張 美, 李 慶, 李一林, 楊 帆, 張馨予, 楊 芳,*

(1.武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室/化工與制藥學院,湖北武漢 430073;2.湖北大學知行學院,湖北武漢 430011)

米渣營養(yǎng)成分測定及其蛋白質提取工藝優(yōu)化

張 美1, 李 慶2, 李一林2, 楊 帆2, 張馨予2, 楊 芳1,*

(1.武漢工程大學綠色化工過程省部共建教育部重點實驗室/化工與制藥學院,湖北武漢 430073;2.湖北大學知行學院,湖北武漢 430011)

以大米為對照,測定了米渣的營養(yǎng)成分,并對堿溶酶解法提取米渣蛋白質的工藝進行優(yōu)化。以蛋白質提取率為指標,首先通過單因素實驗確定提取條件,然后采用正交試驗設計優(yōu)化堿溶工藝和酶解工藝,并分別采用線性模型和二次多項式模型進行回歸擬合。實驗結果顯示,米渣蛋白質提取條件為米渣粗粉質量與堿溶液體積的比例是1∶12 g/mL,堿溶pH值為12.5,米渣粗蛋白質量與堿溶液體積的比例是1∶10 g/mL,酶解pH值為10.0,堿性蛋白酶的w(酶)為2.0%,在此最優(yōu)條件下,蛋白質的提取率可達21.35%。二次多項式擬合方程式能很好地擬合堿溶酶解法提取米渣蛋白質的過程,決定系數R2=1.000。

米渣;營養(yǎng)成分;米蛋白;堿溶;酶解;堿性蛋白酶

米渣是大米提取糖漿后的殘留物,作為大米糖化后的副產品,其增值利用問題一直是企業(yè)難以解決的問題。目前米渣主要用作飼料原料,但由于出售價格低,經濟效益不太明顯。米渣中蛋白質含量一般在40%～65%。因此,將大米米渣作為良好的蛋白質資源,開發(fā)為優(yōu)質的食用蛋白質,不失為一條經濟有效的途徑[1-3]。大米中的蛋白質具有高營養(yǎng)、低過敏性、風味溫和、不會引起腸胃脹氣等獨特性質,含有機體所需的必需氨基酸,在糧食作物中占第一位,且具有良好的氨基酸組成配比,其賴氨酸含量高于其他谷類[4]。大米蛋白質的品質被公認為糧食種子蛋白中的上佳者,在食品中的應用前景極為廣闊[5-6]。

目前,大米中蛋白質的提取和應用研究主要集中在原料大米和米糠蛋白質的提取和應用。近年來,米渣中蛋白質的提取也開始受到重視。國內外研究提取大米蛋白的方法很多,如堿法、酶法、復合法以及排雜法等[7]。堿法提取是利用稀堿對大分子的米谷蛋白的降解作用,從而使大米淀粉顆粒中的蛋白質溶出而被分離。超過80%的大米蛋白質為堿溶性米谷蛋白,因此該方法提取效率高且工藝簡單。但是,該方法用堿量大,并且提取時所需的固液比大、純度不高,未達到食品級蛋白的要求,還會引起蛋白性質變化,破壞氨基酸結構,降低蛋白的營養(yǎng)價值,甚至形成有毒物質,損壞腎臟功能。酶法提取利用蛋白酶對米渣蛋白質的水解,使米渣蛋白質的溶解性提高,從而達到與米渣中雜質分離的目的。酶法提取米渣蛋白質條件溫和,能耗比較低,提取出的蛋白質的性質有很大的改善,水溶性提高、無異味,而且蛋白質多肽鏈可水解為短肽鏈,從而提高蛋白質溶解性;并且在酶的有限水解下能產生某些具有生物活性的功能性肽。但是,酶法提取米渣蛋白質的提取率偏低、酶的價格高、生產成本大,不能作為米渣蛋白提取的有效手段。復合法提取采用“堿酶兩步法”提取米渣中的蛋白質,效果較好。排雜法提取則是盡量把各種非蛋白成分除去,最終獲得高純度的米渣蛋白。然后通過冷凍干燥得到產品,其色澤和品質都有很大的提高,基本達到食品級蛋白質的要求。但是,由于纖維素酶和淀粉酶的使用使提取成本有所提高。

本文將堿法和酶法結合起來,采用堿溶酶解兩步提取法,既提高了蛋白質提取率又避免了由于堿液濃度過高引起的蛋白質變性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

