馮文磊，張　猛，徐芳潔，印雙紅，王艷杰，陳雪玲， 吳向未

(1. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

內(nèi)皮祖細(xì)胞條件培養(yǎng)基對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨分化的影響及其機(jī)制

馮文磊1，張猛1，徐芳潔2，印雙紅2，王艷杰1，陳雪玲2， 吳向未1

(1. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院普外科，新疆 石河子 832008；2. 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)教研室，新疆 石河子 832002)

目的: 探討小鼠骨髓來(lái)源的內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPCs)條件培養(yǎng)基(CM) 對(duì)同源間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)增殖和成骨分化功能的影響，并闡明其作用機(jī)制。方法: 小鼠骨髓細(xì)胞經(jīng)差速貼壁法結(jié)合專用培養(yǎng)基分別培養(yǎng)擴(kuò)增MSCs和EPCs,采用流式細(xì)胞術(shù)(FCM)檢測(cè)MSCs和EPCs表面標(biāo)記物,以成骨、成脂和成軟骨誘導(dǎo)分化對(duì)MSCs進(jìn)行功能鑒定，以成血管對(duì)EPCs進(jìn)行功能鑒定。將MSCs分為0% EPCs-CM組(對(duì)照組，采用LG-DMEM培養(yǎng))、50% EPCs-CM組(采用50% EPCs-CM+50% LG-DMEM培養(yǎng))和100% EPCs-CM 組(采用100% EPCs-CM培養(yǎng))。采用MTT比色法檢測(cè)各組MSCs的增殖活性；采用茜素紅染色檢測(cè)各組MSCs的成骨分化能力。結(jié)果: FCM法檢測(cè)，第3代MSCs高表達(dá)Sca-1、CD29， 低表達(dá)CD45、CD11b；經(jīng)誘導(dǎo)可向成骨、成軟骨和成脂方向分化。第3代EPCs 高表達(dá)CD34、CD133和VEGFR2；在鋪有基質(zhì)膠的96孔培養(yǎng)板中可形成血管樣結(jié)構(gòu)。與對(duì)照組比較，50% EPCs-CM組和100% EPCs-CM組MSCs增殖活性明顯增加,且呈濃度依賴性(P<0.05)。茜草色素紅染色法檢測(cè)，培養(yǎng)21 d后50%和100% EPCs-CM組MSCs的鈣結(jié)節(jié)數(shù)量和鈣鹽沉積均高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論:利用差速貼壁法可同時(shí)分離MSCs和EPCs，EPCs-CM能促進(jìn)MSCs 的增殖和成骨分化。

內(nèi)皮祖細(xì)胞；間充質(zhì)干細(xì)胞；條件培養(yǎng)基；細(xì)胞增殖；成骨分化

由創(chuàng)傷、感染、畸形矯正和腫瘤等各種因素造成的骨缺損，骨缺損不僅不易愈合，還因固定和制動(dòng)易導(dǎo)致褥瘡、呼吸系統(tǒng)感染、泌尿系統(tǒng)感染及患肢廢用性萎縮等多種并發(fā)癥。傳統(tǒng)治療方法有自體松質(zhì)骨移植和異體骨移植，但存在供骨區(qū)損傷、術(shù)后并發(fā)癥、來(lái)源有限和排斥反應(yīng)等問(wèn)題。組織工程骨是一種全新的治療方法，包含4個(gè)關(guān)鍵元素：具有骨傳導(dǎo)性的支架、釋放誘導(dǎo)成骨的生長(zhǎng)因子、負(fù)載具有成骨潛能的細(xì)胞和組織工程骨血管化或充足的血供[1]。骨髓中至少存在3種干/祖細(xì)胞系統(tǒng)：間充質(zhì)干細(xì)胞( mesenchymal stem cells，MSCs)系統(tǒng)、內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)系統(tǒng)和造血干細(xì)胞系統(tǒng)，并且相互之間存在密切聯(lián)系[2]。MSCs是中胚層來(lái)源的具有高度自我更新增殖能力和多向分化潛能的多能干細(xì)胞[4]，在特定條件下能分化為骨、軟骨和脂肪等多種組織細(xì)胞[4]。EPCs是一類能高度增殖、特異分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞、但尚未表達(dá)成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞表型的祖細(xì)胞[5]。EPCs不僅參與胚胎期血管發(fā)生，也參與成體血管新生和內(nèi)皮損傷后修復(fù)[6]。雖然人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到血管化在骨形成修復(fù)中的重要作用，但是成血管細(xì)胞促進(jìn)骨再生修復(fù)的機(jī)制尚未完全明了。本研究旨在從細(xì)胞水平探討具成血管潛能的EPCs對(duì)具成骨潛能的MSCs的增殖和成骨能力的生物學(xué)影響，為闡明血管化與骨形成之間的生物耦聯(lián)機(jī)制提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1動(dòng)物、主要試劑和儀器

