任　毅，甘勝偉,李平華

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科，重慶400016)

Dectin-1和TLR4在煙曲霉菌性角膜炎大鼠角膜組織中的表達及其在角膜炎發(fā)病中的作用

任毅，甘勝偉,李平華

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院眼科，重慶400016)

目的：探討煙曲霉菌感染大鼠角膜后Dectin-1和Toll樣受體-4(TLR4)表達及炎癥因子的分泌特點，闡明其在大鼠角膜炎發(fā)病中的作用。方法：40只SD大鼠隨機分為對照組(n=10)和煙曲霉菌性角膜炎組(n=30)，對照組不予任何干預，煙曲霉菌性角膜炎組給予雙眼煙曲霉菌感染造模，分別于感染12 h(n=10，12 h組)、24 h(n=10，24 h組)和48 h(n=10，48 h組)后取角膜組織，ELISA法檢測IL-1、TNF-α、IL-6、IL-10和NF-κB水平，免疫組織化學法、RT-PCR法及Western blotting法測定角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA及蛋白表達。結果：大鼠造模均成功，眼角膜裂隙燈檢測觀察可見對照組眼睛清澈，感染煙曲霉菌后，12 h組眼睛表面有明顯的一層薄膜，薄膜與健康的角膜邊界清晰；24 h組可見眼部有一層白色的浸潤灶形成，且表面粗糙；48 h組角膜白色浸潤灶進一步加深，且范圍明顯擴大，基本覆蓋了整個眼球。煙曲霉菌感染后，12 h組、24 h組和48 h組角膜組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平明顯高于空白對照組(P<0.05)，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)；免疫組織化學檢測，大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4表達水平隨著感染時間的增加逐漸增加，RT-PCR法和Western blotting法檢測，大鼠眼角膜組織煙曲霉菌性角膜炎組(12 h組、24 h組和48 h組)Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。結論：Dectin-1和TLR4在受到煙曲霉菌感染后可過量分泌，進而造成大鼠炎性相關因子表達，最終促使角膜炎的發(fā)生。

真菌性角膜炎；煙曲霉菌；模式識別受體-1；Toll樣受體-4

真菌性角膜炎(fungal keratitis)是困擾醫(yī)學界的一個難題[1]，該病發(fā)病急，治療難度大，屬于嚴重致盲性眼病的一種。既往的研究[2]表明：真菌性角膜炎不易康復可能與免疫損傷密切相關，Dectin-1和Toll樣受體-4(Toll-like receptor,TLR4)是介導免疫反應的2個重要因子，同時也是促炎性因子，Chai 等[3]曾發(fā)現(xiàn)Dectin-1和TLR4在眼角膜中有一定的表達；Leal等[4]指出：Dectin-1和TLR4促進角膜炎的發(fā)生可能與刺激中性粒細胞表達有關。但關于上述2種蛋白表達的定量分析國內外還沒有文獻報道。本實驗通過檢測Dectin-1和TLR4在大鼠煙曲霉菌性角膜炎各病程角膜組織中的表達，闡明Dectin-1和TLR4在大鼠角膜炎發(fā)病中的作用，為真菌性角膜炎治療提供一定的參考。

1　材料與方法

1.1實驗動物、主要試劑和儀器健康SD大鼠40只，雄雌各半，體質量300～400 g，購于重慶醫(yī)科大學實驗動物中心，動物合格證號：SYXK渝2007-0001，造模前所有大鼠均用眼科裂隙燈檢查無相關眼部疾病感染；IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB試劑盒購于德國Roche Diagnostics GmbH公司,多克隆抗體Dectin-1和TLR4、單克隆抗體β-actin購于美國Santa Cruz公司，相應二抗購于金斯瑞生物科技有限公司，ECL發(fā)光試劑盒購于江蘇碧云天生物有限公司，總RNA提取試劑盒購自北京天根公司，引物購于南京金斯瑞生物科技有限公司，SYBR Green通用型qPCR Master Mix 購自瑞士Roche生物；Real-time PCR擴增儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2標準菌株煙曲霉菌(Aspergillusfumigutus，AF)標準菌種購于中國醫(yī)學科學院微生物研究所，低溫保存，實驗前解凍，接種到含有一定量的沙堡弱葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基斜面上，培養(yǎng)時控制溫度為25℃，培養(yǎng)6～9 d后取出，用消毒后的生理鹽水反復吹打斜面，吸出，血細胞計數板計數孢子，制成孢子濃度為108CFU·mL-1的菌懸液，振蕩混勻。