米渣由武漢市佳寶糖業(yè)有限公司提供;鄂中5號大米購于武漢市場。

食用級堿性蛋白酶購于南寧龐博生物工程有限公司,酶活力為1.0×105U/g。鹽酸,乙酸鋅,亞鐵氰化鉀,酒石酸銅,酪蛋白,硫酸銅,亞甲藍,氫氧化鈉,葡萄糖,蒽酮,無水乙醚,硫酸鉀,硫酸,硼酸,無水乙醇均為分析純。

1.2 儀器與設備

FA1104型分析天平,上海精科天平有限公司;DHG-9075A型恒溫鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司;4-10型馬福爐,上海儀器公司;FW80型萬能粉碎機,天津市泰斯特儀器有限公司;索氏抽提器,蜀牛實驗儀器有限公司;WFJ 7200型紫外可見光分光光度計,龍尼柯(上海)儀器有限公司;SHA-B型雙功能水浴恒溫振蕩器,常州國華電器有限公司;TDL-5-A型低速臺式大容量離心機,上海安亭科學儀器廠;DLL-1型電子萬用爐,浙江上虞市通州實驗儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 原料預處理

將米渣和對照米樣(鄂中5號大米)粉碎,過40目篩,得米渣粗粉,封裝,備用。

1.3.2 米渣營養(yǎng)成分分析

水分含量的測定采用直接干燥法[8]?；曳值臏y定采用GB 5009.4方法[9]。蛋白質的測定采用半微量凱氏定氮法[10]。脂肪的測定采用索氏抽提法[11]。淀粉的測定采用酶水解法[12]。

1.3.3 米渣蛋白質提取

1.3.3.1 米渣蛋白質等電點測定

稱取一定質量米渣粗粉,按堿溶固液比1∶12 g/mL(即米渣粗粉質量與堿液體積的比例)加堿液,攪拌均勻,制成勻漿。調節(jié)其pH值為12.0,在50℃的水浴中緩慢攪拌2 h,離心(10 000 r/min,15 min),取上清液,即得到米渣蛋白粗提液。將其pH值調節(jié)為2.5,3.0,3.5,4.0,4.5,5.0以及5.5,靜置2 h,離心(10 000 r/min,15 min),棄上清,105℃烘干至恒重,計算m(蛋白質),m(蛋白質)最大的pH值為米渣蛋白質的等電點。

1.3.3.2 米渣蛋白質提取工藝流程

堿溶工藝是稱取一定質量的米渣粗粉,按一定固液比(即米渣粗粉質量與堿液體積的比例,g/mL)加堿液,攪拌均勻,制成勻漿,調節(jié)其pH值,在50℃的水浴中緩慢攪拌2 h,于10 000 r/min離心15 min,取上清,即得到米渣蛋白粗提液。調節(jié)其pH值至米渣蛋白質等電點,靜置2 h,于10 000 r/min離心15 min,取沉淀,干燥,即得米渣粗蛋白質。

酶解工藝是取上述米渣粗蛋白質,按一定固液比(即米渣粗蛋白質量與堿液體積的比例,g/mL)加堿液,攪拌均勻,調節(jié)其pH值,加入一定濃度的堿性蛋白酶,在40℃恒溫水浴鍋中慢速攪拌2 h,于10 000 r/min離心15 min,取上清,調節(jié)pH值至等電點,靜置2 h,于10 000 r/min離心15 min,取沉淀,干燥,即得米渣蛋白質。

1.3.4 蛋白質測定及提取率計算

提取液中蛋白質含量采用雙縮脲法測定[13],原料中蛋白質含量采用半微量凱氏定氮法測定[10],蛋白質換算系數取6.25,蛋白質提取率按式(1)計算。

1.3.5 堿溶工藝優(yōu)化

各取1.3.1節(jié)中制得的米渣粗粉5.0 g,按照1.3.3.2節(jié)中的堿溶步驟提取蛋白質,以蛋白質提取率為指標,考察堿溶固液比和堿溶pH值對蛋白質提取率的影響以確定提取條件,每組做3個平行。

