李　芳，關文霞，任　飛，仝雪霞，孫玉寧

(1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學研究生院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，寧夏 銀川 750004)

Sirt-1和Hif-1α在慢性阻塞性肺疾病患者外周血單個核細胞中的表達及其意義

李芳1，關文霞2，任飛2，仝雪霞2，孫玉寧3

(1.寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸與危重醫(yī)學科，寧夏 銀川 750004；2.寧夏醫(yī)科大學研究生院，寧夏 銀川 750004；3.寧夏醫(yī)科大學生物化學與分子生物學系，寧夏 銀川 750004)

目的： 檢測慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者外周血單個核細胞(PBMCs)中沉默信息調節(jié)子(Sirt-1)和缺氧誘導因子1α(Hif-1α)的表達，探討Sirt-1和Hif-1α的表達在COPD發(fā)生發(fā)展中的作用。方法： 應用肺功能儀對COPD急性加重期組(n=20)、COPD穩(wěn)定期組(n=22)和對照組(n=20)的研究對象進行肺功能指標測定，采用Real-time PCR和Western blotting法檢測3組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α mRNA和蛋白表達，并分析Sirt-1和Hif-1α表達水平與肺功能的關系。結果： 與對照組比較，COPD急性加重期組、COPD穩(wěn)定期組患者第1秒用力呼氣容積占預計值百分比(FEV1%)、第1秒用力呼氣容積與用力肺活量的比值(FEV1/FVC%)均降低(P<0.05)；與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性加重期組患者FEV1%和FEV1/FVC%降低(P<0.05)。COPD急性加重期組、COPD穩(wěn)定期組患者PBMCs中Sirt-1 mRNA和蛋白表達水平均低于對照組(P<0.05或P<0.01)；與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性加重期患者PBMCs中Sirt-1 mRNA和蛋白表達水平降低(P<0.01)；與對照組比較，COPD患者Hif-1α mRNA及蛋白表達水平均明顯升高(P<0.05或P<0.01)，COPD急性加重期患者其表達水平升高更明顯(P<0.01)；與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性加重期組患者PBMSCs中Hif-1α mRNA和蛋白表達水平升高(P<0.05)。Pearson直線相關法分析，Sirt-1 mRNA(蛋白)表達水平與患者FEV1%(rmRNA=0.61，r蛋白=0.545)和FEV1/FVC% (rmRNA=0.513，r蛋白=0.491)呈正相關關系，Hif-1α mRNA(蛋白)表達水平與FEV1%(rmRNA=-0.812，r蛋白=-0.781)和FEV1/FVC% (rmRNA=-0.661，r蛋白=-0.674)呈負相關關系(P<0.05)。結論： COPD患者PBMCs中Sirt-1基因表達水平下降，Hif-1α基因表達水平上調，二者的表達變化可能與COPD的發(fā)生發(fā)展密切相關。

沉默信息調節(jié)子；缺氧誘導因子1 ；慢性阻塞性肺疾??；外周血單個核細胞

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)是一種常見、多發(fā)的慢性呼吸系統(tǒng)疾病，是一組以進行性、可逆氣流受限為特征的肺部疾病。COPD的不斷發(fā)展最終可引起肺源性心臟病和呼吸衰竭，死亡率較高。COPD的發(fā)生發(fā)展將使患者處于不同程度的慢性缺氧狀態(tài),同時又使患者處于長期全身慢性炎癥狀態(tài)。目前研究[1]認為：COPD的發(fā)生涉及細胞、體液介質和分子遺傳等多個途徑，而且與血管內皮細胞、平滑肌細胞和單核細胞等細胞的異常及相關基因的表達有關。沉默信息調節(jié)子(silent information regulator，Sirt-1)屬于Sir2基因家族成員，是一種保守的從古細菌到哺乳動物中都存在的NAD+依賴的組蛋白/非組蛋白去乙?；?。Sirt-1對細胞的生存、凋亡和衰老等生理活動起十分重要的調節(jié)作用[2]。缺氧誘導因子1α (hypoxia-inducible factor-1α，Hif-1α) 是哺乳動物細胞中存在的隨細胞中氧濃度變化而介導低氧適應性反應的轉錄因子，是低氧條件下維持氧穩(wěn)態(tài)的關鍵性物質。既往研究[3-4]報道：COPD患者肺組織Sirt-l的表達呈下降趨勢，Sirt-l能夠調節(jié)煙霧所致的肺內皮細胞、纖維細胞和巨噬細胞的吞噬功能。在體外培養(yǎng)的細胞中，Sirt-l能夠與Hif-1 和Hif-2 相互作用，使后者去乙?；⒓せ?，調節(jié)細胞對缺氧的反應[5-6]。基于單核細胞在COPD發(fā)病中的功能[1]、Sirt-l和Hif-1 基因與COPD的研究報道，本課題組采用熒光定量PCR、Western blotting法觀察COPD穩(wěn)定期和急性加重期患者外周血單個核細胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMCs)中Sirt-1和Hif-1α表達水平的變化,以期闡明PBMCs中Sirt-1和Hif-1α表達水平是否與COPD嚴重程度相關,為深入研究PBMCs、Sirt-1和Hif-1α在COPD疾病發(fā)生中的作用提供實驗依據(jù)，同時也為COPD的干預治療提供新思路。

