李　響，丁　珍，吳義霞，陳雪妍，劉國(guó)良，謝　林

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

ELOVL2基因多態(tài)性與乳母乳汁DHA水平的關(guān)聯(lián)性分析

李響1，丁珍1，吳義霞1，陳雪妍1，劉國(guó)良2，謝林1

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院營(yíng)養(yǎng)與食品衛(wèi)生教研室，吉林 長(zhǎng)春 130021；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院預(yù)防醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的:探討ELOVL脂肪酸延長(zhǎng)酶基因2(ELOVL2) rs2281591和rs3798713位點(diǎn)與乳母乳汁二十二碳六烯酸(DHA)水平的關(guān)系，闡明ELOVL2基因多態(tài)性對(duì)乳汁DHA水平的影響。方法:選取健康產(chǎn)婦209人，在產(chǎn)后第22～25天簽署知情同意書并進(jìn)行三天二十四小時(shí)膳食回顧調(diào)查，收取乳汁20 mL，應(yīng)用氣相色譜法檢測(cè)乳汁DHA水平，并提取乳汁基因組DNA，應(yīng)用Sequenom Mass Array 系統(tǒng)檢測(cè)ELOVL2基因2個(gè)單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點(diǎn)基因型，采用UNPHASED 3.012遺傳學(xué)軟件進(jìn)行多位點(diǎn)單倍型與乳汁DHA水平的數(shù)量性狀分析。結(jié)果:ELOVL2基因rs2281591和rs3798713位點(diǎn)基因型頻數(shù)分布均符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)；不同基因型的乳母膳食脂肪酸攝入量和乳汁DHA水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；不同rs3798713(CG) -rs2281591(AG)單倍型的乳母乳汁DHA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.422，df=5,P=0.635)。結(jié)論:ELOVL2基因rs3798713和rs2281591位點(diǎn)及其組成的單倍型與乳母乳汁DHA水平無(wú)關(guān)聯(lián)。

基因多態(tài)性；單倍型；ELOVL2基因；乳汁；二十二碳六烯酸

哺乳期婦女膳食脂肪酸的攝入量除影響自身脂肪酸營(yíng)養(yǎng)狀況外，還可能通過(guò)胎盤、乳汁而影響胎兒及嬰兒脂肪酸水平，并因此對(duì)嬰兒智力發(fā)育產(chǎn)生影響[1-3]。二十二碳六烯酸 (docosahexenoic acid,DHA) 是一種重要的n-3系長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸，為人類早期發(fā)育所必需。乳汁中充足的DHA水平對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育、尤其是腦發(fā)育起重要作用。DHA 的生物合成過(guò)程是在一系列前體脂肪酸的基礎(chǔ)上，通過(guò)不斷進(jìn)行脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)和脂肪酸脫氫反應(yīng)而獲得。最新研究[4]表明:ELOVL脂肪酸延長(zhǎng)酶基因2 (ELOVL fatty acid elongase 2,ELOVL 2) 可以編碼長(zhǎng)鏈脂肪酸延長(zhǎng)酶，是多不飽和脂肪酸代謝通路上重要的限速酶，其活性直接影響多不飽和脂肪酸的合成。國(guó)外研究[5-7]表明:ELOVL基因的單核苷酸多態(tài)性 (single nucleotide polymorphism,SNP) 與人體不同組織中的脂肪酸組成譜相關(guān)聯(lián)，不同基因型攜帶者的人體脂肪酸組成存在顯著性差異，但國(guó)內(nèi)的相關(guān)研究較少。本研究旨在探討中國(guó)漢族乳母ELOVL2基因多態(tài)性與乳汁DHA水平的關(guān)系。

1　資料與方法

1.1研究對(duì)象選擇吉林省長(zhǎng)春市健康乳母209人,均簽署知情同意書。本研究得到吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。排除標(biāo)準(zhǔn)：非漢族，孕期或哺乳期服用過(guò)含有多不飽和脂肪酸 (polyunsaturated fatty acid,PUFA) 補(bǔ)充劑的乳母，并發(fā)有高血壓、糖尿病及其他疾病處于治療期的乳母。