4～6 周齡 C57B/L6 小鼠購(gòu)自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心,動(dòng)物合格證號(hào) ：SCXK(新)2011-0001)；胎牛血清、LG-DMEM培養(yǎng)基( Gilbco 公司,美國(guó)),PBS、 2.5 g·L-1胰蛋白酶 (HyClone 公司，美國(guó)),EGM2-MV培養(yǎng)基( Lonza公司,瑞士),青霉素和鏈霉素(SolarBio公司,中國(guó)),人纖連蛋白(BD公司，美國(guó)),MTT和DMSO(Sigma公司，美國(guó)),多聚甲醛固定液(賽馳生物科技公司，中國(guó)),成骨、成軟骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基和茜素紅、阿利新藍(lán)、油紅O染料(Cyagen Biosciences公司,美國(guó))，基質(zhì)膠( BD Biosciences公司,美國(guó)),抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE、CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC 和抗小鼠IgG 同型對(duì)照(eBioscience公司,美國(guó)),氯化十六烷基吡啶(Amresco公司，美國(guó));細(xì)胞培養(yǎng)皿、培養(yǎng)板(Coning公司,美國(guó))，酶標(biāo)儀(Bio-Rad公司，美國(guó)),熒光倒置相差顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(Leica公司,德國(guó)),流式細(xì)胞儀(BD公司，美國(guó))。

1.2MSCs和EPCs分離培養(yǎng)

取1只4～6周齡C57B/L6小鼠,肝素化30 min后脫頸處死，75%酒精浸泡5 min，超凈臺(tái)中用已滅菌手術(shù)器械分離小鼠下肢，取股骨與脛骨并剔除干凈肌肉組織與筋膜，置于PBS中。轉(zhuǎn)入另一超凈臺(tái)，剪去長(zhǎng)骨兩端骨骺,以5 mL注射器吸取含10% FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基換1 mL注射器針頭反復(fù)沖洗骨髓腔直至發(fā)白,沖出骨髓至60 mm培養(yǎng)皿中，吹打均勻放入37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為5%的CO2飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),48 h后輕輕晃動(dòng)培養(yǎng)皿,換新鮮含10%FBS的LG-DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)MSCs,同時(shí)收集離心未貼壁細(xì)胞,以EGM-2MV培養(yǎng)基在預(yù)先包被人纖連蛋白的60 mm培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng),2 d后吸除舊培養(yǎng)基和未貼壁細(xì)胞換新鮮EGM-2MV培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)來(lái)擴(kuò)增EPCs。MSCs和EPCs培養(yǎng)基均每2 d換液1次。原代培養(yǎng)的MSCs與EPCs至80%～90%融合時(shí)皆按1∶2 傳代。

1.3流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs和EPCs的表面標(biāo)記物

分別取處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的第3代MSCs和EPCs，待細(xì)胞80%～90%融合時(shí),2.5 g·L-1胰蛋白酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min,棄上清，PBS清洗2次，PBS重懸細(xì)胞，吹打均勻調(diào)整細(xì)胞密度為1×106mL-1，分裝每管100 μL，分別加入直接熒光標(biāo)記MSCs 抗小鼠sca-1-FITC、CD29-APC、CD45-PerCP-Cy5.5、CD11b-PE和直接熒光標(biāo)記EPCs 抗小鼠CD34-FITC、CD133-PE、VEGFR2-APC。分別以IgG-FITC、IgG-APC、IgG-PerCP-Cy5.5和IgG-PE 為同型對(duì)照。 4℃ 孵育1 h，每 15 min 輕搖1次。1 000 r·min-1離心3 min，PBS洗去未標(biāo)記上的抗體，10 g·L-1多聚甲醛固定10 min,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)MSCs和EPCs的表面標(biāo)記物表達(dá)。MSCs以高表達(dá)Sca-1和CD29、低表達(dá)CD45和CD11b為滿意結(jié)果；EPCs以均高表達(dá)CD34、CD133和VEGFR2為滿意結(jié)果。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4MSCs和EPCs的功能鑒定