1.3.5.1 堿溶固液比對蛋白質提取率的影響

在堿溶pH值為10.0、溫度50℃以及提取時間2 h的條件下,考察堿溶固液比1∶6,1∶8,1∶10,1∶12以及1∶14 g/mL對米渣蛋白提取率的影響。

1.3.5.2 堿溶pH值對蛋白質提取率的影響

在堿溶固液比為1∶12 g/mL、溫度50℃以及提取時間2 h的條件下,考察堿溶pH值11.5,12.0,12.5,13.0,13.5對米渣蛋白提取率的影響。

1.3.5.3 堿溶工藝條件正交試驗設計

根據單因素實驗,確定米渣中蛋白質提取工藝中的堿溶固液比和堿溶pH值的水平取值范圍,選取L9(32)做正交實驗設計,以蛋白質提取率作為評價指標,以確定堿溶工藝的最佳參數。

1.3.6 酶解工藝優(yōu)化

取1.3.1節(jié)中制得的米渣粗粉各5.0 g,按照1.3.3.2節(jié)中的酶解步驟提取蛋白質,以蛋白質提取率為指標,考察酶解固液比、酶解pH值以及堿性蛋白酶添加量對蛋白質提取率的影響以確定提取條件,每組做3個平行。

1.3.6.1 酶解固液比對蛋白質提取率的影響

在酶解pH值為10.0、ω(酶)=1.0%(即加入堿性蛋白酶的質量與米渣樣品的比例)、溫度50℃以及提取時間2h的條件下,考察固液比1∶6,1∶8,1∶10,1∶12,1∶14 g/mL對米渣蛋白提取率的影響。

1.3.6.2 酶解pH值對蛋白質提取率的影響

在酶解固液比為1∶10 g/mL、加酶量為1.0%、溫度50℃以及提取時間2 h的條件下,考察pH值9.0,9.5,10.0,10.5以及11.0對米渣蛋白提取率的影響。

1.3.6.3 堿性蛋白酶添加量對蛋白質提取率的影響

在固液比為1∶10 g/mL、酶解pH值為10.0、溫度50℃以及提取時間2 h的條件下,考察加酶量0.5%,1.0%,1.5%,2.0%以及2.5%對米渣蛋白提取率的影響。

1.3.6.4 酶解工藝條件正交試驗設計

根據單因素實驗,確定米渣中蛋白質提取工藝中的酶解固液比、酶解pH值以及堿性蛋白酶添加量的水平取值范圍,選取L9(33)做正交實驗設計,以蛋白質提取率作為評價指標,以確定酶解工藝的最佳參數。

1.3.7 數據分析

每個樣品重復測定3次,取平均值。采用SPSS 20統(tǒng)計軟件對實驗數據進行方差分析、Duncan多重比較分析以及線性模型和二次多項式模型擬合。采用Sigmaplot 11.0進行繪圖。

2 結果與討論

2.1 米渣營養(yǎng)成分的分析

按1.3.2節(jié)方法和條件對米渣和大米的營養(yǎng)成分進行分析,結果見表1。

表1 米渣和大米的基礎營養(yǎng)成分Tab.1 Primary nutrient components of rice residue and rice

由表1可以看出,米渣淀粉質量分數顯著低于大米淀粉質量分數(p＜0.05),這是因為生產糖漿的過程中,淀粉分解造成的。由于大米生產糖漿過程中,淀粉大量消耗,因此,米渣中其他組分(灰分、蛋白質以及脂肪)含量均顯著提高(p＜0.05)。新鮮米渣的水分含量較高(大于10%)[3],顯著高于本實驗中米渣樣品的水分含量(p＜0.05)。米渣中蛋白質含量較高,一般在40%～65%,而且大米蛋白質具有高營養(yǎng)、低過敏性以及良好的氨基酸組成配比等優(yōu)點,因此,作為大米生產糖漿的副產物,米渣也可作為良好的蛋白質資源,開發(fā)為優(yōu)質的食用蛋白質[1]。

