柴松 安文婷 郭麗麗 姜樂 高志嵩 李書軍

長鏈非編碼RNA（long non-coding RNA, lnc RNA）是一類長度大于200個(gè)核苷酸的非編碼RNA，在人類全基因組中有20萬-40萬種不同的lnc RNA。研究[1]表明lnc RNA可以通過多種方式影響編碼基因的表達(dá)，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起調(diào)控作用。SPRY4內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄本1（SPRY4 intronic transcript 1, SPRY4-IT1）（基因號(hào)AK024556）是轉(zhuǎn)錄自SPRY4基因的第二個(gè)內(nèi)含子的長度為687個(gè)核苷酸的未剪接的、多聚腺苷酸化的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，最初在脂肪組織中得以鑒定，且過表達(dá)SPRY4-IT1在黑色素瘤中具有促進(jìn)細(xì)胞生長、遷移和侵襲的作用[2]，然而其在肺癌細(xì)胞中的作用尚未報(bào)道。本研究擬探討SPRY4-IT1對(duì)肺癌細(xì)胞A549侵襲和遷移能力的影響，并初步探索可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料 人肺癌細(xì)胞系A(chǔ)549、95C、95D、Calu-3、H125、H1299、H1975、SPC-A1由河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院腫瘤中心提供；抗基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase, MMP）-2抗體、抗MMP-9抗體均購自武漢博士德生物有限公司；Transwell（8 μm孔徑）小室及Matrigel膠購自北京樂博生物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)中所用引物由廣州銳博生物有限公司設(shè)計(jì)并合成，檢測(cè)SPRY4-IT1在肺癌A549細(xì)胞中的表達(dá)，RT-PCR上游引物為5'-AGCCACATAAATTCAGCAGA-3'，下游引物為5'-CGATGTAGTAGGATTCCTTT-CA-3'，GAPDH上游引物為: 5'-GACTCATGACCACAGTCCATGC-3'，GAPDH下游引物為: 5'-AGAGGCA-GGGATGATGTTCTG-3'。

1.2 基因全長序列克隆 根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫SPRY4-IT1標(biāo)準(zhǔn)序列NR-002196.1設(shè)計(jì)引物，上游引物5'-TAAGCTTGTAGAGATGGGGGTTTCATCCTGTTGG-3'，下游引物5'-ACTCGAGAAAGACTCCCTTTCCTTAAGCAGATTCAC-3’，循環(huán)條件：93oC預(yù)變性1 min，93oC變性30 s，65oC退火30 s，72oC延伸2 min，25個(gè)循環(huán)，72oC終末延伸5 min，產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳分離擴(kuò)增產(chǎn)物并進(jìn)行產(chǎn)物純化回收，將產(chǎn)物連接T載體后，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，通過藍(lán)白斑篩選，挑取白色克隆，擴(kuò)增后進(jìn)行酶切鑒定，同時(shí)送測(cè)序分析證實(shí)擴(kuò)增片段的正確性。

1.3 構(gòu)建真核表達(dá)載體 雙酶切pcDNA3.1載體和插入正確片段的T質(zhì)粒，分別純化回收目的片段。連接線性化pcDNA3.1載體和目的片段，轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌液PCR鑒定，并通過測(cè)序分析得到插入片段陽性克隆，命名為pcDNA3.1-SPRY4-IT1表達(dá)載體。用無內(nèi)毒素試劑盒大量制備質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞培養(yǎng)和細(xì)胞轉(zhuǎn)染[3]使用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液，在37oC、含5%CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)中用到的肺癌細(xì)胞系。細(xì)胞生長融合度達(dá)到50%時(shí)，用Lipo 2000進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，分為轉(zhuǎn)染空載體pcDNA3.1組和轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1表達(dá)載體組。

1.5 RT-PCR檢測(cè)肺癌細(xì)胞中SPRY4-IT1的表達(dá) 培養(yǎng)肺癌細(xì)胞，細(xì)胞生長融合度打70%時(shí)收集細(xì)胞，通過Trizol法提取細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，應(yīng)用上述RT-PCR引物擴(kuò)增SPRY4-IT1，ABI7300檢測(cè)并分析各細(xì)胞中SPRY4-IT1的水平。