1.4.1MSCs成骨誘導(dǎo)分化第2代細(xì)胞80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度以3×104cm-2在6孔板用成骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,茜草色素紅染色后鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況。以鈣結(jié)節(jié)被茜素紅染為紅色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.2MSCs成軟骨誘導(dǎo)分化第2代細(xì)胞 80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min,調(diào)整細(xì)胞密度以3×104cm-2在6孔板中用成軟骨誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3周,阿利新藍(lán)染色后鏡下觀察，以細(xì)胞被阿利新藍(lán)染為藍(lán)色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.3MSCs成脂誘導(dǎo)分化第2代細(xì)胞 80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min，調(diào)整細(xì)胞密度以3×104cm-2在6孔板培養(yǎng)至100%鋪滿，成脂誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基培養(yǎng)3 d,換成LG-DMEM培養(yǎng)基，24 h換成誘導(dǎo)培養(yǎng)基，循環(huán)3～5次，最后LG-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)7 d，油紅O染色后鏡下觀察脂滴形成情況，以脂滴被油紅O染為紅色為陽(yáng)性結(jié)果。

1.4.4EPCs的體外成血管能力檢測(cè)在96孔板的每孔中鋪50 μL基質(zhì)膠，消化第3代 EPCs，EGM-2MV培養(yǎng)基制成單細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，按每孔2×104個(gè)細(xì)胞接種于基質(zhì)膠上，輕輕拍打，使細(xì)胞接種均勻。倒置顯微鏡觀察血管形成情況，以能形成血管樣結(jié)構(gòu)為陽(yáng)性結(jié)果。

1.5EPCs-CM 的制備

取經(jīng)過(guò)鑒定后的第3～5代EPCs以1×105個(gè)細(xì)胞密度接種至60 mm培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞達(dá)到80%～90%融合后換液時(shí)收集舊培養(yǎng)基,2 000 r·min-1離心 5 min,取上清液加入10% FBS即為 EPCs-CM。重復(fù)制備，直至足量。經(jīng) 0.22 μm 濾膜過(guò)濾,貯存于-80 ℃ 冰箱中備用。

1.6MTT比色法檢測(cè)EPCs-CM培養(yǎng)MSCs增殖活性

取第2代MSCs，用含10%胎牛血清的LG-DMEM培養(yǎng)基制備細(xì)胞懸液，以 5×104mL-1接種于96孔培養(yǎng)板內(nèi)，每孔加入100 μL，培養(yǎng)12 h后，吸去培養(yǎng)基，加入含10%FBS及不同濃度(0、50%和100%)EPCs-CM的LG-DMEM 培養(yǎng)基100 μL，分別為0% EPCs-CM組(對(duì)照組)、50% EPCs-CM組和100% EPCs-CM組,每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，繼續(xù)培養(yǎng)48 h。每孔加入10 μL MTT，培養(yǎng)4 h后棄去上清液，每孔加入150 μL DMSO，震蕩儀低速震蕩10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)492 nm波長(zhǎng)處的吸光度(A)值，表示各組MSCs增殖活性。各組設(shè)與實(shí)驗(yàn)平行不加細(xì)胞只加培養(yǎng)液的空白對(duì)照孔。最后比色以空白孔A值調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7茜草色素紅染色和比色法檢測(cè)MSCs成骨能力

