安　英，路　倩，徐叢飛，王艷春，韓麗琴

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

紅景天總黃酮對大鼠心肌成纖維細(xì)胞增殖的抑制作用

安英1，路倩2，徐叢飛3，王艷春2，韓麗琴3

(1.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能實驗室，吉林 吉林 132013；2.吉林醫(yī)藥學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室，吉林 吉林 132013；3.吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院化學(xué)教研室，吉林 吉林 132013)

目的：研究紅景天總黃酮對轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)誘導(dǎo)的新生大鼠心肌成纖維細(xì)胞(CFB)增殖的抑制作用，探討紅景天總黃酮改善心肌纖維化的作用機制。方法：采用TGF-β1(5 μg·L-1)誘導(dǎo)大鼠CFB增殖，構(gòu)建心肌纖維化細(xì)胞模型。將正常培養(yǎng)的大鼠CFB分為對照組、模型組和25、50及100 mg·L-1紅景天總黃酮組。給藥48 h后，MTT法檢測細(xì)胞活力，ELISA法檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中Ⅰ型膠原蛋白(ColⅠ)和Ⅲ型膠原蛋白(Col Ⅲ)的水平，檢測上清液中總超氧化物歧化酶(T-SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性以及丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的水平。結(jié)果：MTT法檢測，與對照組比較，模型組細(xì)胞活力明顯升高(P<0.01)；與模型組，紅景天總黃酮各劑量組細(xì)胞活力均明顯下降(P<0.05)。T-SOD和MDA檢測，與對照組比較，模型組細(xì)胞T-SOD活性下降(P<0.05)，MDA水平明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，50和100 mg·L-1組細(xì)胞T-SOD活性明顯升高(P<0.01)，25和50 mg·L-1紅景天總黃酮組MDA水平明顯下降(P<0.05)。GSH-Px和GSH檢測，與對照組比較，模型組細(xì)胞GSH-Px活性及GSH水平均明顯降低(P<0.01)；與模型組比較，紅景天總黃酮各劑量組細(xì)胞GSH-Px活性和GSH水平均升高(P<0.05)。ColⅠ和Col Ⅲ水平測定，模型組ColⅠ和Col Ⅲ水平明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，紅景天總黃酮各劑量組細(xì)胞2種蛋白水平均明顯下降(P<0.05)。結(jié)論：紅景天總黃酮可以抑制大鼠CFB的增殖，并可能經(jīng)抗氧化應(yīng)激途徑改善心肌纖維化。

紅景天總黃酮；心肌纖維化；心肌成纖維細(xì)胞；轉(zhuǎn)化生長因子β1

紅景天(Rhodiola rosea)是景天科植物，其根、莖均可入藥，被譽為“高原人參”和“雪山仙草”。國內(nèi)外學(xué)者對紅景天屬植物化學(xué)成分黃酮類進行了大量研究，其主要成分包括黃酮醇及其苷類化合物[1]。紅景天屬植物具有抗氧化、抗衰老、抗疲勞與增強免疫力、抗腫瘤、抗缺氧及改善心血管系統(tǒng)功能等藥理作用[2]。有關(guān)紅景天黃酮體外抗氧化活性研究[3]發(fā)現(xiàn)：其對羥自由基、超氧陰離子自由基和1，1-二苯基-2-苦基肼(1，1-Dipheny1-2-picryl-hydrazyl,DPPH)自由基的清除呈濃度依賴性。紅景天總黃酮是否通過抗氧化途徑改善心肌纖維化，尚未見相關(guān)報道。本研究采用轉(zhuǎn)化生長因子β1(transforming growth factor β1，TGF-β1)誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞(cardiac fibroblasts，CFB)增殖，觀察紅景天總黃酮是否通過抗氧化途徑改善心肌纖維化，探討紅景天總黃酮治療心肌纖維化的可能性及相關(guān)機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物、藥品、主要試劑和儀器Wistar大鼠10只，清潔級，1～3 d齡，雌雄兼用，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(吉)2007-0003。紅景天總黃酮(吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院研究室提供)，改良型RPMI-1640培養(yǎng)基(賽默飛世爾生物化學(xué)制品)，胎牛血清(浙江天航生物科技公司)，TGF-β1(深圳百恩維生物有限公司)，胰蛋白酶、3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限公司)，Ⅰ型膠原(collagen proteinⅠ,ColⅠ)和Ⅲ型膠原(collagen protein Ⅲ,Col Ⅲ)ELISA檢測試劑盒(上海卡努生物科技有限公司)，總超氧化物歧化酶(total superoxide dismutase，T-SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)及谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)。DL-CJ-1N超凈工作臺由北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司生產(chǎn)，Ti-S倒置顯微鏡由日本尼康公司生產(chǎn)，MCO-18AZX CO2培養(yǎng)箱由日本Sanyo公司生產(chǎn)，WD-2102A自動酶標(biāo)儀由北京市六一儀器廠生產(chǎn)。