1.2調(diào)查方法由經(jīng)過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)的調(diào)查人員于產(chǎn)后第20～22天采用“面對(duì)面”方式進(jìn)行詢問(wèn)，記錄乳母的基本情況 (包括年齡、身高、體質(zhì)量、文化程度、分娩方式和經(jīng)濟(jì)狀況等)。采用三天二十四小時(shí)膳食回顧法收集乳母膳食資料，并用《金鑰匙營(yíng)養(yǎng)專家系統(tǒng)-孕產(chǎn)婦版》(上海營(yíng)康)和《中國(guó)食物成分表》[8]估算乳母膳食脂肪酸攝入量。

1.3乳汁樣本的采集和測(cè)定于產(chǎn)后第22～25天上午9：00～11:00手動(dòng)采集乳母乳汁20 mL于冷凍管中，置于-80℃冰箱待測(cè)。提取乳汁脂肪層，采用直接酯化一步法生成脂肪酸甲酯，取1 μL甲酯進(jìn)樣于島津(GC-14C)型氣相色譜儀(Shimadzu公司，日本)進(jìn)行脂肪酸甲酯濃度檢測(cè)，通過(guò)DHA脂肪酸甲酯轉(zhuǎn)換系數(shù)計(jì)算出DHA水平[9]。

1.4SNPs位點(diǎn)選擇和基因型檢測(cè)①利用國(guó)際單倍型圖工程數(shù)據(jù)庫(kù)(Hapmap)和美國(guó)國(guó)立圖書館數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)等公共數(shù)據(jù)庫(kù)，并應(yīng)用Haploview 4.2軟件篩選基因的2個(gè)標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)，其次等位基因頻數(shù)在中國(guó)漢族人群中大于10%；②采用基因組DNA提取試劑盒(北京天根公司)提取乳母乳汁基因組DNA，并用Eppendorf蛋白核酸測(cè)定儀測(cè)定DNA的濃度及純度。應(yīng)用Sequenom Mass Array 系統(tǒng)檢測(cè)ELOVL2基因型(北京博淼生物科技有限公司檢測(cè))。

2　結(jié)　果

2.1健康乳母的基本情況漢族乳母209人，平均年齡(30.00 ± 4.00)歲，平均身高(1.64±0.07)m，孕期平均增加體質(zhì)量(18.87±6.87)kg; 順產(chǎn)乳母66人(31.58%)，剖腹產(chǎn)143人(68.42%)；文化程度為高等教育(大學(xué)、研究生及以上)的乳母130人(62.20%),教育水平為中等及以下的乳母占79人(37.80%)；月家庭收入在10 000元以上的乳母46人(22.01%)，5 000～10 000元119人(56.94%)，2 000～5 000元79人(21.05%)。

2.2不同SNPs位點(diǎn)等位基因和基因型頻數(shù)分布ELOVL2基因2個(gè)位點(diǎn)的等位基因和基因型頻數(shù)見(jiàn)表1。rs3798713和rs2281591位點(diǎn)檢出率分別為97.13%和99.52%。各位點(diǎn)基因型頻數(shù)分布符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)，表明所選樣本具有群體代表性。209名乳母rs3798713和rs2287591位點(diǎn)的主等位基因(Major)頻數(shù)分別為66.0%和80.3%；m(minor)代表次等位基因，兩位點(diǎn)頻數(shù)分別為34.0%和19.7%，符合NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中亞洲人群該SNPs位點(diǎn)主次等位基因分布頻數(shù)。

表1　ELOVL2基因SNP位點(diǎn)等位基因及基因型頻數(shù)

aM:Major allele;m:Minor allele;P:Pvalue of Hardy-Weinberg equilibrium.

