn)速可以達(dá)到較高的溶氧水平,以利于菌體生長和橙色素合成。影響紅曲橙色素生物合成的培養(yǎng)條件很多,除溶氧外,發(fā)酵液的pH值控制、溫度控制以及補(bǔ)料策略等都會對菌體生長和色素形成產(chǎn)生影響。隨著色素工業(yè)化生產(chǎn)的要求的不斷提高,可以在溶氧條件的基礎(chǔ)上更科學(xué)的優(yōu)化其他發(fā)酵條件,將橙色素色價(jià)不斷提高。

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Effects of Dissolved Oxygen on Biosynthesis of Orange Pigments in Monascus Fermentation

ZHANG Huijuan1, ZHU Xiaogang2, MAO Peng3, NIU Guoqiang3, ZHAO Jie2, XU Ganrong3,*

(1.Shenzhen Main Luck Pharmaceuticals Inc.,Shenzhen,518029,China;2.Liangshan Chia Tai Ling Hua Bio-Tech Co.Ltd.,Jining 272600,China;3.School of Biotechnology,Jiangnan University,Wuxi 214122,China)

Effect of dissolved oxygen(DO)on the biosynthesis of orange pigments in Monascus fermentation was investigated in this study.The orange pigments production of the w1 Xia strain in a 10 L bioreactor under different DO levels obtained using different ventilatory volumes and stirring speeds were studied.And the optimized conditions were applied in a 50 L bioreactor.The results showed that the changing trend of substrate consumption,pH,and DO was similar under different ventilatory volume conditions,but the color value of orange pigments increased along with the ventilatory volume augment.The stirring speed did not have significantly effects on the biomass and color value of orange pigments.Meanwhile,the orange pigments production in a 50 L bioreactor was similar to that in a bioreactor.In conclusion,the higher ventilatory volume and adapted stirring speed were beneficial to the biomass and orange pigments production.

Monascus;orange pigment;fermentation conditions;color value;dissolved oxygen

TS202;Q815

A

(責(zé)任編輯:葉紅波)

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.06.012

2095-6002(2015)06-0072-06

張慧娟,朱效剛,毛鵬,等.溶氧對紅曲菌發(fā)酵生物合成橙色素的影響[J].食品科學(xué)技術(shù)學(xué)報(bào),2015,33(6):72-77.

ZHANG Huijuan,ZHU Xiaogang,MAO Peng,et al.Effects of dissolved oxygen on biosynthesis of orange pigments in Monascus fermentation[J].Journal of Food Science and Technology,2015,33(6):72-77.

2015-04-17

“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2011BAD23B02)。

張慧娟,女,工程師,碩士,主要從事發(fā)酵工程方面的研究;

*許贛榮,男,教授,主要從事微生物發(fā)酵方面的研究。通信作者。