1.2CFB的分離與培養(yǎng)取Wistar大鼠，無菌開胸取心肌，用PBS緩沖液清洗，剪成1 mm×1 mm×1 mm大小的碎片，0.125%胰蛋白酶反復(fù)消化，收集各次消化上清液，離心(1 000 r·min-1，5 min)，棄上清，用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)瓶中，置37℃、5% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。用差速貼壁法去除內(nèi)皮細(xì)胞及心肌細(xì)胞，實驗采用第2代培養(yǎng)細(xì)胞。

1.3實驗分組和給藥大鼠CFB分為5組。正常對照組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入PBS緩沖液；模型組：培養(yǎng)細(xì)胞中加入TGF-β1(終濃度5 μg·L-1)，刺激CFB增殖；低劑量紅景天總黃酮組：加入TGF-β1(終濃度5 μg·L-1)和25 mg·L-1紅景天總黃酮；中劑量紅景天總黃酮組：加入TGF-β1(終濃度5 μg·L-1)和50 mg·L-1紅景天總黃酮；高劑量紅景天總黃酮組：加入TGF-β1(5 μg·L-1)和100 mg·L-1紅景天總黃酮。

1.4MTT法檢測細(xì)胞活力大鼠CFB消化后，用含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞懸液，計數(shù)后以每毫升5×104個細(xì)胞、每孔100 μL接種于96孔板上。將細(xì)胞分5組，每組設(shè)5個復(fù)孔，除正常對照組加PBS緩沖液外，其余各組均每孔加TGF-β1(終濃度5 μg·L-1)，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱孵育24 h后，吸除上清液。按上述分組加培養(yǎng)基和不同終濃度的紅景天總黃酮，48 h后收集上清液，每孔加入150 μL RPMI-1640培養(yǎng)液及20 μL MTT溶液(5 g·L-1)，37℃、5%CO2條件下繼續(xù)孵育4 h。取出后終止培養(yǎng)，吸除孔內(nèi)上清液，每孔加150 μL DMSO，低速震蕩10 min，使結(jié)晶物充分溶解。采用酶標(biāo)儀在波長490 nm處測定各組吸光度(A)值。

1.5比色法測定T-SOD、GSH-Px活性和MDA、GSH水平試劑盒分別測定各組細(xì)胞培養(yǎng)上清中T-SOD、MDA、GSH-Px和GSH的濃度，各項檢測均按照試劑盒說明書操作。

1.6ELISA法檢測ColⅠ和Col Ⅲ水平ELISA法分別檢測細(xì)胞上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平，嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進行。大鼠CFB上清液3 000 r·min-1離心10 min，取上清，根據(jù)預(yù)實驗對樣品5倍稀釋。標(biāo)準(zhǔn)品用標(biāo)準(zhǔn)稀釋液依次稀釋成3.12、6.25、12.50、25.00、50.00和100.00 μg·L-1的不同濃度。每組設(shè)5個復(fù)孔，各孔分別加入酶標(biāo)二抗100 μL(空白孔不加)，37℃恒溫箱溫育1 h，反復(fù)洗滌后，各孔分別加入底物A和B各50 μL，37℃避光孵育15 min，各孔加入終止液50 μL，酶標(biāo)儀檢測450 nm處各孔的A值，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各組上清液中ColⅠ和ColⅢ水平。

2　結(jié)　果

2.1MTT比色法檢測CFB活力與對照組(0.44 ±0.06)比較，模型組CFB活力(0.63±0.10)明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，25、50和 100 mg·L-1紅景天總黃酮組CFB活力(0.50 ±0.10、0.48 ±0.11和0.44 ±0.06)明顯降低(P<0.05或P<0.01)。