1　資料與方法

1.1研究對象 選擇2012年10月—2013年4月寧夏醫(yī)科大學總醫(yī)院呼吸內科收治的20例COPD急性加重期患者，其中男性13例，女性7例，年齡為48～74 歲，平均年齡(67.6±8.3)歲；COPD穩(wěn)定期患者選擇相同醫(yī)院相同科室門診患者22例，男性14例，女性8例，年齡為50～75歲，平均年齡(65.6±7.3)歲。COPD患者的診斷分期、分級均符合中華醫(yī)學會呼吸病學分會制訂的COPD診治標準[7]，患者均不伴有腫瘤、糖尿病、自身免疫性疾病、結核病、肝腎疾患、消化系統(tǒng)和泌尿系統(tǒng)等感染及左心衰的臨床表現(xiàn)。另外選取同期于該院進行體檢的健康成年人 20名作為對照組，其中男性13名，女性7名，年齡為50～73歲，平均年齡(66.5±7.6)歲。3組觀察對象年齡、性別等基線資料比較差異無統(tǒng)計學意義，組間具有可比性(P>0.05)。

1.2主要試劑 Ficoll-Pague淋巴細胞分離液(美國Life公司)；Trizon試劑和反轉錄試劑盒(美國Invitron公司)；SYBR Premix Ex TaqⅡ(Takara 大連寶生物生物工程有限公司)；總蛋白提取試劑盒和BCA法蛋白濃度測定試劑盒(上海貝博生物科技有限公司)；Sirt-1和Hif-1α(美國Santa Cruz公司)；Sirt-1、Hif-1和β-Actin 引物由上海生工生物工程有限公司合成。

1.3研究對象肺功能的測試采用德國耶格公司生產(chǎn)的MSPET肺功能儀進行檢測,質控達到ATS標準。測定前24 h患者不使用支氣管舒張劑。肺容量測定用氦氣法。記錄第 1 秒用力呼氣容積(forced expiration volume in one second,FEV1)占預計值百分比(FEV1%)、第 1 秒用力呼氣容積與用力肺活量(forced vital capacity,FVC)的比值(FEV1/FVC%)。

1.4研究對象PBMCs提取所有血標本均取自受試者的肘靜脈,其中COPD急性加重期組標本于患者住院當天采集。取10 mL EDTA-K2抗凝的全血，加入等體積Hank’s液中稀釋，沿試管壁輕輕倒入預先裝有10 mL Ficoll-Pague淋巴細胞分離液，2 000 r·min-1離心30 min，收集血漿層與Ficoll-Pague層之間的單個核細胞層，用3 mL PBS緩沖液1 200 r·min-1離心10 min，洗滌細胞2次，收集細胞沉淀，即為PBMCs。細胞分為兩部分，分別用于提取RNA和細胞蛋白。

1.5Real-time PCR法檢測研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1 mRNA表達水平 采用Trizol試劑提取各組細胞總RNA，核酸蛋白分析儀測定260和280 nm處的吸光度(A)值及總RNA濃度。各組分別取 2 μg總RNA，按照常規(guī)方法進行反轉錄反應后，cDNA產(chǎn)物置于-20℃保存。qPCR反應體系包括：cDNA 4 μL、2×SYBR Master Mix 12.5 μL、引物各 1 μL、Tap酶0.15 μL、三蒸水6.35 μL。反應條件為：95℃預變性 3 min，95℃變性 20 s、60℃退火 30 s、72℃延伸 20 s，循環(huán) 35 次。實驗重復 3 次，閾值循環(huán)(threshold cycle,Ct)值取平均值，采用2-△△Ct法計算研究對象的PBMCs中Sirt-1、Hif-1α mRNA相對表達水平。各組Sirt-1和Hif-1α mRNA 的相對表達量:ΔCT =CT目的基因-CTGAPDH，ΔΔCT =CTCOPD-CT對照組，基因相對表達差異量= 2-ΔΔCT。Sirt-1和Hif-1 基因 Real-time PCR引物序列見表1。