2.2 米渣蛋白質等電點

pH值對蛋白質溶解度的影響很大,當pH值到達某一值時,蛋白質溶解度最小,沉淀量最大,這個值即為蛋白質的等電點[14]。本實驗中的米渣蛋白質樣品的等電點為3.9。

2.3 堿溶工藝優(yōu)化實驗

2.3.1 堿溶工藝單因素實驗

按1.3.5節(jié)條件對米渣蛋白提取堿溶工藝進行單因素實驗,結果見圖1。

由圖1(a)可以看出,在堿溶工藝中,米渣蛋白質提取率隨米渣和水的固液比的增大而增加。當固液比在1∶6 g/mL到1∶12 g/mL之間時,米渣蛋白質的提取率隨著固液比的提高而顯著升高(p＜0.05);而固液比為1∶12 g/mL和1∶14 g/mL時的米渣蛋白質提取率沒有顯著差異(p＞0.05)。然而,固液比過大在生產中會增加原料運輸壓力,因此,綜合考慮,選取最佳固液比為1∶10 g/mL。由圖1(b)可以看出,米渣蛋白質提取率隨堿溶pH值的增大而升高,但是,由于堿度過高會導致蛋白質變性,淀粉又易糊化,而且米渣蛋白質的色澤會受到影響而變黃。所以,綜合考慮,選取最佳堿溶pH值為12.5。

圖1 堿溶工藝單因素條件對蛋白質提取率的影響Fig.1 Effect of single factor on extraction rate of protein by alkali dissolution process

2.3.2 堿溶工藝正交試驗設計

以堿溶pH值和堿溶固液比這2個因素進行正交試驗設計,因素水平表見表2,實驗結果及分析見表3。

表2 堿溶工藝正交試驗因素水平表Tab.2 Facts and levels of orthogonal experiment about alkali dissolution process

由表2和表3可以看出,各因素對米渣蛋白提取率的影響大小依次為A(堿溶pH值)＞B(堿溶固液比)。堿溶工藝提取米渣中蛋白質的最優(yōu)水平組合為A2B3,即最佳酶解條件為:堿溶固液比1∶12;堿溶pH值12.5。在上述最佳堿溶條件下,米渣中蛋白質提取率達20.28%,且蛋白質提取物顏色為淺白色。

2.3.3 堿溶工藝驗證實驗

為了驗證堿溶正交試驗的可靠性,稱取5.0 g米渣粗粉3份,按最優(yōu)條件安排3次驗證實驗,3次的提取率分別為20.58%,20.10%,20.01%,平均蛋白質提取率為(20.23±0.31)%。結果表明,實際提取率與正交試驗結果沒有顯著差異(p＞0.05)。

表3 堿溶工藝正交試驗結果分析表Tab.3 Analysis of orthogonal experiment results about alkali dissolution process

2.4 酶解工藝優(yōu)化實驗

2.4.1 酶解工藝單因素實驗

按1.3.6節(jié)條件對米渣蛋白提取酶解工藝進行單因素實驗,結果見圖2。

圖2 酶解工藝單因素條件對蛋白質提取率的影響Fig.2 Effect of single factor on extraction rate of protein by enzymatic hydrolysis process

由圖2(a)可以看出,在酶解工藝中,米渣蛋白質提取率隨固液比的增大而顯著增加(p＜0.05)。當固液比在1∶6 g/mL到1∶12 g/mL之間時,米渣蛋白質的提取率顯著升高(p＜0.05);而在固液比為1∶12 g/mL和1∶14 g/mL時的米渣蛋白質的提取率沒有顯著差異(p＞0.05),然而,固液比過大在生產中會增加原料運輸壓力,因此,綜合考慮,選取最佳固液比為1∶10 g/mL。

由圖2(b)可以看出,在pH值9.0～11.0,米渣蛋白質提取率隨酶解pH值的增大先升高后降低,當pH值為10.5時,提取率達到最大值。當pH值繼續(xù)提高時,提取率顯著下降(p＜0.05)。但是,由于堿度過高會導致蛋白質變性,影響蛋白質顏色,所以,綜合考慮,選取最佳酶解pH值為10.0。

堿性蛋白酶適度水解,可進一步從米渣中提取蛋白質[15]。由圖2(c)可以看出,米渣蛋白質提取率隨堿性蛋白酶用量的增大而顯著增加(p＜0.05)。當堿性蛋白酶用量大于2.0%時,提取率沒有顯著變化(p＞0.05)。這可能是因為酶用量過大導致蛋白質過度水解的原因;另一方面考慮到酶的成本問題,因此選擇加酶量為1.5%。本實驗結果顯示,堿溶蛋白質顏色為淺白色,酶解提取的蛋白質顏色略深,呈灰白色,過度水解則顏色更深。

2.4.2 酶解工藝正交試驗設計

以酶解固液比、酶解pH值以及加酶量這3個因素進行正交試驗設計,因素水平表見表4,實驗結果及分析見表5。

表4 酶解工藝正交試驗因素水平表Tab.4 Facts and levels of orthogonal experiment about enzymatic hydrolysis process

