俞海英 王松 郭銀燕 丁巧云 潘劍 張小玉 曹興國 楊永峰

·臨床與基礎(chǔ)研究·

外周血T淋巴細胞亞群變化與慢性丙型肝炎抗病毒應(yīng)答的相關(guān)性

俞海英 王松 郭銀燕 丁巧云 潘劍 張小玉 曹興國 楊永峰

目的探討慢性丙型肝炎（CHC）患者外周血T淋巴細胞亞群與臨床預(yù)后的相關(guān)性。方法采用流式細胞儀檢測34例CHC患者抗病毒治療前后及30例健康對照者CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量，CHC患者與健康人外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量差異及其抗病毒治療前后的變化，分析其在抗病毒療程及隨訪中的變化與臨床預(yù)后的相關(guān)性。結(jié)果CHC組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量均明顯低于健康對照組（P＜0.01）；CHC組抗病毒治療后出現(xiàn)病毒學(xué)應(yīng)答的患者外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量均明顯高于應(yīng)答不佳者（P＜0.01）；停用干擾素1年后沒有復(fù)發(fā)的患者CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)明顯高于復(fù)發(fā)的患者（P＜0.01），而CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)無明顯升高（P＞0.05）。結(jié)論檢測CHC患者外周血T淋巴細胞亞群變化可作為預(yù)測患者抗病毒應(yīng)答及應(yīng)答后復(fù)發(fā)的指標(biāo)之一。

T細胞亞群；慢性丙型肝炎；流式細胞術(shù)

慢性丙型肝炎（chronic hepatitis C，CHC）治療的目的是病毒清除，目前干擾素（IFN）加利巴韋林聯(lián)合抗病毒被應(yīng)用于CHC治療中；在此過程中，患者能否取得完全應(yīng)答及取得應(yīng)答后是否會復(fù)發(fā)，一直是臨床醫(yī)師關(guān)注的問題，與患者的切身利益也緊密相關(guān)。本文通過測定CHC患者抗病毒前后及隨訪中的外周血T淋巴細胞亞群數(shù)量變化，探討其與CHC患者抗病毒應(yīng)答及應(yīng)答后復(fù)發(fā)的關(guān)系。

資料和方法

一、病例選擇

選取東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院2008年1月至2012年12月門診和住院，且臨床資料完整的34例CHC患者作為研究對象，其中男20例，女14例，年齡29～58歲，平均（39.2±8.9）歲。入選條件：①明確診斷為CHC，排除其他嗜肝病毒重疊感染；②患者均為轉(zhuǎn)氨酶持續(xù)或反復(fù)異常超過6個月，2×正常值上限（ULN）≤ALT＜10×ULN，TBil＜2×ULN；③抗HCV與HCV RNA陽性均超過6個月；④排除遺傳代謝性疾?。ú檠恰⒀?、銅氧化酶）、自身免疫性疾病（查自身免疫抗體、甲狀腺功能）、藥物性肝炎（治療前無用藥史）及中毒性肝病（無發(fā)熱及毒物接觸史）。同時選取30例我院健康體檢者為對照組，性別、年齡構(gòu)成與CHC組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。診斷均符合2004年發(fā)布《丙型肝炎防治指南》及中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會、中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會頒布的2005版和2010版病毒性肝炎防治指南［1-3］。

二、標(biāo)本采集與測定

治療前所有患者采用美國雅培定量檢測HBV血清學(xué)標(biāo)志物，ELISA法檢測甲、丙、丁、戊型肝炎病毒以及EB病毒、巨細胞病毒標(biāo)志物，熒光PCR法定量檢測HCV RNA。全自動生物化學(xué)儀定期檢測肝功能、腎功能，常規(guī)檢測凝血功能及血常規(guī)。

三、淋巴細胞亞群的檢測儀器設(shè)備及試劑

流式細胞儀為美國BD公司的FACSCalibur型；EDTA.K2抗凝管為美國BD公司產(chǎn)品；CD4、CD8等各種熒光標(biāo)記單克隆抗體為美國Beckman Coulter公司產(chǎn)品。在含有已知數(shù)量標(biāo)準(zhǔn)微球的TruCOUNT管中加入20μL TriTEST CD4-FITC/CD8-PE/CD3-PerCP抗體和50μL抗凝血，充分混勻，室溫暗處反應(yīng)15 min后，加入450μL FACS溶血素，充分混勻，室溫暗處反應(yīng)15 min后24 h內(nèi)流式細胞儀FACScalibur進行分析，試劑及儀器均購自美國BD公司。用CaliBRITETM磁珠及FACSComp TM軟件校準(zhǔn)儀器，MultiSETTM軟件獲取數(shù)據(jù)并分析檢測結(jié)果，報告T細胞絕對值及各亞群百分率（%）。

四、治療方法

所有患者根據(jù)體重，予聚乙二醇干擾素（佩樂能80μg/支，默沙東公司）每周1次，皮下注射聯(lián)合利巴韋林≥10.6 mg/（kg·d），分3次口服，療程參照丙型肝炎防治指南執(zhí)行：①非基因1型HCV RNA低于檢測水平和肝功能正常，6個月停藥，如HCV RNA陽性，繼續(xù)治療，總療程12個月。②基因1型HCV RNA低于檢測水平和肝功能正常，12個月停藥，總療程12個月。