表1Sirt-1和Hif-1α 基因Real-time PCR引物序列

Tab.1Real-time PCR primer sequences of Sirt-1 and Hif-1 gene

GenePrimersequenceSirt-1Forword:5'-CAAAGGAGCAGATTAGTAGGCG-3'Revise:5'-CTCTGGCATGTCCCACTATCAC-3'Hif-1Forword:5'-TTGCTCATCAGTTGCCACTTCC-3'Revise:5'-AGCAATTCATCTGTGCTTTCATGTC-3'β-ActinForword:5'-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3'Revise:5'-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3'

1.6Western blotting法檢測研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1 蛋白表達水平收集的各組細胞，用蛋白裂解液(加入蛋白酶抑制劑)于冰上裂解 30 min后，4℃、12 000 r·min-1離心 15 min，吸取上清，用Bradford 法進行蛋白定量，根據(jù)蛋白濃度，每組取80 μg蛋白，加入5×SDS 上樣緩沖液，95℃煮沸10 min使蛋白變性，于-80℃保存?zhèn)溆谩Ｈ「鹘M蛋白進行十二烷基磺酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，然后電轉移至 0.22 μm 的PVDF膜上。5% BSA封閉2 h，采用 1∶1 000 稀釋的 Sirt-1、Hif-1 一抗4℃孵育過夜，用TBST振搖洗膜10 min×3次，以1∶5 000 稀釋的羊抗兔生物素標記二抗，室溫孵育1 h后，再次用TBST振搖洗膜10 min×3次。ECL底物化學發(fā)光顯色。采用Image lab 軟件進行條帶分析，以目的條帶面積灰度值與β-actin條帶面積的比值作為目的蛋白的相對表達水平。

2　結　果

2.13 組研究對象的肺功能指標對照組、COPD急性加重期組和COPD穩(wěn)定期組研究對象的性別、年齡、吸煙指數(shù)等比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。與對照組比較，COPD急性加重期和COPD穩(wěn)定期組患者FEV1%和FEV1/FVC%明顯降低(P<0.05或P<0.01)。與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性重期組患者FEV1%和FEV1/FVC%降低(P<0.05)。3 組研究對象的肺功能指標見表2。

表2各組研究對象的肺功能指標

GroupnFEV1%FEV1/FVC%Control20105.1±2.184.6±0.8StablestageofCOPD2266.2±3.0*61.1±1.1*Acuteexacerbation stageofCOPD2046.6±3.2**△47.2±1.3**△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with stable stage of COPD group.

2.23 組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α mRNA表達水平與對照組比較，COPD穩(wěn)定期和急性加重期患者PBMCs中Sirt-1 mRNA的表達水平均下調，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05或P<0.01)，COPD急性加重期患者PBMCs中Sirt-1的下調更加明顯(P<0.01)；與對照組比較，COPD患者PBMCs中Hif-1α mRNA表達水平上調(P<0.05或P<0.01)，COPD急性加重期患者PBMCs中Hif-1α mRNA表達水平上調更加明顯(P<0.01)。與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性加重期組患者PBMCs中Sirt-1 mRNA表達水平降低，Hif-1α mRNA表達水平升高(P<0.05)。見表 3。

2.33 組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α 蛋白表達水平與對照組比較，COPD穩(wěn)定期和急性加重期患者PBMCs中Sirt-1蛋白表達水平均下調(P<0.05或P<0.01)，COPD急性加重期患者表達水平下調更加明顯(P<0.01)；與對照組比較，COPD穩(wěn)定期和急性加重期患者PBMCs中Hif-1α 蛋白表達水平均上調(P<0.05或P<0.01)，COPD急性加重期患者上調更加明顯(P<0.01)。與COPD穩(wěn)定期組比較，COPD急性加重期組患者PBMSC ss中Sirt-1蛋白表達水平降低，Hif-1α 蛋白表達水平升高(P<0.05)。見圖1和表4。

表3各組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α mRNA表達水平

GroupnSirt-1mRNAHif-1mRNAControl201.00±0.061.00±0.08StablestageofCOPD220.70±0.11*1.36±0.18*Acuteexacerbation stageofCOPD200.50±0.07**△1.89±0.13**△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group；△P<0.05 compared with stable stege of COPD group.

