余志云，李蘊(yùn)潛，陳　勇，趙麗艷，劉煥兵，王　楠，王　斌，陳云照，趙　剛

(1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

替莫唑胺聯(lián)合二甲雙胍對(duì)膠質(zhì)瘤干細(xì)胞的清除作用及其機(jī)制

余志云1，李蘊(yùn)潛1，陳勇1，趙麗艷2，劉煥兵1，王楠1，王斌1，陳云照1，趙剛1

(1. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院神經(jīng)外科，吉林 長(zhǎng)春 130021；2. 吉林大學(xué)第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，吉林 長(zhǎng)春 130021)

目的：探討替莫唑胺(TMZ)聯(lián)合二甲雙胍(MET)對(duì)體外膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(GSCs)的清除作用，探討其作用機(jī)制。方法：神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞，免疫熒光法鑒定GSCs。收集GSCs，以對(duì)照液、不同濃度TMZ、MET和TMZ+MET作用細(xì)胞，分為對(duì)照組、TMZ組、MET組和TMZ+MET組。顯微鏡下計(jì)數(shù)各組二次神經(jīng)球的數(shù)量；CCK-8法檢測(cè)各組GSCs增殖抑制率；流式細(xì)胞術(shù)和Annexin-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)GSCs各細(xì)胞周期百分比和凋亡率。結(jié)果：與對(duì)照組比較，TMZ+MET組二次神經(jīng)球數(shù)量以濃度依賴(lài)的方式減少；與TMZ和MET組比較，TMZ+EMT組二次神經(jīng)球數(shù)量明顯減少(P<0.01)。與對(duì)照組比較，TMZ和MET組GSCs增殖抑制率升高；TMZ+MET組GSCs增殖抑制率高于TMZ或MET組，聯(lián)合指數(shù)(CI)小于1。流式細(xì)胞術(shù)，與TMZ和MET組比較，TMZ+MET組G2/M期GSCs百分比明顯升高(P<0.05)；TMZ+MET組GSCs凋亡率明顯高于TMZ和MET組(P<0.05)。結(jié)論：TMZ聯(lián)合MET在體外能抑制GSCs的連續(xù)自我更新能力并清除GSCs,其機(jī)制可能與阻滯GSCs細(xì)胞周期進(jìn)展和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡有關(guān)聯(lián)。