第2代細(xì)胞培養(yǎng)至80%～90%融合時(shí)，胰酶消化3～5 min，1 000 r·min-1離心5 min， 調(diào)整細(xì)胞密度以 3×104cm-2接種至6孔板中。對(duì)照組加2 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基，50% EPCs-CM組加1.5 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基再加0.5 mL EPCs-CM,100% EPCs-CM組加1 mL誘導(dǎo)培養(yǎng)基再加1 mL EPCs-CM,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。誘導(dǎo)培養(yǎng)3周,茜草色素紅染色，鏡下觀察鈣結(jié)節(jié)形成情況并選取5 個(gè)視野( 中央和3、6、9、12 點(diǎn)位置)雙盲計(jì)數(shù)，每孔加入0.1 mol·L-1氯化十六烷基吡啶1 mL室溫反應(yīng)20 min，震蕩儀低速震蕩10 min,酶標(biāo)儀檢測(cè)570 nm波長(zhǎng)處的A值，以A值表示MSCs成骨能力。最后比色以空白孔A值調(diào)零。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)　果

2.1MSCs 和EPCs 的形態(tài)學(xué)

MSCs于48 h內(nèi)貼壁，細(xì)胞形態(tài)不均一、異形性大，有成纖維樣細(xì)胞，也有大、小圓形細(xì)胞和多角形細(xì)胞；培養(yǎng)2 d時(shí)可見(jiàn)集落形成，沿集落周邊細(xì)胞迅速生長(zhǎng)；培養(yǎng)約12 d時(shí)細(xì)胞鋪滿，以紡錘形樣細(xì)胞為主,經(jīng)傳代培養(yǎng)后形態(tài)漸趨均一呈“漩渦”狀。見(jiàn)圖1A和B(插頁(yè)一)。48 h后細(xì)胞懸液離心，細(xì)胞沉淀重懸于纖維連結(jié)蛋白預(yù)包被的60 mm培養(yǎng)皿中；2 d后2次貼壁的EPCs開始伸展成梭形；約4 d時(shí)見(jiàn)細(xì)胞集落形成，集落中央為圓形細(xì)胞群，周邊有梭形細(xì)胞放射性生長(zhǎng)；12 d時(shí)細(xì)胞可達(dá)到80%～90%融合，以類圓形和多角形細(xì)胞為主，晚期呈“鋪路石”狀。見(jiàn)圖1C和D(插頁(yè)一)。

2.2MSCs和EPCs的表面標(biāo)記物表達(dá)陽(yáng)性率

第3代MSCs高表達(dá)Sca-1和CD29,表達(dá)陽(yáng)性率分別為(98.30±0.75)%和(97.47±1.32)%；低表達(dá)CD45和CD11b,表達(dá)陽(yáng)性率分別為(1.87±0.15)%和(1.03±0.71)%。見(jiàn)圖2。

第3代EPCs均高表達(dá)CD34、CD133和VEGFR2，表達(dá)陽(yáng)性率分別為(88.90±1.18)%，(92.73±2.90)%和(87.63±1.79)%。見(jiàn)圖3。

A-D: Homotype control;E-H: Surface marker;A,E: Sca-1;B,F: CD29;C,G: CD45;D,H: CD11b.

A-C:Homotype control;D-F:Surface marker;A,D:CD34;B,E:CD133;C,F:VEGFR2.

2.3MSCs和EPCs的功能鑒定

第3代MSCs 誘導(dǎo)分化成骨細(xì)胞，經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，形態(tài)由梭形變?yōu)椴灰?guī)則形，誘導(dǎo)14 d時(shí)可見(jiàn)散在分布小褐色結(jié)節(jié)，誘導(dǎo)21 d后結(jié)節(jié)中心的細(xì)胞逐漸融合失去細(xì)胞結(jié)構(gòu)，鈣結(jié)節(jié)形成明顯，經(jīng)茜草色素紅染色呈紅色結(jié)節(jié)(圖4A，見(jiàn)插頁(yè)一)。

第3代 MSCs 誘導(dǎo)分化成軟骨細(xì)胞，經(jīng)成軟骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞形態(tài)變化不大，誘導(dǎo)21 d后行阿利新藍(lán)染色，鏡下可見(jiàn)誘導(dǎo)分化形成的軟骨細(xì)胞胞核被染成深藍(lán)色，胞質(zhì)染成淺藍(lán)色(圖4B，見(jiàn)插頁(yè)一)。

第3代MSCs誘導(dǎo)分化成脂肪細(xì)胞，細(xì)胞成脂誘導(dǎo)后，形態(tài)變不規(guī)則,部分細(xì)胞中有小脂滴形成，誘導(dǎo)21 d后融合成大脂滴，經(jīng)油紅O 染色，脂滴被染成鮮紅色(圖4C，見(jiàn)插頁(yè)一)。