2.4Sirt-1和Hif-1α 表達水平與肺功能指標的相關性分析 經(jīng) Pearson直線相關法分析，Sirt-1 mRNA(蛋白)表達水平與患者肺功能指標FEV1%和FEV1/FVC%呈正相關關系；Hif-1α mRNA(蛋白)表達水平與患者肺功能指標FEV1%和FEV1/FVC%呈顯著負相關關系。見表5。

Lane 1,2: Control group;Lane 3,4: Stable stage of COPD group;Lane 5,6: Acute exacerbation stage of COPD group.

圖1Western blotting法檢測各組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α 蛋白表達電泳圖

Fig.1Electrophoregram of expressions of Sirt-1 and Hif-1α proteins in PBMCs of objects in various groups detected by Western blotting method

3　討　論

COPD是一種以不完全可逆的氣流受限為特征的肺部慢性疾病，是以產(chǎn)生低氧血癥為后果的常見病、多發(fā)病。COPD的發(fā)生涉及多種病因、多種因素。近年來關于機體中一些炎性介質、細胞因子、血液和血管內皮細胞功能異常等在COPD發(fā)生發(fā)展過程中的作用逐漸引起研究者的重視[1-8]。

表4各組研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α 蛋白表達水平

GroupnSirt-1proteinHif-1proteinControl200.352±0.0670.147±0.072StablestageofCOPD220.236±0.085*0.241±0.057*Acuteexacerbation stageofCOPD200.137±0.038**△0.461±0.084**△

*P<0.05,**P<0.01 compared with control group;△P<0.05 compared with stable stage of COPD group.

表5Sirt-1和Hif-1α mRNA(蛋白)表達水平與FEV1%及 FEV1/FVC%的相關性

Tab.5Correlations between expression levels of Sirt-1,Hif-1α mRNA (protein) and FEV1% and FEV1/FVC%

LungfunctionrSirt-1mRNA(protein)rHif-1αmRNA(protein)FEV1%0.611(0.545)-0.812(-0.781)FEV1/FVC%0.513(0.491)-0.661(-0.674)

Sirt-1作為一種NAD+依賴的組蛋白/非組蛋白去乙酞化酶，在酵母中，Sirt-1連同與其相互作用的幾個蛋白質在基因沉默、基因組穩(wěn)定性、細胞壽命和代謝調節(jié)方面起不可缺少的作用。研究[2]顯示：Sirt-1與代謝綜合征(如糖尿病)、基因穩(wěn)定性(DNA損傷)、腫瘤發(fā)生和神經(jīng)退行性疾病(阿爾茨海默氏病、帕金森病)的發(fā)生有關聯(lián)。研究[9]顯示：在胰島組織中，在氧化應激條件下，Sirt-1與叉頭轉錄因子(FOXO)蛋白結合加強抗氧化應激作用。Sirt-1與FOXO蛋白、P53蛋白相互作用，對抗多種DNA 損傷，維持基因穩(wěn)定性[2]。在心血管方面，有研究[10-11]顯示：Sirt-1可上調血管內皮細胞一氧化氮合酶(eNOS)表達和活性，調節(jié)內皮細胞的功能，還可通過影響肝臟和巨噬細胞中膽固醇代謝，進而影響動脈粥樣硬化的發(fā)生。Sirt-1與呼吸系統(tǒng)疾病的關系方面，Rajendrasozhan等[3]發(fā)現(xiàn)：COPD患者肺組織中Sirt-1表達水平呈下降趨勢。Hwang等[4]發(fā)現(xiàn)：Sirt-1通過PARP-1作用調節(jié)煙霧所致的肺內皮細胞、纖維細胞和巨噬細胞的吞噬功能。

Hif由Hif-1 和Hif-2 2個亞基組成，其中Hif-1 作為功能亞基發(fā)揮作用[13]。Hif-1是一種轉錄因子蛋白，能夠調節(jié)炎癥、缺氧和腫瘤相關等近百種靶基因的表達[14-15]，關于Hif-1 與肺血管重塑、肺動脈高壓形成及COPD產(chǎn)生的關系，已有較多的文獻報道[16-19]。

寧夏回族自治區(qū)地處我國的西北高原地區(qū)，此處COPD是一種常見病、多發(fā)病。本研究以COPD穩(wěn)定期和急性加重期患者為對象，提取其PBMCs，觀察研究對象PBMCs中Sirt-1和Hif-1α 的表達水平，結果顯示：COPD患者中Sirt-1的表達水平下調，尤其在急性加重期患者中下調更明顯；而COPD患者Hif-1α 的表達水平上升，而且也是在急性加重期患者中上升更明顯，這一結果與國內王宗強等[20]研究結果一致。