替莫唑胺；二甲雙胍；膠質(zhì)瘤干細(xì)胞；自我更新

膠質(zhì)瘤是中樞神經(jīng)系統(tǒng)最常見(jiàn)的原發(fā)性惡性腫瘤，目前標(biāo)準(zhǔn)治療方案包括手術(shù)和術(shù)后放化療。由于膠質(zhì)瘤細(xì)胞向周?chē)M織的侵襲性生長(zhǎng)，手術(shù)難以徹底切除腫瘤，多數(shù)患者術(shù)后復(fù)發(fā)，預(yù)后不良[1]?；熓悄z質(zhì)瘤重要的輔助治療手段。替莫唑胺(temozolomide,TMZ)是目前治療惡性膠質(zhì)瘤最重要的一線(xiàn)化療藥物，盡管在膠質(zhì)瘤治療中取得一定療效，但對(duì)惡性膠質(zhì)瘤的有效率不足45%，患者長(zhǎng)期生存率仍然很低[2]，因此如何提高TMZ的療效是亟待解決的問(wèn)題。近年從人類(lèi)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織及膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中分離得到了膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioblastoma stem cells,GSCs)，或稱(chēng)為膠質(zhì)瘤干細(xì)胞樣細(xì)胞(glioblastoma stem-like cells)[3]。GSCs在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥和復(fù)發(fā)中起關(guān)鍵作用，已成為治療的重要新靶點(diǎn)[3-4]。近年多項(xiàng)研究[5]證明二甲雙胍(metformin,MET)能選擇性靶向并殺滅多種腫瘤干細(xì)胞，阻抑其自我更新和體內(nèi)成瘤能力。雖然已有研究[3]證明TMZ治療后膠質(zhì)瘤再生長(zhǎng)的細(xì)胞來(lái)源是GSCs，高濃度TMZ能選擇性殺滅GSCs，然而有關(guān)MET與TMZ聯(lián)合應(yīng)用對(duì)GSCs影響目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究觀察TMZ聯(lián)合MET對(duì)GSCs自我更新、增殖、周期和凋亡的影響，為探討有效且臨床實(shí)用的膠質(zhì)瘤化療策略提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細(xì)胞和主要試劑人惡性膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞購(gòu)自南京凱基生物公司。DMEM培養(yǎng)基、Neurobasal培養(yǎng)基(NBM)、B27、N2、glutaMAX、肝素和胰蛋白酶購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)、青霉素、鏈霉素和谷氨酰胺購(gòu)自美國(guó)Hyclone公司；重組人堿性成纖維生長(zhǎng)因子(recombinant human FGF-basic，bFGF)、重組人表皮生長(zhǎng)因子(recombinant human epidermal growth factor，EGF)購(gòu)自美國(guó)PeproTech公司；多聚賴(lài)氨酸、牛血清白蛋白(bull serum albumin，BSA)、Accutase消化液、TMZ和MET購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；GSCs表面標(biāo)記物兔抗人CD133單抗、小鼠抗人Nestin單抗、GSCs分化標(biāo)志物兔抗人膠質(zhì)原纖維酸性蛋白(GFAP)多抗、鼠抗人β微管蛋白Ⅲ(β-tubulin Ⅲ)多抗、DAPI和FITC標(biāo)記的山羊抗兔及PE標(biāo)記的兔抗小鼠二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司；CCK-8細(xì)胞增殖試劑盒購(gòu)自碧云天公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin V)和碘化丙啶(PI)凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)BD公司。

1.2細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將U87細(xì)胞接種于DMEM培養(yǎng)基(含10%FBS，100 U·mL-1青-鏈霉素，2 mmol·L-1谷氨酰胺)，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U87細(xì)胞用胰酶消化后，接種于NBM完全培養(yǎng)基(含1×B27，1×N2，1×glutaMAX，2 mg·L-1肝素，20 μg·L-1bFGF，20 μg·L-1EGF，100 U·mL-1青-鏈霉素)，置于37℃、5% CO2飽和濕度孵箱內(nèi)培養(yǎng)。每2～3 d換液1次并添加新鮮EGF和bFGF，待懸浮生長(zhǎng)的神經(jīng)球直徑達(dá)到200～300 μm時(shí)，用Accutase消化液將神經(jīng)球消化成單個(gè)細(xì)胞，按1∶2或1∶3比例傳代。

1.3CSCs的鑒定將收集的神經(jīng)球接種于無(wú)菌多聚賴(lài)氨酸包被的載玻片上，加入10%FBS繼續(xù)培養(yǎng)8 h，待貼壁牢固后，以4%多聚甲醛固定30 min，0.1%Triton X-100孵育，5%BSA封閉。加入兔抗人CD133單抗、小鼠抗人Nestin單抗、兔抗人GFAP和鼠抗人β-tubulinⅢ，4℃孵育過(guò)夜后，分別加入FITC標(biāo)記的山羊抗兔二抗及PE標(biāo)記的兔抗小鼠二抗，常溫下孵育1 h，最后用DAPI染核5 min，0.01 mol·L-1PBS洗3次，熒光共聚焦顯微鏡下觀察GSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)情況。為了鑒定GSCs的多向分化潛能，將神經(jīng)球接種至含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)7 d，然后按上述方法染色，熒光共聚焦顯微鏡下觀察GSCs分化標(biāo)志物的表達(dá)情況。