第3代 EPCs體外形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，鏡下觀察，2～5 h后 細(xì)胞變形拉長(zhǎng)，6～9 h細(xì)胞遷移聚集，首尾相接，形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，10～12 h達(dá)到頂峰(圖4D，見(jiàn)插頁(yè)一)。

2.4MSCs的增殖情況

MTT比色法：隨著 EPCs-CM 濃度的增加，MSCs增殖活性逐漸增加。50%EPCs-CM 組和100% EPCs-CM 組MSCs的增殖活性(0.233±0.033和0.324±0.023)均高于對(duì)照組(0.157±0.020)(P<0.05或P<0.01)。

2.5MSCs經(jīng)誘導(dǎo)后鈣離子沉積情況

鈣結(jié)節(jié)計(jì)數(shù)：與對(duì)照組(8.33±0.57)比較，50%EPCs-CM組和100%EPCs-CM組MSCs的平均鈣結(jié)節(jié)數(shù)(13.00±1.00和21.67±2.52)明顯增加(P<0.05或P<0.01 )。A570值檢測(cè)：與對(duì)照組(0.177±0.017)比較，50%EPCs-CM組和100%EPCs-CM組MSCs的A570值(0.254±0.029和0.33±0.021)明顯升高(P<0.05或P<0.01)。見(jiàn)圖5(插頁(yè)一)。

3　討　論

1976 年Friedenstein 等[7]首次從骨髓中分離出MSCs，1997 年Asahara 等[8]首次從外周血中分離出EPCs,但隨后研究[9]證實(shí)EPCs源于骨髓。相較于其他組織來(lái)源，骨髓中的MSCs和EPCs更為豐富，且增殖能力更強(qiáng)[10]。本研究利用 MSCs與EPCs 差時(shí)貼壁的特性[11]從一份骨髓中一次性將2種細(xì)胞分離出來(lái)，此方法簡(jiǎn)單易行，避免了分選和反復(fù)離心造成的細(xì)胞損傷和丟失，最大程度保存了MSCs和EPCs 生長(zhǎng)所需的微環(huán)境，可使其保持旺盛的增殖能力。本研究結(jié)果表明：骨髓中的MSCs 貼壁時(shí)間較快,培養(yǎng)2～5 h 即可貼壁,而EPCs 貼壁較慢,實(shí)驗(yàn)在貼壁培養(yǎng)48 h后收集未貼壁細(xì)胞，以專用培養(yǎng)基培養(yǎng),可以粗略地將MSCs和EPCs分離。但是差時(shí)貼壁的細(xì)胞成分仍較復(fù)雜,需多次傳代以逐漸提高細(xì)胞純度。

由于MSCs和EPCs 形態(tài)相近并且同一種細(xì)胞在不同階段形態(tài)并不一致，所以單從形態(tài)學(xué)方面不可能對(duì)這2種細(xì)胞進(jìn)行鑒定，目前國(guó)內(nèi)外普遍結(jié)合細(xì)胞表面標(biāo)志物和細(xì)胞分化功能來(lái)鑒定。然而目前學(xué)術(shù)界對(duì)于MSCs和EPCs鑒定的表面標(biāo)志物至今無(wú)統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，較為公認(rèn)的MSCs表面標(biāo)記物是高表達(dá)Sca-1、CD29、CD73、CD90、CD105和CD44，同時(shí)低表達(dá)或不表達(dá)CD45、CD11b和CD34等[4，12]。而研究者普遍認(rèn)為EPCs高表達(dá)CD34、CD133和VEGFR2[13]，與此相對(duì)應(yīng)，MSCs功能鑒定的金標(biāo)準(zhǔn)是其向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞的分化潛能[4,14]；針對(duì)EPCs的功能鑒定是其能在基質(zhì)膠上形成血管腔樣結(jié)構(gòu)[14]。本研究結(jié)果顯示：MSCs高表達(dá)Sca-1和CD29，低表達(dá)CD45和CD11b，EPCs則高表達(dá)CD34、CD133和VEGFR2；功能鑒定結(jié)果顯示：MSCs可向成骨細(xì)胞、脂肪細(xì)胞和軟骨細(xì)胞方向分化，EPCs可在基質(zhì)膠上形成血管腔樣結(jié)構(gòu)，具有MSCs和EPCs特性。

