楊艷艷，金明華，李艷博，李　陽，王佳慧，鄭　彤，王思惠， 遲翔宇，張宇佳，孫志偉,

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理與衛(wèi)生化學(xué)學(xué)系，北京 100069)

納米SiO2對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞的凋亡誘導(dǎo)作用及其機制

楊艷艷1，金明華1，李艷博2，李陽2，王佳慧1，鄭彤1，王思惠1， 遲翔宇1，張宇佳1，孫志偉1,2

(1.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生檢驗學(xué)教研室，吉林 長春 130021；2.首都醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院衛(wèi)生毒理與衛(wèi)生化學(xué)學(xué)系，北京 100069)

目的：探討納米二氧化硅(SiO2)對人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞凋亡和周期的影響，闡明其作用機制。方法：選取不同濃度粒徑為90 nm的SiO2顆粒作用于SH-SY5Y細胞，分別為0、 3.125、6.250、12.500、25.000、50.000 mg·L-1SiO2組，其中0 mg·L-1組為對照組。MTT法檢測各組SH-SY5Y細胞存活率；采用AO/EB染色和 Annexin Ⅴ-FITC/PI法檢測各組細胞凋亡率；流式細胞術(shù)(FCM)檢測細胞周期百分比和細胞中活性氧(ROS)水平。結(jié)果： MTT檢測，6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞存活率低于對照組 (P<0.05)，12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞存活率低于3.125 mg·L-1SiO2組 (P<0.05)。AO/EB染色和 Annexin V-FITC/PI法檢測，6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率高于對照組(P<0.05)，12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率高于3.125 mg·L-1SiO2組(P<0.05)。FCM檢測，3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞中ROS水平高于對照組 (P<0.05)。25.000和50.000 mg·L-1SiO2組G0/G1期細胞百分比低于3.125 mg·L-1SiO2組和對照組(P<0.05)，50.000 mg·L-1SiO2組G2/M期細胞百分比高于對照組 (P<0.05)。結(jié)論：納米SiO2可降低SH-SY5Y細胞的活力，誘導(dǎo)細胞凋亡，增加細胞中ROS水平，可干擾細胞周期進程，對SH-SY5Y細胞的增殖具有抑制作用。

納米二氧化硅；SH-SY5Y細胞；細胞周期；細胞凋亡

納米二氧化硅(SiO2)在生物醫(yī)藥領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[12]，使人類暴露納米SiO2的機會增加，其生物安全性也引起人們的關(guān)注。有研究[3]顯示：量子點可以經(jīng)過鼻黏膜進入腦組織，分布于嗅球和大腦等部位。納米顆?？赏ㄟ^呼吸道吸入并轉(zhuǎn)移到嗅神經(jīng)，且隨暴露時間的延長，大腦皮層和小腦中納米顆粒水平緩慢增加，證明其可以通過血腦屏障[45]。體外實驗[6-8]結(jié)果表明：納米SiO2可誘導(dǎo)小鼠上皮JB6 細胞、人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)和人的支氣管上皮細胞(BEAS-2B)的活性氧(reactive oxygen species,ROS)產(chǎn)生和細胞凋亡增加，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用。血液中納米顆粒可以通過血腦屏障，在腦組織中可以檢驗到納米顆粒，并對細胞具有一定的毒性作用，但是其具體機制尚不清楚。本研究以人神經(jīng)母細胞瘤SH-SY5Y細胞為靶細胞，觀察暴露于不同濃度納米SiO2條件下細胞的存活率、ROS水平、細胞凋亡率和細胞周期進程的改變，探討納米SiO2對神經(jīng)細胞的作用及其機制，為納米SiO2安全應(yīng)用和神經(jīng)毒性研究提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1細胞、主要試劑和儀器人神經(jīng)母細胞瘤 SH-SY5Y細胞購自中國南京凱基生物發(fā)展有限公司。納米SiO2顆粒平均粒徑為90 nm，由吉林大學(xué)化學(xué)院惠贈，所用粒子在雙蒸水和DMEM培養(yǎng)液中有較好的穩(wěn)定性和分散性，Zeta電位穩(wěn)定，每次用前超聲均質(zhì)化10 min。高糖DMEM培養(yǎng)基、胰蛋白酶(Hyclone公司，美國)，MTT、DMSO(Amresco公司，美國)，Annexin Ⅴ-FITC/PI凋亡試劑盒、ROS檢測試劑盒、細胞周期檢測試劑盒(中國南京凱基生物發(fā)展有限公司)，其他試劑(國藥集團化學(xué)試劑有限公司)。超凈工作臺(Taisite公司，中國)，MCO-18AIC二氧化碳培養(yǎng)箱(Sanyo公司，日本)，酶標儀(Thermo公司，美國)，激光共聚焦顯微鏡(Olympus公司，日本)，F(xiàn)ACS流式細胞儀(Millipore公司，德國)，臺式低溫高速離心機(Eppendorf公司，德國)。