1.4二次神經(jīng)球形成數(shù)量的檢測(cè)收集形成的原代神經(jīng)球，用Accutase消化液消化分散為單個(gè)細(xì)胞后，按5×103接種于96孔板，NBM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，設(shè)對(duì)照組(不加TMZ和MET)，其他各組分別加入不同濃度TMZ(0.1、0.2、0.4和0.8 mmol·L-1)、MET(5、10、20和40 mmol·L-1)和同樣劑量TMZ+MET處理細(xì)胞，分別為T(mén)MZ、MET和TMZ+MET組，每2 d補(bǔ)充N(xiāo)BM完全培養(yǎng)基0.02 mL。7 d后倒置顯微鏡下計(jì)數(shù)懸浮生長(zhǎng)的二次神經(jīng)球形成的數(shù)量。

1.5細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)收集生長(zhǎng)良好的神經(jīng)球，用Accutase消化液消化分散后，按5×103接種于96孔板，NBM完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)。同步化培養(yǎng)24 h后，設(shè)對(duì)照組(不加TMZ+MET)，其他各組分別加入TMZ(0.025～3.200 mmol·L-1)或MET(1.25～160.00 mmol·L-1)，作用69 h，加入10%CCK-8試劑再孵育3 h后，酶標(biāo)儀測(cè)450 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A450)值。同時(shí)進(jìn)行另一組平行對(duì)照實(shí)驗(yàn)，即TMZ和MET按上述藥物濃度以1∶50的比例處理GSCs。應(yīng)用CalcuSyn軟件(Biosoft,英國(guó))計(jì)算兩藥聯(lián)合指數(shù)(combination index,CI)[6]。如果CI<1，提示有協(xié)同作用；CI=1，提示相加作用；CI>1，提示拮抗作用[6]。

1.6細(xì)胞周期百分比檢測(cè)同步化培養(yǎng)的GSCs經(jīng)不同因素(不含TMZ和MET的DMSO對(duì)照液、0.4 mmol·L-1TMZ、20 mmol·L-1MET和TMZ+MET)處理48 h后(分別為對(duì)照組、TMZ組、MET組和TMZ+MET組)，收集細(xì)胞，PBS洗滌2次，懸浮于預(yù)冷的70%酒精-20℃固定過(guò)夜。重懸細(xì)胞于PBS中，加入100 mg·L-1RNA酶37℃孵育30 min，然后加入100 mg·L-1PI避光繼續(xù)37℃孵育30 min，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞G0、G0/G1、S、G2/M期百分比，采用ModFit LT 3.3 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.7Annexin-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率同步化培養(yǎng)的GSCs經(jīng)不同因素(不含TMZ和MET的DMSO對(duì)照液、0.4 mmol·L-1TMZ、20 mmol·L-1MET及TMZ+MET)處理48 h(分別為對(duì)照組、TMZ組、MET組和TMZ+MET組)，收集細(xì)胞，按凋亡試劑盒說(shuō)明書(shū)處理細(xì)胞后，Annexin-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)正常、早期和晚期細(xì)胞的凋亡率，采用FACSDiva 6.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2　結(jié)　果

2.1神經(jīng)球形成和GSCs的鑒定人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞接種到NBM培養(yǎng)基后，3～4 d開(kāi)始形成神經(jīng)球，約1周神經(jīng)球體積明顯增大，每個(gè)神經(jīng)球約含100～200個(gè)神經(jīng)細(xì)胞。將初代神經(jīng)球消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，再置于完全NBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，均能形成2代神經(jīng)球，說(shuō)明這些細(xì)胞具有自我更新能力。神經(jīng)球能表達(dá)GSCs的表面標(biāo)志物CD133(圖1 A～C,見(jiàn)插頁(yè)五)和Nestin(圖1 D～F,見(jiàn)插頁(yè)五)，基本不表達(dá)星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和神經(jīng)元標(biāo)記物β-TubulinⅢ，表明這些細(xì)胞是未分化的GSCs。神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)3～4 d即可見(jiàn)細(xì)胞呈明顯分化狀態(tài)，約7 d時(shí)與正常培養(yǎng)U87細(xì)胞的形態(tài)無(wú)明顯區(qū)別，多數(shù)細(xì)胞表達(dá)GFAP，部分細(xì)胞表達(dá)β-TubulinⅢ(圖1 G和H，見(jiàn)插頁(yè)五)，而極少數(shù)細(xì)胞表達(dá)CD133和Nestin。