五、觀察指標(biāo)

IFN治療后HCV RNA無應(yīng)答定義：患者使用聚乙二醇干擾素α（Peg-IFN）6個月，HCV RNA較基線下降≤1.0×101IU/m L。HCV RNA＜5.0×102IU/ m L為陰轉(zhuǎn)；HCV RNA陰轉(zhuǎn)為有效。治療中HCV RNA陰轉(zhuǎn)后又陽轉(zhuǎn)為反彈；治療有效停藥后HCV RNA陽轉(zhuǎn)為復(fù)發(fā)。

六、統(tǒng)計學(xué)處理

將隨訪資料用Excel軟件建立數(shù)據(jù)庫，使用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件，計量資料采用F檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或u檢驗。

結(jié) 果

一、34例CHC患者治療前基因分型、HCV RNA、ALT及AST

基因1b型14例，Ic型2例；2a型4例，2b型4例；3a型3例，3b型1例；混合1b和2a型6例。基線HCV RNA定量（log）7.12±2.06 IU/m L，ALT134.28±75.26 IU/L，AST 67.47±44.65 IU/L。

二、CHC組與正常對照組CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)和百分數(shù)（見表1）

CHC組與正常對照組相比CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CD3+CD4+T淋巴細胞百分數(shù)明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

三、CHC組治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)和百分數(shù)（見表2）

IFN治療后CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CD3+CD8+T升高有統(tǒng)計學(xué)意義P＜0.05。

四、停藥后1年隨訪陰轉(zhuǎn)與復(fù)發(fā)患者外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量變化（見表3）

陰轉(zhuǎn)組CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)明顯升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）。復(fù)發(fā)組CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)有升高，差異有顯著統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；CD3+、CD3+CD4+T淋巴細胞絕對計數(shù)無明顯升高，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表1 各組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）和百分數(shù)變化（%±s）

表1 各組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）和百分數(shù)變化（%±s）

組別 正常對照組 慢性丙型肝炎組 t值 P值32 34 CD3+數(shù)量個/μL 1400.86±299.26 793.90±119.90 5.01 ＜0.01百分數(shù)% 78.37±13.61 69.7±10.11 2.91 ＜0.01 CD3+CD4+數(shù)量個/μL 715.65±106.20 396.90±62.10 6.93 ＜0.01百分數(shù)% 58.82±7.53 50.22±7.28 2.2 ＜0.05 CD3+CD8+數(shù)量個/μL 645.43±99.32 310.45±48.87 8.08 ＜0.01百分數(shù)% 30±4.68 27.91±4.07 1.29 ＞0.例數(shù)05

表2 治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）和百分數(shù)變化（%±s）

表2 治療前后外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）和百分數(shù)變化（%±s）

組別 治療前 治療后 t值P值34 34 CD3+數(shù)量個/μL 793.90±119.90 1235.57±142.10 6.37 ＜0.01百分數(shù)% 69.7±10.11 82.25±8.62 2.61 ＜0.01 CD3+CD4+數(shù)量個/μL 396.90±62.10 815.85±118.22 8.38 ＜0.01百分數(shù)% 50.22±7.28 58.82±6.65 2.34 ＜0.05 CD3+CD8+數(shù)量個/μl 310.45±48.87 371.21±52.42 2.28 ＜0.05百分數(shù)% 27.91±4.07 30.98±4.35 1.36 ＞0.例數(shù)05

表3 陰轉(zhuǎn)組與復(fù)發(fā)組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）

表3 陰轉(zhuǎn)組與復(fù)發(fā)組外周血CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞數(shù)量（個/μL±s）

CD3+CD4+CD3+CD8+CD3+88后855.24±128.69 492.50±64.09 522.41±74.23 205.25±28.03 1425.75±20.46 1155.00±195.67 t值 3.94 0.66 6.03 4.63 7.20 1.90 P值 ＜0.01 ＞0.05 ＜0.01 ＜0.01 ＜0.01 ＞0.陰轉(zhuǎn)組 復(fù)發(fā)組前625.00±88.36 470.12±62.83 311.44±57.06 294.00±43.56 1038.11±142.22 980.00±148.陰轉(zhuǎn)組 復(fù)發(fā)組 陰轉(zhuǎn)組 復(fù)發(fā)組05