綜上所述，本文作者認為：Sirt-1和Hif-1α 基因在COPD的產(chǎn)生及其病理改變中發(fā)揮了一定的作用，二者的表達水平與COPD的病情程度存在密切的關聯(lián)。研究[6,9,12]顯示：Sirt-1能夠影響Hif-1 、Hif-2 和金屬蛋白酶9(MMP-9)的表達，而且在體外培養(yǎng)的細胞中，Sirt-1能夠與Hif-1和Hif-2 相互作用，使后者去乙酰化并激活，調節(jié)細胞對缺氧的反應。因此本文作者推測：在缺氧的條件下，Sirt-1的表達水平下調，減弱了其對Hif-1α的活性或表達抑制作用，促進了Hif-1α的表達及其活性變化。關于Sirt-1是否真正參與調節(jié)Hif-1α表達及活性、Sirt-1和Hif-1α二者表達水平的變化與COPD形成及病變程度的具體機制，有待于進一步深入探索。

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Expressions of Sirt-1 and Hif-1α in peripheral blood mononuclear cells of patients with chronic obstructive pulmonary disease and their significances

LI Fang1,GUAN Wenxia2,REN Fei2,TONG Xuexia2,SUN Yuning3

(1. Department of Respiratory and Critical Care Medicine,General Hospital, Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China;2.Graduate School，Ningxia Medical University, Yinchuan 750004,China; 3. Department of Biochemistry and Molecular Biology, Ningxia Medical University,Yinchuan 750004,China)

ObjectiveTo investigate the expressions of silent information regulator 1 (Sirt-1) and hypoxia-inducible factor 1α (Hif-1α) in peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) of the chronic obstructive pulmonary disease (COPD) patients,and to clarify their potential roles in the occurrence and development of COPD.Methods42 patients with COPD in acute exacerbation stage (n=20) and in stable stage (n=22) and 20 healthy people were chosen.The lung function indexes of all cases were examined by lung function machine.The expressions of Sirt-1 and Hif-1α mRNA and protein in PBMCs of the objects in various groups were measured by Real-time PCR and Western blotting method． The relationships between the expression levels of Sirt-1 and Hif-1α and lung function were analyzed.Results Compared with control group,the calculated ratios of forced expiration volume in one second to predicted volume (FEV1%) and the the calculated ratios of forced expiration volume in one second to forced vital capacity (FEV1/FVC%) of the patients with COPD in stable stage and acute exacerbation stage were significantly decreased (P<0.05);compared with the patients in stable stage of COPD group,the FEV1and FEV1/FVC% of the patients with COPD in acute exacerbation stage group were decreased (P<0.05).The expression levels of Sirt-1 mRNA and protein of the patients with COPD in acute exacerbation stage and stable stage were significantly lower than those in control group (P<0.05 orP<0.01);compared with the patients in stable stage of COPD group,the expressions of Sirt-1 mRNA and protein in PBMCs of the patients with COPD in acute exacerbation stage group were decreased(P<0.05);meanwhile,the expression levels of Hif-1α mRNA and protein of COPD patients were significantly higher than those in control group (P<0.05,P<0.01),especially in acute exacerbation stage(P<0.01);compared with the patients in stable stage of COPD group,the expressions of Hif-1α mRNA and protein in PBMSCs of the patients with COPD in acute exacerbation stage group were increased(P<0.05).The Pearson correlation analysis results showed that there were positive correlations between the expression levels of Sirt-1 mRNA (protein) and the FEV1%(rmRNA=0.661，rprotein=0.545) and FEV1/FVC (rmRNA=0.513，rprotein=0.491)(P<0.05),and there were negative correlations between the expression of Hif-1α mRNA (pretein) and FEV1%(rmRNA=-0.812，rprotein=-0.781) and FEV1/FVC(rmRNA=-0.661，rprotein=-0.674) (P<0.05).ConclusionThe expression level of Sirt-1 gene is decreased and the expression level of Hif-1α gene is increased in the patients with COPD,which may be associated with the incidence and pathogenesis of COPD.

silent information regulator 1;hypoxia-inducible factor 1α;chronic obstructive pulmonary disease;peripheral blood mononuclear cells

1671-587Ⅹ(2015)02-0356-06

10.13481/j.1671-587x.20150230

2014-06-10

國家自然科學基金資助課題(81160007)；寧夏回族自治區(qū)科技廳自然科學基金資助課題(NZ11204)

李芳(1972-)，女，寧夏回族自治區(qū)銀川市人，副主任醫(yī)師，醫(yī)學碩士，主要從事缺氧性肺病與呼吸道感染方面的研究。

孫玉寧，教授，碩士研究生導師(Tel:0951-6980113,E-mail：sunraining2008@hotmail.com)

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