2.2各組二次神經(jīng)球形成數(shù)量將原代形成的神經(jīng)球消化分散為單個(gè)細(xì)胞后，分別加入不同濃度TMZ和MET，隨著藥物濃度的提高，二次神經(jīng)球形成的數(shù)量明顯減少(P<0.05)，神經(jīng)球的體積也較對(duì)照組明顯縮小。TMZ+MET組二次神經(jīng)球形成數(shù)量少于各單藥組(P<0.05)，見(jiàn)表1。

表1各組二次神經(jīng)球數(shù)量

GroupDose(mmol·L-1)No.ofneurosphereControl0.0151±5 TMZ0.198±3*0.246±3*0.415±2*0.80±0*MET5.090±4*10.040±2*20.012±1*40.0 0±0*TMZ+MET0.1+5.040±4*0.2+10.020±3*0.4+20.0 3±1*0.8+40.0 0±0*

*P<0.05 compared with control group.

2.3各組GSCs增殖抑制曲線(xiàn)TMZ(0.025～3.200 mmol·L-1)或MET(1.25～160.00 mmol·L-1)單藥對(duì)GSCs增殖有抑制作用，且隨著藥物濃度的升高而增強(qiáng)。TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用對(duì)GSCs增殖的抑制作用明顯強(qiáng)于對(duì)照組，TMZ+MET組CI小于1，表明TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同抑制GSCs增殖。見(jiàn)圖2。

2.4各組GSCs細(xì)胞周期百分比與對(duì)照組比較，TMZ主要使GSCs阻滯在G2/M期，MET也可GSCs處于G2/M期百分比有所升高；與TMZ組或MET組比較，TMZ+MET組GSCs阻滯在G2/M期百分比顯著升高(P<0.05)。見(jiàn)圖3(插頁(yè)五)和表2。

圖2　各組GSCs增殖抑制曲線(xiàn)

Fig.2Curves of proliferation inhibition of GSCs in various groups

表2　各組GSCs細(xì)胞周期的百分比

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with TMZ group;#P<0.05 compared with MET group.

2.5各組GSCs凋亡率Annexin-PI雙染流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)，與TMZ和MET組比較，TMZ+MET組GSCs凋亡率明顯升高(P<0.05)，表明TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用能誘導(dǎo)GSCs凋亡，作用明顯強(qiáng)于TMZ組和MET組。見(jiàn)圖4和表3。

3　討　論

腫瘤干細(xì)胞理論認(rèn)為：腫瘤干細(xì)胞不僅在腫瘤起動(dòng)和進(jìn)展中起決定性作用，也是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和常規(guī)治療抵抗的根源。因此，靶向清除腫瘤干細(xì)胞已成為根治腫瘤的關(guān)鍵。GSCs是惡性膠質(zhì)瘤組織中數(shù)量很少的特殊細(xì)胞，具有自我更新、多向分化、體內(nèi)成瘤能力和對(duì)化放療高度耐受等特點(diǎn)，在膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展、耐藥及復(fù)發(fā)中起著決定性作用[3-5]，因此清除GSCs可能從源頭上遏制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖，為根治膠質(zhì)瘤提供新的策略。

A:Control group；B:TMZ group；C:MET group；D:TMZ+MET group.

GroupLateapoptoticrate/necrosisEarlyapoptoticrateControl1.16±0.0314.7±1.02TMZ1.44±0.0530.4±2.03*MET3.73±1.2024.5±1.31*TMZ+MET6.23±0.94*△55.5±2.58*△#

*P<0.05 compared with control group;△P<0.05 compared with TMZ group;#P<0.05 compared with MET group.