討 論

本研究結(jié)果34例患者以基因1型為多，其次為基因2型、3型，混合型最少，不同基因型對IFN治療反應(yīng)不同，在一定意義上決定著丙型肝炎病毒感染不同的發(fā)展和結(jié)局，因此療程需個體化。外周血T淋巴細胞亞群的數(shù)量（CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T）是反映機體細胞免疫狀態(tài)的重要指標(biāo)，當(dāng)T淋巴細胞亞群的數(shù)量和功能發(fā)生異常時，可導(dǎo)致免疫功能紊亂而發(fā)生HCV感染［4］。本研究表明，在CHC患者中CD3+、CD3+CD4+及CD3+CD8+T淋巴細胞絕對計數(shù)較正常對照組明顯降低，與T細胞亞群的紊亂導(dǎo)致CD8+T細胞中的細胞毒T細胞（CTL）損傷肝細胞及CD8+T細胞中的Ts抑制CD4+T細胞，引起CD4+T輔助清除病毒能力下降有關(guān)，這兩方面互為因果，使機體參加免疫反應(yīng)的免疫活性細胞不足，發(fā)生HCV感染。在丙型肝炎發(fā)病中細胞免疫反應(yīng)起重要作用，CTL特異攻擊HCV感染的靶細胞，可引起肝細胞損傷［5］，而T細胞免疫紊亂如何在CHC的病理損傷中發(fā)揮作用則是一個復(fù)雜的過程［6］。慢性HCV感染的治療主要靠IFNα，其通過調(diào)節(jié)細胞免疫功能，改善機體的免疫狀態(tài)［7］，有利于CHC患者清除HCV，從而減輕肝臟組織炎癥及纖維化。Peg-IFN的使用提高了干擾素的療效，本研究中Peg-IFN治療后外周血總T淋巴細胞及CD4+、CD8+T細胞明顯高于治療前，與IFNα誘導(dǎo)T細胞產(chǎn)生淋巴因子，外周血T淋巴細胞及亞群CD4+、CD8+活化增多，CD4+T細胞與CD8+T細胞比例得到平衡，增強輔助性T細胞亞群1（Th1）細胞功能有關(guān)。CHC患者體內(nèi)亦存在針對HCV結(jié)構(gòu)蛋白及非結(jié)構(gòu)蛋白的CTL應(yīng)答，肝臟內(nèi)HCV特異性CTL應(yīng)答的頻率遠高于外周血循環(huán)的CTL應(yīng)答，提示肝臟內(nèi)CTL應(yīng)答在抵抗HCV感染中的重要作用。使用更精確的HCV抗原與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）I類分子四聚體相結(jié)合的體外直接分析法證明，CHC患者體內(nèi)CTL應(yīng)答為外周血CTL應(yīng)答的30倍，提示多數(shù)HCV特異性CD8+T細胞可聚集在肝內(nèi)發(fā)揮有效的抗HCV CTL應(yīng)答。有報道提示，CHC患者HCV含量與HCV特異性CTL應(yīng)答范圍及程度呈正相關(guān)。通過直接的細胞溶解或細胞因子介導(dǎo)的機制，有效的CTL應(yīng)答可導(dǎo)致病毒清除［8］。經(jīng)Peg-IFN治療后，外周血總T淋巴細胞及CD4+、CD8+T細胞明顯升高，對清除病毒起到積極作用。進一步觀察CHC患者外周血T淋巴細胞及亞群，發(fā)現(xiàn)停用IFN 1年后沒有復(fù)發(fā)的患者CD4+T細胞數(shù)明顯高于復(fù)發(fā)的患者，復(fù)發(fā)的患者治療后CD3+、CD3+CD4T淋巴細胞絕對計數(shù)無明顯升高，可能HCV特異性的CD4+應(yīng)答是保護宿主的重要部分，缺乏CD4+應(yīng)答時，HCV特異性的CTL記憶功能不能維持。CHC患者CD4+應(yīng)答常表現(xiàn)為緩慢、低下、而且短暫，低弱而持續(xù)的HCV CTL應(yīng)答不能有效清除HCV感染，但可導(dǎo)致持續(xù)的肝臟損傷。研究顯示，CHC患者體內(nèi)有效的HCV核心蛋白特異的CD4+應(yīng)答與肝臟損傷及疾病活動性的有效控制密切相關(guān)，HCV特異性CD4+應(yīng)答可能參與控制HCV感染。因此檢測CHC患者外周血T淋巴細胞亞群變化可作為預(yù)測患者抗病毒應(yīng)答及應(yīng)答后復(fù)發(fā)的指標(biāo)之一。

1 中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會、肝病學(xué)分會.病毒性肝炎防治方案.中華傳染病雜志，2001，19：56-62.

2 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會傳染病與寄生蟲病學(xué)分會.丙型肝炎防治指南.中華傳染病雜志，2004，22：131-136.

3 中華醫(yī)學(xué)會肝病學(xué)分會，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會，慢性乙型肝炎防治指南（2010年版）.中華傳染病雜志，2011，29：65-80.

4 周光炎.免疫學(xué)原理.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2007，251-252.

5 Stoop JN，Van der Modon RG，Kuipers EJ，et al.Inhibition of viral replication reduces regulatory T cells and enhances the antiviral immune response in chronic hepatitis.Virolong，2007，36：141-148.

6 權(quán)啟鎮(zhèn)，孫自勤，王要軍.新肝臟病學(xué).濟南：山東科學(xué)技術(shù)出版社，2002，200-201.

7 Samuel CE.Antiviral actions of interferons.Clin Microbiol Rev，2001，14：778-809.

2014-11-07）

（本文編輯：易玲）

210003 江蘇南京 東南大學(xué)附屬第二醫(yī)院肝病科

楊永峰，Email：yyf1997@163.com