由表5可知,各因素對米渣蛋白質提取率的影響大小依次為C(加酶量)＞B(酶解pH值)＞A(酶解固液比)。米渣蛋白質提取的酶解工藝中,最優(yōu)水平組合為A2B2C3,即最佳酶解條件為:酶解固液比1∶10 g/mL;酶解pH值10.0;加酶量2.0%。在上述最佳酶解條件下,米渣蛋白質提取率為21.35%。

表5 酶解正交試驗結果分析表Tab.5 Analysis of orthogonal experiment results about enzymatic hydrolysis process

2.4.3 酶解工藝驗證實驗

為了驗證酶解正交試驗的可靠性,稱取5.0g米渣粗粉3份,按最優(yōu)條件安排3次驗證實驗,3次的提取率分別為21.11%,21.50%和21.28%,平均蛋白質提取率為(21.30±0.20)%。結果表明,實際提取率與酶解正交試驗結果沒有顯著差異(p＞0.05)。

2.4.4 酶解工藝模型建立與比較

采用SPSS 2.0數據處理軟件對表5結果進行線性模型回歸分析和二次多項式模型回歸分析。線性模型擬合方程式為:Y=-7.59-0.49X1+1.77X2+7.19X3。模型相關系數R=0.932,顯著水平P=0.012,決定系數R2=0.869,由表5可以看出,實際測定值與線性模型計算值較為接近,說明該方程能較好地擬合米渣蛋白酶解提取工藝過程。

3 結 論

本實驗結果表明,米渣蛋白質含量較高(65.76%),是一種很好的食用蛋白質來源。堿溶酶解法提取法是一種有效的提取米渣蛋白質的方法,最佳工藝為堿溶固液比1∶12 g/mL;堿溶pH值12.5;酶解固液比1∶10 g/mL;酶解pH值10.0;堿性蛋白酶加入量為2.0%。二次多項式擬合方程式能很好地擬合米渣蛋白質的堿溶酶解法提取過程。在最佳工藝條件下,米渣蛋白質的提取率可以達到21.35%。由于提取工藝簡單,堿溶酶解法提取法為食用米渣蛋白質的開發(fā)利用提供了一種可行的方法。

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Determination of Nutrient Components and Optimization of Protein Extraction Process of Rice Residue

ZHANG Mei1, LI Qing2, LI Yilin2, YANG Fan2, ZHANG Xinyu2, YANG Fang1,*
(1.Key Laboratory for Green Chemical Process of Ministry of Education/School of Chemical Engineering and Pharmacy,Wuhan Institute of Technology,Wuhan 430073,China;2.Zhixing College of Hubei University,Wuhan 430011,China)

Nutrient components of rice residue were determined using the rice as the control and rice residue protein extraction by the alkali dissolution enzymatic extraction process was explored.With protein extraction rate as the index,extraction conditions were determined by single factor test and the alkali dissolution enzymatic extraction process was optimized by orthogonal design.The linear model and the quadratic polynomial model were used to regression analysis.The experimental results showed that rice residue protein extraction conditions were alkali soluble solid-liquid ratio 1∶12(g/mL),alkali soluble pH 12.5,enzymolysis solid-liquid ratio 1∶10(g/mL),enzymolysis pH 10.0,and the alkaline protease amount of 2.0%.Under these optimum conditions,the protein extraction rate was 21.35%.Quadratic polynomial fitting equations could fit rice residue protein extraction process and the determination coefficient(R2)was 1.000.

rice residue;nutrient components;rice protein;alkali dissolution;enzymatic hydrolysis;alkali protease

TS210.9

A

(責任編輯:李 寧)

10.3969/j.issn.2095-6002.2015.06.011

2095-6002(2015)06-0065-07

張美,李慶,李一林,等.米渣營養(yǎng)成分測定及其蛋白質提取工藝優(yōu)化[J].食品科學技術學報,2015,33(6):65-71.

ZHANG Mei,LI Qing,LI Yilin,et al.Determination of nutrient components and optimization of protein extraction process of rice residue[J].Journal of Food Science and Technology,2015,33(6):65-71.

2014-12-09

湖北省高等學校大學生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓練計劃項目。

張 美,女,講師,碩士,主要從事食品加工方面的研究;

*楊 芳,女,副教授,博士,主要從事農產品加工方面的研究。通信作者。