2.3不同SNPs位點(diǎn)膳食脂肪酸攝入量和乳汁DHA水平比較根據(jù)不同SNPs位點(diǎn)基因型將乳母進(jìn)行分組，檢測(cè)不同基因型組間乳母的膳食脂肪酸攝入量以及乳汁DHA水平，不同基因型組間乳母的膳食脂肪酸攝入量及乳汁DHA水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表2和3。

表2rs3798713位點(diǎn)不同基因型乳母膳食脂肪酸攝入量及乳汁DHA水平比較

表3rs2281591位點(diǎn)不同基因型乳母膳食脂肪酸攝入量及乳汁DHA水平比較

2.4單倍型與乳汁DHA水平的數(shù)量性狀分析不同rs3798713(CG)-rs2281591(AG)單倍型系統(tǒng)與乳母乳汁DHA水平的數(shù)量性狀分析結(jié)果見(jiàn)表4。不同單倍型系統(tǒng)的乳母乳汁DHA水平比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=3.422，df=5，P=0.635)。

表4rs3798713(CG)-rs2281591(AG)單倍型與乳母乳汁DHA水平的數(shù)量性狀分析

Tab.4Quantitative trait analysis of rs3798713(CG)-rs2281591(AG) haplotypes and DHA levels in breast milk of maternals

HaplotypenMarFreqAddVal95%Lo95%Hiχ2PC-C-A-A410.20300000.0460.831C-C-A-G660.32674.197-7.7016.091.1420.285C-C-G-G230.1139-3.063-21.3315.200.3150.575C-G-A-A360.1782-5.501-22.6611.651.1930.275C-G-A-G260.1287-0.597-17.1915.990.0630.802G-G-A-A100.04959.176-8.0326.381.4900.222

Global Likelihood ratio chisq= 3.422 ，df=5，P=0.635.Haplotype SNP order is rs3798713 (CG) -rs2281591 (AG)With haplotype C-C-A-A,major alleles for all SNP,as the reference.MarFeq:Marker frequency is the frequency of the haplotype distribution.AddVal:Additive value indicates the additive effect of the haplotype shown on the breast milk DHA level.

3　討　論

大量文獻(xiàn)[10-13]報(bào)道了膳食對(duì)乳汁脂肪酸水平的影響，而最新國(guó)外研究文獻(xiàn)表明了基因遺傳變異對(duì)人體脂肪酸水平的影響。本組研究對(duì)象為中國(guó)北方漢族乳母，不同基因型的研究人群膳食脂肪酸攝入量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明樣本人群的膳食脂肪酸攝入無(wú)組間差異。ELOVL2基因位于染色體6p24.2區(qū)域，由7個(gè)內(nèi)含子和8個(gè)外顯子構(gòu)成，長(zhǎng)度約為36 000 bp，編碼296種氨基酸。ELOVL2 基因是編碼PUFAs 合成過(guò)程中的重要限速酶，影響PUFAs 的合成代謝。最新研究[14-16]表明：ELOVL基因簇參與脂肪酸碳鏈延長(zhǎng)過(guò)程，形成更多復(fù)雜的長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸(如DHA)。Lemaitre等[7]觀察了5個(gè)歐洲隊(duì)列人群共8 866個(gè)人體的全基因組關(guān)聯(lián)結(jié)果發(fā)現(xiàn):ELOVL2延長(zhǎng)酶基因多態(tài)性與血漿磷脂4種主要n-3多不飽和脂肪酸水平相關(guān)聯(lián)，rs2236212次等位基因攜帶者DHA水平顯著降低(P=1×10-15)。本研究檢測(cè)的rs3798713位點(diǎn)與rs2236212位點(diǎn)在中國(guó)漢族人群中高度連鎖(D′=1.00，r2=1.00)，2位點(diǎn)處于同一個(gè)連鎖不平衡區(qū)域內(nèi)，但本研究尚未發(fā)現(xiàn)其可影響乳汁DHA水平。Tanaka等[5]對(duì)InCHIANTI研究中1 075位個(gè)體進(jìn)行全基因組關(guān)聯(lián)研究發(fā)現(xiàn):ELOVL2基因上的rs953413位點(diǎn)的次等位基因攜帶者血漿中EPA和DPA水平較高，而DHA水平較低。ELOVL2基因共有3個(gè)BLOCK，研究報(bào)道的陽(yáng)性位點(diǎn)均來(lái)自BLOCK1?；谏鲜鲅芯拷Y(jié)果，本研究選擇同樣位于BLOCK1中的2個(gè)標(biāo)簽SNPs位點(diǎn)(rs3798713和rs2281591)進(jìn)行研究，ELOVL2基因2個(gè)SNPs位點(diǎn)基因頻數(shù)與Hapmap數(shù)據(jù)庫(kù)亞洲人群基因頻數(shù)相似，但尚未發(fā)現(xiàn)這2個(gè)位點(diǎn)與中國(guó)漢族乳母乳汁DHA水平的關(guān)聯(lián)，分析其原因如下：①可能是樣本來(lái)源不一致。中國(guó)人群樣本rs3798713位點(diǎn)次等位基因頻數(shù)(34%)與研究報(bào)道中歐洲人的頻數(shù)(57%)相差很大，存在種族差異；②歐洲隊(duì)列研究檢測(cè)樣本是血漿DHA(DHA占總脂肪酸的百分比)，而本研究檢測(cè)的樣本是乳汁DHA(DHA的實(shí)際濃度),檢測(cè)樣本的差異也可能導(dǎo)致檢驗(yàn)效率的不同；③可能受樣本量的影響，本研究中只有樣本209例。目前不同rs3798713(CG)-rs2281591(AG)單倍型系統(tǒng)與乳母乳汁DHA水平關(guān)聯(lián)研究尚未見(jiàn)報(bào)道，因此對(duì)于ELOVL2基因多態(tài)性與DHA水平的關(guān)系研究有待擴(kuò)大樣本量，且在另外2個(gè)BLOCK里選擇更多的標(biāo)簽SNPs繼續(xù)研究或在其他群體中進(jìn)一步驗(yàn)證。