CD133和Nestin是GSCs最重要的表面標(biāo)記物[7]。本實(shí)驗(yàn)采用無(wú)血清培養(yǎng)法，從人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞中成功分離出CD133+及Nestin+神經(jīng)球，這些細(xì)胞基本不表達(dá)星形細(xì)胞標(biāo)記物GFAP和神經(jīng)元標(biāo)記物β-TubulinⅢ，表明本實(shí)驗(yàn)分離的細(xì)胞是未分化的GSCs。將神經(jīng)球轉(zhuǎn)移到含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)后，又可見(jiàn)細(xì)胞呈分化狀態(tài)，這符合腫瘤干細(xì)胞的一般特點(diǎn)。

腫瘤干細(xì)胞的自我更新是指在每一次分裂時(shí)均能產(chǎn)生至少1個(gè)相同特征的子代腫瘤干細(xì)胞。自我更新能力是腫瘤干細(xì)胞的重要特性之一，對(duì)維持腫瘤干細(xì)胞的數(shù)量起關(guān)鍵作用，因此檢測(cè)自我更新能力已成為鑒定腫瘤干細(xì)胞的一個(gè)重要指標(biāo)[8]。在體外無(wú)血清懸浮培養(yǎng)條件下神經(jīng)球形成實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)腫瘤干細(xì)胞自我更新能力的經(jīng)典方法[9]。在本研究中，將人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞接種到NBM培養(yǎng)基懸浮培養(yǎng)后形成神經(jīng)球，神經(jīng)球體積逐漸增大，每個(gè)神經(jīng)球約含100～200個(gè)細(xì)胞，說(shuō)明這些神經(jīng)球細(xì)胞具有自我更新能力；原代形成神經(jīng)球消化分散成單個(gè)細(xì)胞后，再置于NBM培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能形成2代神經(jīng)球，進(jìn)一步說(shuō)明這些細(xì)胞具有明顯的自我更新能力[10-11]；將原代神經(jīng)球消化分散為單個(gè)細(xì)胞，經(jīng)TMZ與MET聯(lián)合處理后形成神經(jīng)球的數(shù)量明顯減少，球的體積明顯縮小，其作用較TMZ或MET單藥更為明顯，表明TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用能顯著抑制GSCs的連續(xù)自我更新能力，顯示出明顯清除GSCs的作用。當(dāng)然，欲驗(yàn)證TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用對(duì)GSCs的清除效果，還必須在免疫抑制小鼠體內(nèi)進(jìn)行成瘤試驗(yàn)及再成瘤試驗(yàn)[11]。Soritau等[12]選取8例手術(shù)切除的高級(jí)別膠質(zhì)瘤腫瘤標(biāo)本，從中分離培養(yǎng)腫瘤細(xì)胞并用MET和(或)TMZ處理，結(jié)果顯示：與單用TMZ比較，MET與TMZ聯(lián)合使用能更明顯抑制腫瘤細(xì)胞增殖，這一結(jié)果為本課題深入研究TMZ聯(lián)合MET的抗膠質(zhì)瘤效應(yīng)提供了線(xiàn)索。

本研究結(jié)果表明：TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用能明顯抑制GSCs增殖，其作用明顯強(qiáng)于TMZ或MET單藥，兩藥聯(lián)合的CI<1，表明兩藥聯(lián)合應(yīng)用能協(xié)同抑制GSCs增殖。雖然本研究證明TMZ聯(lián)合MET能協(xié)同抑制GSCs增殖，但通過(guò)何種機(jī)制發(fā)揮這種作用尚不清楚。本研究證明TMZ與MET聯(lián)合處理能明顯增強(qiáng)對(duì)GSCs 的G2/M期的阻滯作用，并誘導(dǎo)GSCs凋亡，這可能是TMZ聯(lián)合MET抑制GSCs增殖的可能機(jī)制。