1.3大鼠分組及模型的建立40只SD大鼠，隨機分為對照組和煙曲霉菌性角膜炎組，對照組(n=10,全程不予任何干預)，煙曲霉菌性角膜炎組分為感染12 h組(n=10，12 h 組)、24 h組(n=10，24 h組)和48 h組(n=10，48 h組)，所有大鼠在實驗前3 d給予氯霉素眼液點雙眼，每天4次；實驗時用1%的戊巴比妥鈉腹腔麻醉大鼠(1 mL/100 g體質量)，大鼠及實驗操作人員常規(guī)消毒后開始眼科造模手術，眼科造模手術全程在顯微鏡下進行。用4 mm環(huán)鉆在角膜中央進行定位，之后用無菌手術刀刮除角膜中央4 mm左右的上皮層，上述步驟完成后汲取菌懸液20滴，滴在刮除上皮的角膜面，蓋上角膜接觸鏡(由重慶醫(yī)科大學醫(yī)院眼科實驗室自制，使用Parafilm M 封口膜模壓制)。對照組給予同樣量的無菌生理鹽水滴入，最后進行瞼裂縫合。分別于12、24和48 h后打開瞼裂，照相后取出全眼角膜，行后續(xù)相關實驗。

1.4ELASA法檢測大鼠角膜中相關炎性因子表達從超低溫冰箱中取出角膜病灶區(qū)組織5 mg，加入50 μL組織蛋白裂解液，超聲細胞破碎儀破碎細胞(300 W)，電子勻漿機勻漿后，離心提取上述上清液以BCA法定量，定量后采用相應試劑盒測定IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB水平。

1.5免疫組織化學染色免疫組織化學染色參照PV9000二步法免疫組織化學試劑盒說明書。工作濃度配好后，DAB顯色，蘇木素復染，中性樹膠封片，光鏡觀察，以圖片中褐色顆粒數量和顏色程度判斷其表達水平。

1.6RT-PCR法檢測檢測大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達水平稱取15 mg角膜病灶區(qū)組織，總RNA提取試劑盒提取總RNA，總RNA定量，定量后每個樣本取2 μg行逆轉錄cDNA；逆轉出的cDNA用試劑盒提供的相應預混液行PCR反應，擴增次數為36次，擴增條件按照引物說明書進行；擴增出DNA片段行瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像儀拍照采集數據，Image J軟件計算熒光強度值，用β-actin作內參，每組實驗重復3次。β-actin引物設計：上游引物，5′-GTGACGAGGCCCAGAGCAAGAG-3′；下游引物，5′-ACGCAGCTCATTGTAGAAGGTGTGG-3′；產物長度123 bp。Dectin-1引物設計：Primer A，5′-CGTATCGGGGTATTCGGAGA-3′，Primer B，5′-CCATGCTAGGTGATGCTAGG-3′；產物長度343 bp。TLR4引物設計：上游引物，5′-CGTATACGACGAGTTCCAGT-3′；下游引物，5′-GGACTTGTTGGACGTCGAGA-3′；產物長度356 bp。以相應蛋白熒光強度值/β-actin熒光強度值的比值作為Dectin-1和TLR4 mRNA相對表達水平。

1.7Western blotting法檢測大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達水平取出眼角膜病灶區(qū)組織10 mg，加入100 μL組織蛋白裂解液，用超聲細胞破碎儀破碎細胞(300 W)，電子勻漿機勻漿后，離心提取上述上清液，并用BCA法測定蛋白含量，在定量后取樣本40 μg進行SDS-PAGE蛋白電泳，電泳結束后半干轉移至PVDF膜，PVDF膜用5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗過夜，第2天洗膜3次，之后加入相應二抗，最后洗膜3次，暗室內ECL曝光洗片，掃描儀掃描膠片后用Image J軟件計算灰度值，以β-actin作為內參，每組實驗重復3次。以相應蛋白灰度值/β-actin灰度值的比值作為蛋白表達水平。