1.6 細(xì)胞劃痕遷移實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，按照上述實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染48 h后，細(xì)胞融合度達(dá)到90%以上，用無菌移液槍頭部劃線，置于37oC、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后光學(xué)顯微鏡下拍照，隨即取5個(gè)視野，測(cè)量劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn) 將A549細(xì)胞以每孔5×105個(gè)接種于6孔板中，細(xì)胞生長融合度為60%時(shí)按照上述實(shí)驗(yàn)分組轉(zhuǎn)染空載體和pcDNA3.1-SPRY4-IT1過表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染24 h后收集轉(zhuǎn)染后的各組細(xì)胞，重懸于無血清RPMI-1640培養(yǎng)液，以每孔5×104個(gè)細(xì)胞加入預(yù)鋪好Matrigel的Transwell小室上室內(nèi)，下室加入500 μL完全培養(yǎng)液，置于37oC、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后多聚甲醛固定，0.05%結(jié)晶紫染色，400倍光學(xué)顯微鏡下計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)，隨即取10個(gè)視野，取平均值，每組實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 免疫印跡實(shí)驗(yàn)[4]收集細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)后的各組細(xì)胞，用胰酶消化并收集，用含有蛋白酶抑制劑的RIPA裂解細(xì)胞，置于冰上，每5分鐘震搖細(xì)胞1次，共裂解30 min，15,000 rpm在4oC離心機(jī)上離心15 min，取上清，即為提取的細(xì)胞蛋白質(zhì)。通過BCA法檢測(cè)蛋白濃度，水浴變性蛋白，加入5×SDS-PAGE上樣緩沖液，加樣等量蛋白的蛋白裂解液，用10%的SDS-PAGE膠進(jìn)行電泳分離，電轉(zhuǎn)印到尼龍膜上，用5%脫脂牛奶的PBS緩沖液室溫封閉1 h，一抗用1:1,000稀釋的抗人MMP-2、MMP-9單克隆抗體4oC過夜孵育，用PBS-Tween洗膜，室溫每次15 min，共3次；印跡膜用1:3,000的抗鼠IgG偶聯(lián)的辣根過氧化物酶作為二抗，室溫孵育1 h，用PBS-Tween洗膜，室溫每次15 min，共3次。用增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光液檢測(cè)試劑盒化學(xué)發(fā)光顯色。檢測(cè)細(xì)胞中MMP-2、MMP-9的表達(dá)，以β-actin作為內(nèi)參照，結(jié)果進(jìn)行灰度值分析并通過統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)分析軟件，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（Mean±SD）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1真核表達(dá)載體構(gòu)建 以cDNA為模板，用引物擴(kuò)增目的片段，得到與預(yù)期片段大小相符的特異性片段（圖1A）。切膠純化回收目的片段，并與pGEMTeasy載體連接，插入目的片段后，通過酶切鑒定和測(cè)序分析證實(shí)插入片段的正確性（圖1B，圖1C）。將目的片段SPRY4-IT1與pGEM-Teasy載體連接后的重組體經(jīng)BamH I+Hind III雙酶切，與相同雙酶切線性化的pcDNA3.1載體連接，得到完整的pcDNA3.1-SPRY4-IT1表達(dá)載體，通過BamH I+Hind III酶切鑒定和測(cè)序分析（圖1D，圖1E），確認(rèn)載體構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中SPRY4-IT1表達(dá)，結(jié)果提示轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1的細(xì)胞中SPRY4-IT1表達(dá)量是轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒的32.7倍（圖2）。

圖1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1真核表達(dá)載體構(gòu)建情況。A：目的片段擴(kuò)增產(chǎn)物；B：目的片段與T載體連接后酶切鑒定結(jié)果；C：目的片段與T載體連接后測(cè)序結(jié)果；D：目的片段與pcDNA3.1載體連接后酶切鑒定結(jié)果；E：目的片段與pcDNA3.1載體連接后測(cè)序結(jié)果。Fig 1 pcDNA3.1-SPRY4-IT1 eukaryotic expression vector construction. A: Amplification products of target fragment; B: Enzyme digestion identification results of target fragment and T vector; C: Sequencing results of target fragment and T vector; D: Enzyme digestion identification results of target fragment and pcDNA3.1 vector; E: Sequencing results of target fragment and pcDNA3.1 vector.

圖2 將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空質(zhì)粒pcDNA3.1轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后，檢測(cè)細(xì)胞中SPRY4-IT1表達(dá)。A：目的基因溶解曲線；B：目的基因擴(kuò)增曲線；C：SPRY4-IT1在細(xì)胞中表達(dá)水平比較。Fig 2 The expression of SPRY4-IT1 in pcDNA3.1-SPRY4-IT1 and pcDNA3.1 A549 cells. A：Dissolution curve of target gene; B: Amplification curve of target gene; C: The expression of SPRY4-IT1 in different cells.

圖3 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果。A：培養(yǎng)24 h后兩組細(xì)胞遷移結(jié)果的比較（×400）；B：24 h后兩組細(xì)胞遷移距離比較。Fig 3 Cell scratch test results. A: Cell migration results of two groups (×400); B: Cell migration spaces of two groups.