有關(guān)TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用對(duì)GSCs的清除作用及其機(jī)制目前研究較少。有研究[13]表明：TMZ可以殺滅膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中GSCs，但后來(lái)的研究并未肯定這一作用。因此，在TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用清除GSCs機(jī)制中，TMZ可能的作用尚未確定，而MET可能在其中起主導(dǎo)作用。越來(lái)越多的證據(jù)[5,14-15]表明：MET能選擇性靶向并殺滅多種腫瘤干細(xì)胞，包括乳腺癌、甲狀腺癌、胰腺癌和GSCs等。另外，MET能誘導(dǎo)GSCs分化，分化的GSCs喪失其起動(dòng)腫瘤的性能[11,16-18]。MET能迅速通過(guò)血腦屏障并蓄積在腦實(shí)質(zhì)，已在2型糖尿病治療中應(yīng)用多年，其安全性好，對(duì)非糖尿患者無(wú)降血糖作用。TMZ是目前治療惡性膠質(zhì)瘤的一線(xiàn)化療藥物。將TMZ與MET聯(lián)合應(yīng)用治療膠質(zhì)瘤，具有重要臨床應(yīng)用價(jià)值。當(dāng)然，使用TMZ聯(lián)合MET治療膠質(zhì)瘤還有許多問(wèn)題有待解決，如MET的劑量、用藥時(shí)機(jī)、給藥療程和療效評(píng)價(jià)指標(biāo)等，期待未來(lái)有更多實(shí)驗(yàn)給予驗(yàn)證。

[1]Salgaller ML,Liau LM. Current status of clinical trials for glioblastoma[J]. Rev Recent Clin Trials,2006,1(3):265-281.

[2]Chamberlain MC. Temozolomide:therapeutic limitations in the treatment of adult high-grade gliomas[J]. Expert Rev Neurother,2010,10(10):1537-1544.

[3]Kang SK,Park JB,Cha SH. Multipotent,dedifferentiated cancer stem-like cells from brain gliomas[J]. Stem Cells Dev,2006,15(3):423-435.

[4]Cheng L,Bao S,Rich JN. Potential therapeutic implications of cancer stem cells in glioblastoma[J]. Biochem Pharmacol,2010,80(5):654-665.

[5]李蘊(yùn)潛,趙麗艷,李才. 選擇性靶向腫瘤干細(xì)胞藥物的研究現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)新藥雜志,2013,22(24):2903-2908.

[6]Chou TC,Talalay P. Quantitative analysis of dose-effect relationships:the combined effects of multiple drugs or enzyme inhibitors[J]. Adv Enzyme Reg,1984,22:27-55.

[7]Yoshimoto K, Ma X,Guan Y,et al. Expression of stem cell marker and receptor kinase genes in glioblastoma tissue quantified by real-time RT-PCR[J]. Brain Tumor Pathol,2011,28(4):291-296.

[8]Das S,Srikanth M,Kessler JA. Cancer stem cells and glioma[J]. Nat Clin Pract Neurol,2008,4(8):427-435.

[9]Clarke MF,Dick JE,Dirks PB,et al. Cancer stem cells-perspectives on current status and future directions:AACR workshop on cancer stem cells[J]. Cancer Res,2006,66(19):9339-9344.

[10]Gilbert CA,Daou MC,Moser RP,et al. Gamma-secretase inhibitors enhance temozolomide treatment of human gliomas by inhibiting neurosphere repopulation and xenograft recurrence[J]. Cancer Res,2010,70(17):6870-6879.

[11]Sato A,Sunayama J,Okada M,et al. Glioma-initiating cell elimination by metformin activation of FOXO3 via AMPK[J]. Stem Cells Transl Med,2012,1(11):811-824.

[12]Soritau O,Tomuleasa C,Aldea M,et al. Metformin plus temozolomide-based chemotherapy as adjuvant treatment for WHO grade Ⅲ and Ⅳ malignant gliomas[J]. J BUON,2011,16(2):282-289.

[13]Blough MD,Westgate MR,Beauchamp D,et al. Sensitivity to temozolomide in brain tumor initiating cells[J]. Neurol Oncol,2010,12(7):756-760.