2.2細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA水平和T-SOD活性與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-SOD活力下降(P<0.05)，而MDA水平明顯升高(P<0.05)；經(jīng)紅景天總黃酮處理48 h后，與模型組比較，25 mg·L-1紅景天總黃酮組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-SOD活性無明顯變化(P>0.05)，而50和100 mg·L-1紅景天總黃酮組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-SOD活性明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，25 和50 mg·L-1紅景天總黃酮組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MDA水平明顯下降(P<0.05)，而100 mg·L-1紅景天總黃酮組無明顯變化(P>0.05)。見表1。

表1各組細(xì)胞上清液中MDA水平和T-SOD活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

2.3細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH水平和GSH-Px活性與對照組比較，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-Px活性和GSH水平明顯下降(P<0.01)；經(jīng)紅景天總黃酮處理48 h后，與模型組比較，各劑量紅景天總黃酮組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中GSH-Px活性和GSH水平均升高(P<0.05或P<0.01)。見表2。

表2各組細(xì)胞上清液中GSH水平和GSH-Px活性

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

2.4細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平ELISA檢測結(jié)果顯示：TGF-β1作用于CFB后，模型組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平較對照組明顯升高(P<0.01);經(jīng)紅景天總黃酮處理48 h后，與模型組比較，紅景天總黃酮各劑量組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中ColⅠ和Col Ⅲ水平均明顯下降(P<0.05或P<0.01)。見表3。

表3各組細(xì)胞上清液中ColⅠ和ColⅢ水平

Tab.3Levels of ColⅠand Col Ⅲ in supernatant of cells in various groups

GroupColⅠColⅢControl4.79±1.576.15±0.58Model11.52±1.17**9.14±1.40**Rhodiolatotalflawonoids(mg·L-1) 259.17±1.15△7.09±0.69△ 507.22±0.86△△6.86±0.80△ 1006.25±1.14△△6.41±0.25△△

*P<0.05，**P<0.01 compared with control group;△P<0.05，△△P<0.01 compared with model group.

3　討　論

心肌纖維化是由于CFB增殖或活化，心肌組織中膠原纖維的過量沉積使心室壁僵硬、順應(yīng)性降低，從而影響心肌收縮和舒張功能，最終導(dǎo)致心臟功能障礙和心力衰竭[4]。心肌纖維化的病因仍未明確，可能與氧化應(yīng)激、炎癥因子和生長因子等因素激活或失調(diào)有關(guān)[5-7]。TGF-β1是成纖維細(xì)胞的強趨化因子，可調(diào)節(jié)成纖維細(xì)胞的增殖、遷移及細(xì)胞外基質(zhì)的產(chǎn)生[8]。TGF-β1可誘導(dǎo)成纖維細(xì)胞分化為CFB，進而刺激膠原蛋白、纖維連接蛋白及蛋白多糖等間質(zhì)成分的合成，促進細(xì)胞間質(zhì)的沉積，最終導(dǎo)致心肌纖維化發(fā)生[9]。本研究結(jié)果表明：TGF-β1可顯著促進大鼠CFB的增殖，并誘導(dǎo)膠原蛋白合成增加。紅景天總黃酮是從紅景天中提取的有效成分(主要有黃酮醇及其苷類化合物)，其具有廣泛的抗氧化、抗衰老、抗腫瘤和改善心血管系統(tǒng)功能等生理活性[10-11]。本研究結(jié)果表明：紅景天總黃酮處理CFB后，在25～100 mg·L-1濃度范圍內(nèi)，可抑制CFB增殖，且具有一定的劑量依賴性。

氧化應(yīng)激在多種疾病導(dǎo)致的纖維化中發(fā)揮重要的作用，研究[12-13]表明：心肌組織氧化應(yīng)激過度，會刺激膠原纖維合成增加，從而導(dǎo)致心肌纖維化。SOD活性的高低間接反映機體清除氧自由基水平，其能催化生物氧化而產(chǎn)生的超氧陰離子自由基O2-，生成H2O2，通過GSH-Px作用分解成H2O和O2，從而保護細(xì)胞免受損傷[14]。MDA可反映機體內(nèi)自由基的濃度和脂質(zhì)過氧化的程度，其高低可間接反映細(xì)胞受自由基損傷的嚴(yán)重程度[15]。GSH是衡量細(xì)胞抗氧化能力的重要因素，能夠清除自由基并且保護含巰基的酶，避免紅細(xì)胞蛋白及其他輔助因子受到氧化損傷作用[16-17]。本實驗檢測細(xì)胞培養(yǎng)上清液中T-SOD、GSH-Px活性和GSH、MDA水平發(fā)現(xiàn)：紅景天總黃酮各劑量組中T-SOD和GSH-Px活性升高，GSH水平提高，而MDA水平(100 mg·L-1組除外)下降，提示紅景天總黃酮可能是通過降低細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平，改善心肌纖維化，但其具體的作用機制仍有待于進一步研究。