圖 4 細(xì)胞Transwell小室結(jié)果。A：顯微鏡下兩組細(xì)胞穿過Transwell小室基底膜結(jié)果（×400）；B：兩組細(xì)胞穿過基底膜細(xì)胞數(shù)目比較。Fig 4 Transwell assay results. A: Cells through the basement membrane results of two groups (×400); B: The numbers of transmembrane A549 cells of two groups.

2.2 SPRY4-IT1對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響 將A549細(xì)胞接種于6孔板，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1和空載體pcDNA3.1，24 h后結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1細(xì)胞劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1細(xì)胞明顯變窄（圖3），提示A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后細(xì)胞的遷移能力增強(qiáng)。

2.3 SPRY4-IT1對(duì)細(xì)胞侵襲能力的影響 A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后其穿膜細(xì)胞數(shù)為（207±34）個(gè)/視野，對(duì)照組為（83±15）個(gè)/視野，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（圖4）。表明A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后細(xì)胞的侵襲能力增強(qiáng)。

2.4 SPRY4-IT1對(duì)MMP-2和MMP-9蛋白的影響 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1細(xì)胞中的MMP-2及MMP-9蛋白表達(dá)較轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒組均有升高（圖5）。

圖 5 過表達(dá)SPRY4-IT1對(duì)MMP-2和MMP-9的影響Fig 5 Effect of overexpression of SPRY4-IT1 on matrix metalloproteinase (MMP)-2 and MMP-9

3 討論

在人類基因組中除了編碼基因外，同時(shí)包含大量的非編碼RNAs（non-coding RNAs, ncRNAs）[5]。ncRNAs雖不具備編碼蛋白質(zhì)功能，但能通過不同方式調(diào)控編碼基因的表達(dá)和功能，lncRNA與多種類型的腫瘤發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系，已成為近年來的研究熱點(diǎn)之一[1]。這類ncRNAs既可以通過影響蛋白翻譯發(fā)揮轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，也可以通過影響基因的轉(zhuǎn)錄活性及蛋白降解等多種途徑發(fā)揮功能。

SPRY4-IT1是由SPRY4基因的一個(gè)內(nèi)含子轉(zhuǎn)錄而來，其內(nèi)部含有多個(gè)二級(jí)發(fā)卡結(jié)構(gòu)，已有研究表明SPRY4-IT1在黑色素瘤細(xì)胞中過表達(dá)，并且參與調(diào)控黑色素瘤細(xì)胞的凋亡與遷移[2]。有關(guān)SPRY4-IT1在肺癌中的研究尚未見報(bào)道，為了更深入地探討SPRY4-IT1基因在肺癌細(xì)胞中的作用，本研究克隆了SPRY4-IT1基因，并構(gòu)建了SPRY4-IT1真核表達(dá)載體，用脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)原本在A549細(xì)胞中表達(dá)量很低的SPRY4-IT1，在轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后，表達(dá)量升高了25倍（與轉(zhuǎn)染空載體相比較），能夠滿足進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)需要。

肺癌細(xì)胞最重要的惡性行為即具有高度的侵襲轉(zhuǎn)移能力[6-8]，因此我們?cè)诜伟〢549細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1重組質(zhì)粒，觀察SPRY4-IT1對(duì)肺癌細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。我們的研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1細(xì)胞劃痕兩側(cè)細(xì)胞間距較轉(zhuǎn)染pcDNA3.1細(xì)胞明顯變窄，A549細(xì)胞轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-SPRY4-IT1后其穿膜細(xì)胞數(shù)為（207±34）個(gè)/視野，對(duì)照組為（83±15）個(gè)/視野，組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），可見通過細(xì)胞劃痕運(yùn)動(dòng)實(shí)驗(yàn)和Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)均證實(shí)過表達(dá)SPRY4-IT1后可以明顯增加A549細(xì)胞的侵襲、遷移能力，提示SPRY4-IT1有可能與肺癌細(xì)胞的侵襲遷移相關(guān)。MMP-2和MMP-9是目前公認(rèn)的調(diào)控腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵因子[9-11]，為了進(jìn)一步研究SPRY4-IT1對(duì)肺癌A549細(xì)胞侵襲遷移能力改變的作用機(jī)制，我們通過Western blot檢測(cè)其中MMP-2及MMP-9的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在肺癌A549細(xì)胞中過表達(dá)SPRY4-IT1可以顯著增加MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)。

綜上所述，在肺癌A549細(xì)胞中過表達(dá)SPRY4-IT1可增強(qiáng)細(xì)胞的侵襲、遷移能力；同時(shí)過表達(dá)SPRY4-IT1后MMP-2及MMP-9呈升高趨勢(shì)，提示SPRY4-IT1可能通過對(duì)調(diào)控MMP影響肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移能力?？梢奡PRY4-IT1在肺癌的侵襲轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用，為肺癌的臨床治療提供了新的藥物靶點(diǎn)及監(jiān)測(cè)指標(biāo)。