2　結　果

2.1眼科裂隙燈觀察模型建立處死大鼠前，用眼科裂隙燈觀察大鼠角膜：對照組大鼠眼球清澈，無真菌感染發(fā)生，12 h組眼球表面有明顯的一層薄膜，薄膜與健康角膜邊界清晰；24 h組可見整個眼部均有一層白色浸潤灶形成，且表面粗糙，眼球上方可見明顯血絲；48 h組角膜白色浸潤灶進一步加深，且范圍明顯擴大，基本覆蓋了整個眼球。上述結果提示成功建立大鼠模型。見圖1(插頁三)。

2.2ELISA法測定眼角膜組織中炎性因子表達水平12 h組、24 h組和48 h組IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，隨著時間的延長，上述5個指標均呈逐步升高的趨勢，其中24 h組和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。見表1。

2.3免疫組織化學染色觀察大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達及菌絲12 h組、24 h組和48 h組大鼠角膜組織中褐色顆粒數量和顏色呈逐步增加的趨勢；此外，相關角膜最外圍可見一層菌絲生長，進一步提示造模成功。見圖2(插頁三)。

2.4RT-PCR法檢測大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達12 h組、24 h組以及48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，同時隨著時間的延長，其mRNA表達水平呈逐步升高的趨勢，其中24 h和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組明顯高于24 h組(P<0.05)。見圖3和表2。

表1　ELISA法檢測各組大鼠角膜組織中炎性因子水平

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

圖3各組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4 mRNA表達電泳圖

Fig.3Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 mRNA in corneal tissue of rats in various groups

表2Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

Tab.2Quantitative analysis of Dectin-1/β-actin and TLR4/β-actin

GroupDectin-1TLR4Control0.31±0.010.19±0.01Fungalkeratitis 12h0.78±0.03*0.58±0.03* 24h1.05±0.05*△0.90±0.05*△ 48h1.45±0.04*△#1.17±0.04*△#

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05 compared with 24 h group.

2.5Western blotting法檢測大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達12 h組、24 h組和48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達水平明顯高于對照組(P<0.05)，隨著時間的延長，其蛋白表達水平呈現(xiàn)逐漸升高的趨勢，其中24 h和48 h組明顯高于12 h組(P<0.05)，48 h組也明顯高于24 h組(P<0.05)。見圖4和表3。

Lane 1,2:Control group; Lane 3,4:12 h group; Lane 5,6:24 h group; Lane 7,8:48 h group.

圖4各組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白表達電泳圖

Fig.4Electrophoregram of expressions of Dectin-1 and TLR4 in corneal tissue of rats in various groups

表3Dectin-1/β-actin 和TLR4/β-actin 的定量分析

*P<0.05 compared with control group；△P<0.05 compared with 12 h group；#P<0.05,compared with 24 h group.

3　討　論

煙曲霉菌屬于曲霉菌屬中一種最為常見的、同時也是致病性最強的一種病原菌，近年來關于煙曲霉菌感染角膜致使其發(fā)生炎癥的報道越來越多，同時相關研究報道也逐年增加，但關于其感染的確切機制還沒有明確的文獻報道[5]。煙曲霉菌角膜炎是最嚴重的感染性角膜病之一，由于一般抗菌藥物難以完全殺死煙曲霉菌，所以治療難度大，一經感染常引起角膜潰瘍和角膜穿孔，甚至可能發(fā)生失明[6-7]。我國由于人口眾多，同時人們之間交流頻繁，致使本病發(fā)病率逐年升高[8]，給患者帶來了嚴重身心負擔。

Dectin-l是一種較為常見的C型凝集素樣模式識別受體，其在體內主要由DCs以及巨噬細胞表達，該蛋白一般表達量極少，當真菌感染后，巨噬細胞可識別真菌細胞壁上的甘露聚糖以及葡聚糖，導致Dectin-l信號通路激活，促進Dectin-l的大量分泌[9-11]。Balderramas等[12]研究發(fā)現(xiàn)：Dectin-1可以與ITAM結合，激活NF-κB信號通路，進而造成炎性反應的發(fā)生，促進IL-1和IL-6等炎癥因子的釋放。TLR是人體內一種較為常見的天然免疫受體，以往的研究證實TLR基因與果蠅胚胎背、腹側的發(fā)育有關[13-15]。隨著研究的不斷深入，醫(yī)學界證實哺乳動物體內也有類似的同源性受體，同時將這一類受體歸為TLR家族，這其中TLR4是最為常見的一種[16]，其可以介導內毒素/脂多糖應答的最主要受體，與TLR4細菌感染引起的膿毒血癥以及炎癥因子IL-10有密切關聯(lián)[17]，當真菌感染發(fā)生后，Dectin-l可與TLR4共同作用，促進炎癥反應發(fā)生。