1.2細胞培養(yǎng)與分組SH-SY5Y細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液中， 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱常規(guī)培養(yǎng)，48 h傳代1次。取對數(shù)生長期細胞用含0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，將細胞接種于培養(yǎng)板培養(yǎng)24 h，吸棄原培養(yǎng)液，根據(jù)加入無血清的納米SiO2培養(yǎng)液的濃度進行分組，分別為0、3.125、6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組，其中0 mg·L-1SiO2組為對照組。培養(yǎng)時間為24 h。每組至少3個平行。

1.3MTT法檢測SH-SY5Y細胞存活率取對數(shù)生長期細胞，用含0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，將細胞接種于96孔培養(yǎng)板，密度為5×104mL-1，每孔200 μL，培養(yǎng)24 h，觀察細胞生長狀態(tài)，加入不同濃度的納米SiO2，染毒培養(yǎng)24 h后，每孔加入5 g·L-1MTT 20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清，每孔加入0.15 mL DMSO終止反應(yīng)，振搖10 min溶解結(jié)晶，酶標儀測490 nm吸光度(A)值，細胞存活率=(處理組A值-空白A值)/(對照組A值-空白A值)×100%。

1.4流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率取對數(shù)生長期細胞，6孔培養(yǎng)板內(nèi)接種細胞密度為1×105mL-1，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h，加入不同濃度分散于無血清的DMEM培養(yǎng)液的SiO2顆粒，每組3個平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1次后，用不含EDTA胰蛋白酶消化細胞后，1 000 r·min-1離心5 min，PBS重懸細胞，計數(shù)細胞2×105個，1 000 r·min-1離心5 min棄上清，用0.5 mL Binding buffer重懸細胞，輕吹均勻，每組加5 μL Annexin Ⅴ-FITC混勻，后加入5 μL PI 混勻，室溫避光孵育15 min后，流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡率，結(jié)果以百分率表示。

1.5丫啶橙-溴化乙錠(AO/EB)染色檢測細胞凋亡率取對數(shù)生長期細胞，24孔板內(nèi)接種細胞密度為1×105mL-1，每孔0.5 mL，培養(yǎng)24 h后，染毒劑量同上，每組4個平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，將現(xiàn)配好的100 mg·L-1溶于PBS的吖啶橙和100 mg·L-1溶于PBS的溴化乙錠各5 μL混勻后加入每孔，用熒光顯微鏡觀察，計取5個視野、共100個細胞中凋亡細胞數(shù)，凋亡細胞率=凋亡細胞數(shù)/總細胞數(shù)×100%。

1.6流式細胞術(shù)檢測細胞中ROS水平取對數(shù)生長期細胞接種于6孔培養(yǎng)板，細胞密度為1×105mL-1，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h，給予不同濃度的納米SiO2，每組3個平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，用無血清培養(yǎng)液將DCFH-DA稀釋。終濃度為10 μmol·L-1，每孔加入1 mL，將細胞完全覆蓋，37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育20 min，無血清培養(yǎng)液洗滌3次，去除未結(jié)合的DCFH-DA殘留干擾，用不含EDTA胰酶消化細胞，1 000 r·min-1離心5 min，PBS洗滌細胞1次，1 000 r·min-1離心5 min，用PBS重懸細胞，采用流式細胞術(shù)檢測細胞的平均熒光強度即細胞中ROS水平。

1.7流式細胞術(shù)檢測細胞周期百分比6孔培養(yǎng)板接種細胞密度為1×105mL-1，每孔2 mL，培養(yǎng)24 h，給予不同濃度的無血清的納米SiO2，每組3個平行，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，吸棄培養(yǎng)液，PBS洗1次，胰酶消化細胞后，1 000 r·min-1離心5 min棄上清，PBS洗滌1次，離心棄上清，少量PBS重懸細胞，計取106個細胞用-20℃預(yù)冷的70%乙醇0.5 mL于4℃固定細胞48 h。染色前，1 000 r·min-1離心5 min，棄去固定液，PBS洗滌2次，除去固定劑，加入0.1 mL RNase 混勻，37℃水浴30 min，加入0.4 mL PI混勻4℃避光染色 30 min，流式細胞術(shù)檢測各細胞周期百分比(G0/G1、S和G2/M期)。