心肌膠原中，以Col Ⅰ型和ColⅢ為主，ELISA檢測結(jié)果顯示：模型組中ColⅠ和ColⅢ均明顯上調(diào)，提示TGF-β1通過增加成纖維細(xì)胞ColⅠ和Col Ⅲ的分泌，使間質(zhì)細(xì)胞外基質(zhì)的合成與降解失衡，從而促進心肌纖維化的發(fā)生發(fā)展。不同劑量紅景天總黃酮均能明顯抑制體外培養(yǎng)的大鼠CFB合成與分泌ColⅠ和 ColⅢ，且具有一定的劑量依賴性關(guān)系。

綜上所述，本研究初步探討了紅景天總黃酮對心肌纖維化的防治作用及其機制，推測紅景天總黃酮除具有抗衰老、抗腫瘤和改善心血管系統(tǒng)功能等作用外，還可作為防治心肌纖維化的藥物，為紅景天總黃酮的臨床應(yīng)用提供了新的領(lǐng)域。

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Inhibitory effect of Rhodiola total flavonoids on proliferation of cardiac fibroblasts in rats

AN Ying1,LU Qian2,XU Congfei3,WANG Yanchun2,HAN Liqin3

(1.Medical Functional Laboratory,School of Basic Medical Sciences, Jilin Medical University,Jilin 132013,China；2. Department of Pharmacology,School of Basic Medical Sciences, Jilin Medical University,Jilin 132013,China；3. Department of Chemistry,School of Pharmacy,Jilin Medical University，Jilin 132013,China)

Objective To investigate the inhibitory effect of Rhodiola total flavonoids on transforming growth factor (TGF) -β1-induced proliferation of cardiac fibroblasts (CFB) in the rats,and to explore its mechanisms of improving myocardial fibrosis.Methods5 μg·L-1TGF-β1 was used to induce the proliferation of CFB to build the cell models of myocardial fibrosis.The cultured CFB were divided into control group,model group,and low,medium,high doses(25,50 and 100 mg·L-1) of Rhodiola total flavonoids groups.The cells were treated for 48 h,the vitalities of cells were detected by MTT, the levels of collagen proteinⅠ (ColⅠ) and collagen proteinⅢ (Col Ⅲ) in supernatant were measured by ELISA,and the activities of total superoxide dismutase (T-SOD) and glutathione peroxidase (GSH-Px) were detected, the levels of malondialdehyde (MDA) and glutathione (GSH) were also measured.Results The MTT results indicated that compared with control group,the cell vitality in model group was significantly increased (P<0.01). compared with model group, the cell vitalities of CFB in Rhodiola total flavonoids groups were significantly decreased (P<0.05).Compared with control group,the T-SOD activity in model group was decreased,while the MDA level was significantly increased (P<0.05); compared with model group,the T-SOD activities in 50 and 100 mg·L-1Rhodiola total flavonoids groups were increased (P<0.01); the MDA levels in 25 and 50 mg·L-1groups were decreased significantly (P<0.05).Compared with control group,the GSH-Px activity and GSH level in model group were significantly decreased (P<0.01). Compared with model group, the GSH-Px activities and GSH levels in Rhodiola total flavonoids groups were increased (P<0.05).Compared with control group, the ColⅠand Col Ⅲ levels in model group were significantly increased (P<0.01); compared with model group, the ColⅠand Col Ⅲ levels in Rhodiola total flavonoids groups were significantly decreased (P<0.05).ConclusionRhodiola total flavonoids can inhibit the proliferation of rat CFB.The development of myocardial fibrosis may be inhibited by Rhodiola total flavonoids through anti-oxidative stress pathway.

Rhodiola total flavonoids; myocardial fibrosis; cardiac fibroblasts; transforming growth factor β1

1671-587Ⅹ(2015)06-1190-05

10.13481/j.1671-587x.20150618

2015-03-03

吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究基金資助課題(2013476)

安英(1979-)，女，吉林省延吉市人，講師，醫(yī)學(xué)碩士，主要從事心血管藥理學(xué)方面的研究。

韓麗琴，教授(Tel：0432-64560536，E-mail：786533955@qq.com)

R285.5

A