[14]Bao B,Azmi AS,Ali S,et al. Metformin may function as anti-cancer agent via targeting cancer stem cells:the potential biological significance of tumor-associated miRNAs in breast and pancreatic cancers[J]. Ann Transl Med,2014,2(6):59-74.

[15]Würth R,Pattarozzi A,Gatti M,et al. Metformin selectively affects human glioblastoma tumor-initiating cell viability:A role for metformin-induced inhibition of Akt[J]. Cell Cycle,2013,12(1):145-156.

[16]Campos B,Wan F,Farhadi M,et al. Differentiation therapy exerts antitumor effects on stem-like glioma cells[J]. Clin Cancer Res,2010,16(10):2715-2728.

[17]尹豐，張劍寧，趙明明，等.膠質(zhì)瘤干細(xì)胞與神經(jīng)干細(xì)胞基因表達(dá)差異的微陣列基因芯片分析[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2014，39(10)：800-803.

[18]史正華，張劍寧.脂質(zhì)體阿霉素和熱療對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志，2013，38(3)：201-203.

Elimination of temozolomide in combination with metformin on glioma stem cells and its mechanism

YU Zhiyun1,LI Yunqian1,CHEN Yong1,ZHAO Liyan2,LIU Huanbing1,WANG Nan1,WANG Bin1,CHEN Yunzhao1,ZHAO Gang1

(1.Department of Neurosurgery,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021, China；2. Department of Clinical Laboratory,First Hospital,Jilin University,Changchun 130021,China)

ObjectiveTo explore the effect of temozolomide (TMZ) in combination with metformin (MET) on the elimination of glioblastoma stem cells(GSCs)invitro,and to clarify the mechanism. Methods The human glioma U87 cells were cultured in the neural stem cell medium,and the GSCs were identified by immunofluorescence methods；the GSCs were selected and were treated with control solution(control group), different concentrations of TMZ(TMZ group)and MET(MET group) or TMZ combined with MET(TMZ+MET group).The number of secondary neurospheres were counted under microscope, and the inhibitory rate of proliferation of GSCs was detected by CCK-8 assay;flow cytometry and Annexin Ⅴ and PI staining flow cytometry were used to detect the percentage of cell cycle and the apoptotic rate of GSCs，respectively. ResultsCompared with control group， the number of secondary neurospheres in TMZ+MET group was significantly decreased in a concentration-dependent manner;the number of secondary neurosphere in TMZ+MET group was significantly lower than those in TMZ group and MET group(P<0.01).Compared with control group, the inhibitory rates of the proliferation of GSCs in TMZ and MET groups were increased,the inhibitory rate of proliferation of GSCs in TMZ+MET group was higher than those in TMZ group and MET group(P<0.05),and the combination index(CI)<1.The flow cytometry results displayed that the percentage of the cells at G2/M phase in TMZ + MET group was significantly higher than those in TMZ group and MET group(P<0.05)，and the apoptotic rate of GSCs in TMZ+MET group was significantly higher than those in TMZ group and MET group (P<0.05).ConclusionThe combination of TMZ and MET can inhibit the serial self-renewal capability of GSCs as well as eliminate GSCs,and its mechanism may be related to the inhibition of the cell cycle progression of GSCs and induction of apoptosis.

temozolomide; metformin; glioblastoma stem cells; self-renewal

1671-587Ⅹ(2015)02-0321-06

10.13481/j.1671-587x.20150223

2014-12-31

吉林省科技廳科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目資助課題(20140414060GH)

余志云(1987-)，男，湖北省宜昌市人，在讀醫(yī)學(xué)博士，主要從事膠質(zhì)瘤基礎(chǔ)與臨床方面的研究。

李蘊(yùn)潛，教授，主任醫(yī)師，碩士研究生導(dǎo)師 (Tel：0431-88782331，E-mail：13943188080@163.com)；

趙剛，教授，主任醫(yī)師，博士研究生導(dǎo)師(Tel：0431-88782331，E-mail：zhaogang@jdnwk.com)

R730.264

A