2　結(jié)　果

2.1各組SH-SY5Y細胞存活率MTT檢測，納米SiO2作用于SH-SY5Y細胞后，隨著暴露劑量的升高，細胞存活率下降，與對照組比較，6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞存活率明顯下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。與3.125 mg·L-1SiO2組比較，12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞存活率下降(P<0.05)。見表1。

表1各組SH-SY5Y細胞存活率

GroupA490valueSurvivalrate(η/%)Control0.449±0.023100.0±0.0 SiO2(mg·L-1) 3.1250.444±0.04797.7±1.1 6.2500.410±0.020*91.7±1.1* 12.5000.375±0.041*△87.3±4.1*△ 25.0000.368±0.035*△84.3±4.0*△ 50.0000.342±0.012*△79.7±6.3*△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vs3.125 mg·L-1SiO2group.

2.2各組SH-SY5Y細胞凋亡率Annexin Ⅴ-PITC/PI檢測，隨著染毒劑量的增加，細胞凋亡率增加，與對照組比較，6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；與3.125 mg·L-1SiO2組比較，12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率增加(P<0.05)；AO/EB染色檢測，隨著染毒劑量的增加，橙染的凋亡細胞逐漸增多，其中6.250、12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率均高于對照組(P<0.05)；與3.125 mg·L-1SiO2組比較，12.500、25.000和50.000 mg·L-1SiO2組細胞凋亡率增加(P<0.05)。見表2和圖1(插頁二)。

2.3各組SH-SY5Y細胞中ROS水平流式細胞術(shù)檢測，各濃度納米SiO2作用于SH-SY5Y細胞24 h，細胞中的ROS水平分別為65.26±0.60(對照組)、77.22±3.87、77.48±3.07、81.26±4.63、87.51±6.41和88.80±6.45，隨著暴露劑量的增加，ROS水平升高，6.250，12.500，25.000，50.000 mg·L-1SiO2組ROS水平高于對照組(P<0.05)。見圖2。

2.4各組SH-SY5Y細胞周期百分比細胞周期檢測，隨著暴露劑量的增加，細胞G0/G1期百分比減少，25.000和50.000 mg·L-1SiO2組G0/G1期百分比低于對照組和3.125 mg·L-1SiO2組(P<0.05)。50.000 mg·L-1SiO2組G2/M期百分比高于對照組和3.125 mg·L-1SiO2組(P<0.05)。見表3。

表2各組SH-SY5Y細胞凋亡率

GroupApoptoticrate(η/%)AnnexinⅤ-FITC/PIAO/EBControl8.92±3.185.0±0.8SiO2(mg·L-1) 3.12511.69±3.196.3±1.2 6.25015.00±1.31*7.0±1.0* 12.50017.55±0.96*△10.3±5.8*△ 25.00021.92±2.52*△16.6±3.7*△ 50.00022.85±2.04*△27.3±4.6*△

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vs3.125 mg·L-1SiO2group.

A:Control group;B-F:3.125,6.250,12.500,25.000， and 50.000 mg·L-1 SiO2 groups.

表3　各組SH-SY5Y細胞各周期百分比

*P<0.05vscontrol group；△P<0.05vs3.125 mg·L-1SiO2group.

3　討　論

納米材料在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，增加了環(huán)境顆粒物質(zhì)進入血液循環(huán)的機會，鑒于其可以通過血腦屏障，納米粒子的神經(jīng)毒性不容忽視?？諝庵械募{米顆粒物質(zhì)主要以氣溶膠的形態(tài)存在，吸入的納米顆?？梢酝ㄟ^神經(jīng)元轉(zhuǎn)移進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)[5]，也可通過呼吸系統(tǒng)的感覺神經(jīng)末梢，進入神經(jīng)節(jié)和神經(jīng)中樞[3]。有研究[9]顯示：納米SiO2可以使斑馬魚幼魚產(chǎn)生神經(jīng)和發(fā)育毒性。因此，本研究以SH-SY5Y細胞為靶細胞，探討90 nm SiO2顆粒對其神經(jīng)細胞的毒性作用及周期進程的影響。