目前國內還沒有關于煙曲霉菌角膜炎中Dectin-1以及TLR4聯(lián)合作用促進角膜炎發(fā)生和發(fā)展的研究。本研究結果顯示：大鼠造模均成功，在煙曲霉菌感染12 h后，角膜組織中炎癥因子IL-1、IL-6、IL-10、TNF-α和NF-κB表達水平明顯高于對照組;免疫組織化學、Western blotting法和RT-PCR法測定大鼠眼角膜組織提取液，12 h、24 h和48 h組大鼠角膜組織中Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達水平也明顯高于對照組。本研究結果并結合文獻報道[12，17]綜合提示：煙曲霉菌感染可以促進Dectin-1和TLR4蛋白及mRNA表達，Dectin-1表達水平的升高，促進了NF-κB過量分泌，而NF-κB過量分泌又進一步促進了IL-1和IL-6表達水平的升高， TLR4表達的升高則促進了角膜炎性因子IL-10過度分泌，最終促進了真菌性角膜發(fā)生。

綜上所述，Dectin-1和TLR4是炎性促發(fā)因子，在煙曲霉菌感染后可促使其過量分泌，造成大鼠炎性相關因子表達，促進了角膜炎的發(fā)生。

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Expressions of TLR4 and Dectin-1 in cornea tissue of rats with Aspergillus fungal keratitis and their effects in pathogenesis of keratitis

REN Yi,GAN Shengwei,LI Pinghua

(Department of Ophthalmology，F(xiàn)irst Affiliated Hospital，Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China)

ObjectiveTo explore the expressions of Dectin-1 and Toll-like receptor 4 (TLR4) and the secretory charateristics of inflammatory factors of theAspergillusfumigatusinfected cornea of the rats,and to clarify theirs role in the pathogenesis of rat keratitis.Methods 40 SD rats were separated into control group(n=10) and aspergillus keratitis group(n=30).The rats in aspergillus keratitis group were infected byAspergillusfumigatusin two eyes for 12,24 and 48 h,and the cornea tissue was took and ELISA kit was used to detect the level of inflammatory cytokines IL-1,TNF-a,IL- 6,IL-10,and NF-κB; immunohistochemistry,Western blotting and RT-PCR methods were used to determine the Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA expressions.ResultsThe rat models were successfully established.The eyes of the rats in control group were limpid tested by corneal slit lamp,however,there existed a clear boundary film on the surface of eyes of the rats in aspergillus keratitis group infected for 12 h,white infiltrates and bloodshot in the eyes in 24 h group and the white infiltrates were further strengthened and almost covered the entire eyes in 48 h group. The order of inflammatory cytokines IL-1,TNF-α,IL-6,IL-10,NF-κB was:48 h group>24 h group>12 h group>control group(P<0.05),so did the expression levels of Dectin-1 and TLR4 protein and mRNA in various groups tested by Western blotting and RT-PCR methods.The expression levels of Dectin-1 and TLR4 were increased with the prolongation of time investigated by immunohistochemical staining.ConclusionDectin-1 and TLR4 are secreted in excess after the eyes are infected with fumigatus,which promotes the expressions of related inflammatory cytokines and results in the occurrence of keratitis.

fungal keratitis;Aspergillusfumigatus; Dectin-1; Toll-like receptor

1671-587Ⅹ(2015)06-1176-05

10.13481/j.1671-587x.20150615

2015-02-26

重慶市科學技術委員會科技項目資助課題(cstc2011jjA10003)

任毅(1981-)，男，四川省鄰水縣人，主治醫(yī)師，在讀醫(yī)學碩士，主要從事角膜及眼表疾病方面的研究。

李平華，教授，碩士研究生導師(Tel：023-68894420， E-mail:lipinghua@126.com)

R772.21

A