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Association analysis on polymorphisms of ELOVL2 gene and DHA level in breast milk of lactating mothers

LI Xiang1,DING Zhen1,WU Yixia1,CHEN Xueyan1,LIU Guoliang2,XIE Lin1

(1.Department of Nutrition and Food Hygiene,School of Public Health,Jilin University,Changchun 130021,China;2.Experimental Center of Preventive Medicine,School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021,China)

ObjectiveTo investigate the association between rs2281951 and rs3798753 in ELOVL fatty acid elongase2 (ELOVL2 gene) and the docosahexenoic acid(DHA)level in breast milk,and to clarify the influence of the polymorphisms of ELOVL2 gene in the DHA level of breast milk.Methods 209 healthy maternals were selected and signed the consent form and completed the 3-day 24-hour dietary recall questionaire on one day during the 22nd-the 25th day after partum, and 20 mL breast milk was collected.The DHA level in breast milk was detected with gas chromatography.The milk DNA was extracted and two single nucleotide polymorphisms(SNPs)of ELOVL2 gene were detected by Sequenom Mass Array System.UNPHASED 3.012 genetics software was adopted to analyze the quantitative trait of haplotype and the DHA level in breast milk.ResultsThe distribution of genotypic frequencies of rs2281591 and rs3798713 sites in ELOVL2 gene was consistent with Hardy-Weinberg equilibrium (P>0.05).The dietary fatty acid intakes and the milk DHA levels of maternals carrying different genotypes had no statistically significant differences (P>0.05).The DHA levels in breast milk of maternals carring different rs3798713 (CG)-rs2281591 (AG) haplotypes had no statistically significant difference (χ2= 3.422,df=5,P=0.635).Conclusion Rs3798713 and rs2281951 and constructed haplotypes in ELOVL2 gene are not related to the DHA levels in breast milk.

gene polymorphism; haplotype; ELOVL2 gene; breast milk; docosahexenoic acid

1671-587Ⅹ(2015)06-1230-05

10.13481/j.1671-587x.20150625

2015-02-02

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(81102115)

李響(1990-)，女，吉林省長(zhǎng)春市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事?tīng)I(yíng)養(yǎng)與健康關(guān)系方面的研究。

謝林，教授，博士研究生導(dǎo)師(Tel:0431-85619455,E-mail：xielin@jlu.edu.cn)

R153.1

A

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間:2015-08-12 09:06:40

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