納米粒子的表面電荷、化學(xué)組成、團聚形態(tài)和表面修飾對其生物效應(yīng)有很大影響[10]，本研究采用的90 nm SiO2顆粒，用動態(tài)光散射法檢測粒子在雙蒸水和DMEM培養(yǎng)液中水合粒徑及Zeta電位表明：納米SiO2粒子在雙蒸水和DMEM培養(yǎng)液中分散性和穩(wěn)定性良好，未發(fā)生團聚，48 h粒子水合粒徑及Zeta電位值均較穩(wěn)定。本研究結(jié)果表明：納米SiO2作用于SH-SY5Y細胞24 h，隨著染毒劑量的增加，細胞存活率逐漸降低，呈劑量依賴關(guān)系。細胞存活率的降低可能與細胞的氧化應(yīng)激、細胞膜損傷、細胞周期改變和細胞凋亡有關(guān)聯(lián)。正常情況下，由機體生理過程產(chǎn)生的活性物質(zhì)構(gòu)成的細胞助氧化系統(tǒng)與體內(nèi)存在的抗氧化系統(tǒng)保持動態(tài)平衡。當外源性化學(xué)物質(zhì)進入機體后，可使這一平衡受到破壞引起脂質(zhì)過氧化，膜結(jié)構(gòu)和通透性受到損傷，產(chǎn)生自由基從而使細胞中的ROS水平增加。本研究采用流式細胞術(shù)檢測細胞中ROS水平，隨著納米SiO2暴露劑量的增加，細胞中ROS水平明顯增加，進一步證實了SH-SY5Y細胞存活率的降低可能是由于細胞中ROS產(chǎn)生增加，損傷線粒體，使線粒體膜電位發(fā)生改變，從而使細胞內(nèi)的鈣離子增加，釋放細胞色素C，進而使細胞發(fā)生凋亡。

細胞凋亡是生物體內(nèi)一種主動性的細胞死亡，當機體或細胞受到外來刺激時，會利用細胞凋亡清除多余、衰老和受損傷的細胞，以保持機體和細胞內(nèi)環(huán)境平衡，維持其正常的生理活動。一旦發(fā)生凋亡失衡就可能起癌癥和自身免疫性疾病，神經(jīng)細胞過度凋亡就可以引起如阿爾默海茲病等神經(jīng)退行性疾病。本研究結(jié)果顯示：納米SiO2顆粒可以降低SH-SY5Y細胞存活率，使細胞凋亡率明顯增加，細胞中ROS生成增加并呈劑量依賴關(guān)系。ROS是在細胞有氧代謝過程中產(chǎn)生的，包含氧離子、過氧化氫和含氧自由基，因含有未配對電子，具有很強的化學(xué)活性，其為細胞正常代謝的副產(chǎn)物，對細胞信號傳導(dǎo)保持穩(wěn)定的胞內(nèi)環(huán)境有重要作用，通常ROS的產(chǎn)生與清除保持動態(tài)平衡，但在外界環(huán)境改變時，一旦超出清除能力，可導(dǎo)致細胞中ROS水平增加，引起氧化應(yīng)激、脂質(zhì)過氧化損傷，導(dǎo)致細胞凋亡。研究[11-12]顯示：納米粒子可通過氧化應(yīng)激來誘導(dǎo)細胞凋亡，從而對細胞產(chǎn)生毒性作用。納米材料的比表面積大，表面活性高，與生物活性分子作用后，可引起組織和細胞中ROS大量蓄積，引起細胞膜、糖類和脂質(zhì)過氧化損傷。由于納米SiO2的表面存在大量的羥基，可以與DNA、RNA和蛋白質(zhì)等生物大分子相互作用，產(chǎn)生自由基，引起細胞產(chǎn)生大量的ROS，引起細胞DNA損傷，導(dǎo)致細胞凋亡。這可能是納米SiO2使SH-SY5Y細胞存活率降低、誘導(dǎo)細胞凋亡的原因。

多細胞有機體的發(fā)生發(fā)育有賴于細胞增殖、分化和死亡過程的精密配合，即細胞周期的正常運行、細胞增殖和凋亡的平衡。如果細胞周期發(fā)生改變，可引起細胞基因不適當?shù)幕罨辜毎^度增殖或者細胞凋亡。在細胞周期的各個時相(G1、S和G2期)存在細胞周期調(diào)控點[13]，外來化合物可以通過影響調(diào)控點來干擾細胞增殖。本研究結(jié)果表明：納米SiO2能夠改變細胞周期，25.000、50.000 mg·L-1SiO2組G0/G1細胞百分比減少，S期細胞沒有明顯的改變，50.000 mg·L-1SiO2組G2/M細胞百分比增加，表明神經(jīng)細胞阻滯于G2期，使有絲分裂延遲。當細胞發(fā)生阻滯時，細胞可通過一系列調(diào)控機制抑制細胞周期的進行，抑制DNA的合成，阻止細胞的分裂，提供充足的時間進行DNA的修復(fù)，以減少損傷的致死性避免突變、重組或損傷的DNA進入子代細胞[14]。由于不同理化刺激在不同周期對細胞的損害的程度不同，而細胞對損害的修復(fù)能力也隨周期的不同而不同。多數(shù)細胞損傷后都會發(fā)生周期阻帶，包括G1、S和G2期阻滯，使細胞不能通過檢定點，從而激活細胞周期相關(guān)蛋白使細胞發(fā)生凋亡。

綜上所述，納米SiO2可以明顯降低SH-SY5Y細胞生存率，增加細胞中ROS水平，對細胞的增殖與分化產(chǎn)生干擾，隨著納米SiO2染毒劑量的增加，細胞中ROS水平增加，大量蓄積的ROS可能會對線粒體造成損傷，使線粒體膜電位的發(fā)生改變，繼而通過線粒體途徑引發(fā)細胞凋亡的級聯(lián)反應(yīng)[15-17]，納米SiO2誘導(dǎo)SH-SY5Y細胞凋亡的作用機制還有待進一步研究。

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Induction effect of nano- SiO2on apoptosis of neuroblastoma SH-SY5Y cells and its mechanism

YANG Yanyan1,JIN Minghua1,LI Yanbo2,LI Yang2,WANG Jiahui1,ZHENG Tong1,WANG Sihui1, CHI Xiangyu1,ZHANG Yujia1， SUN Zhiwei1,2

(1.Department of Health Inspection，School of Public Health，Jilin University，Changchun 130021，China;2. Department of Sanitary Chemistry and Toxicology，School of Public Health，Capital Medical University，Beijing 100069，China)

ObjectiveTo observe the effects of nano-SiO2on apoptosis and cell cycle of human neuroblastoma SH-SY5Y cells,and to explore the mechanism.MethodsThe SH-SY5Y cells were treated with different concentrations of 90 nm SiO2and divided into 0,3.125,6.250,12.500,25.000, and 50.000 mg·L-1SiO2groups. The survival rates of the cells in various groups were assessed by MTT method;the apoptotic rates of SH-SY5Y cells were determined by AO/EB staining and Annexin Ⅴ-FITC/P method; the percentage of cell cycle and the level of intracellular reactive oxygen species(ROS) were tested by flow cytometry(FCM) method. ResultsThe MTT results showed the survival rates of the cells in 6.250,12.500,25.000 and 50.000 mg·L-1SiO2groups were significantly lower than that in control group (P<0.05);the survival rates of the cells in 12.500,25.000, and 50.000 mg·L-1SiO2groups were significantly lower than that in 3.125 mg·L-1SiO2group (P<0.05); the AO/EB staining and Annexin Ⅴ-FITC/PI results showed the apoptotic rates of the cells in 6.250，12.500，25.000，and 50.000 mg·L-1SiO2groups were higher than that in control group(P<0.05);the apoptotic rates of the cells in 12.500，25.000，and 50.000 mg·L-1SiO2groups were higher than that in 3.125 mg·L-1group(P<0.05).The FCM results showed the levels of ROS of the cells in 3.125,6.250,12.500,25.000, and 50.000 mg·L-1SiO2groups were significantly higher than that in control group (P<0.05); compared with control group,the percentages of the cells at G0/G1phase in 25.000 and 50.000 mg·L-1SiO2groups were increased (P<0.05);the percentage of the cells at G2/M phase in 50.000 mg·L-1SiO2group was increasd (P<0.05). ConclusionNano-SiO2can decrease the activity of SH-SY5Y cells and increase the apoptosis and the level of ROS,and nano-SiO2can interfere the cell cycle and inhibit the proliferation of SH-SY5Y cells.

nano-SiO2; SH-SY5Y cells; cell cycle;apoptosis

1671-587Ⅹ(2015)02-0249-06

10.13481/j.1671-587x.20150209

2014-11-18

國家自然科學(xué)基金資助課題(81172704)；吉林大學(xué)大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)項目資助課題(20130943)

楊艷艷(1986-)，女，黑龍江省黑河市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士，主要從事衛(wèi)生毒理學(xué)方面的研究。

孫志偉，教授，博士研究生導(dǎo)師(Tel:010-83911507，E-mail: zwsun@hotmail.com)；

金明華，副教授，碩士研究生導(dǎo)師(Tel:0431-85619441，E-mail:jinmh@jlu.edu.cn)

R730.264

A

網(wǎng)絡(luò)出版時間: 2015-03-10 11:34

網(wǎng)絡(luò)出版地址:http://www.cnki.net/kcms/detail/22.1342.r.20150310.1134.001.html