骨是高度血管化的組織，骨缺損導(dǎo)致血供破壞或中斷，所以不論是自體MSCs 的動(dòng)員、歸巢還是體內(nèi)MSCs 移植均有低氧或缺氧期。已有研究[15]顯示：缺氧可抑制或減弱MSCs的成骨分化能力。而EPCs 可分泌血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1 (stromal cell-derived factor,SDF-1)、 胰島素樣生長(zhǎng)因子1(insulin-like growth factor-1,IGF-1)[16]、表皮生長(zhǎng)因子(epidermal growth factor，EGF)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibroblast growth factor,FGF )、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(hepatocyte growth factor,HGF)[17]、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)[18]等多種生長(zhǎng)因子，這些生長(zhǎng)因子 對(duì)EPCs 本身的存活、增殖和分化有促進(jìn)作用。體外培養(yǎng)的EPCs 通過(guò)旁分泌作用將細(xì)胞因子分泌到培養(yǎng)基中，檢測(cè)其旁分泌作用對(duì)MSCs的影響,最簡(jiǎn)單的方法就是使用含 EPCs分泌物或代謝產(chǎn)物條件培養(yǎng)基作用于MSCs,觀察其對(duì)MSCs相關(guān)功能的影響。本實(shí)驗(yàn)采用 MTT比色法檢測(cè)EPCs-CM 對(duì)MSCs 增殖影響的結(jié)果顯示：EPCs-CM可以促進(jìn)MSCs的增殖并隨著EPCs-CM 濃度的增加，其促增殖作用更加明顯，呈現(xiàn)濃度依賴性。茜素紅染色是常規(guī)用于檢測(cè)MSCs鈣鹽沉積情況的染色方法，可將鈣鹽染成紅色。 氯化十六烷基吡啶能將鈣鹽結(jié)節(jié)溶解使鈣離子析出，從而可在酶標(biāo)儀上定量檢測(cè)鈣鹽沉積情況。本研究采用成骨誘導(dǎo)后，茜素紅染色計(jì)數(shù)鈣結(jié)節(jié)數(shù)目，然后加氯化十六烷基吡啶溶解鈣結(jié)節(jié)，經(jīng)酶標(biāo)儀檢測(cè)其吸光度，以觀察EPCs-CM 對(duì)MSCs 成骨分化的影響，結(jié)果顯示：EPCs-CM可以促進(jìn)MSCs向成骨方向分化，也呈一定的濃度依賴性。由此可見(jiàn)EPCs-CM含有的某種或某幾種生長(zhǎng)因子或者其他的代謝產(chǎn)物促進(jìn)了MSCs的存活增殖及向成骨方向分化。

骨缺損的修復(fù)再生是復(fù)雜而精細(xì)的體內(nèi)過(guò)程。本研究采用含有生長(zhǎng)因子和其他代謝產(chǎn)物的EPCs-CM探討其對(duì)MSCs 的增殖與成骨分化的影響。本文作者后續(xù)實(shí)驗(yàn)將探討是何種細(xì)胞因子促增殖、促成骨能力最強(qiáng)或相互之間有無(wú)協(xié)同作用,如何組合協(xié)同作用更明顯；EPCs密度確定情況下分泌的細(xì)胞因子的量及用抗體阻斷后對(duì)MSCs增殖和成骨能力的影響；通過(guò)何種信號(hào)通路來(lái)調(diào)控增殖分化作用，信號(hào)通路之間有無(wú)連接點(diǎn)。本文作者期望未來(lái)將2種細(xì)胞聯(lián)合移植至組織工程骨中更好地促進(jìn)骨的形成和血管化，使組織工程骨在骨缺損的臨床治療中發(fā)揮更大作用。

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Effects of endothelial progenitor cells conditioned medium on proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells and their mechanisms

FENG Wenlei1， ZHANG Meng1， XU Fangjie2，YIN Shuanghong2，WANG Yanjie1，CHEN Xueling2， WU Xiangwei1

(1. Department of General Surgery，F(xiàn)irst Affiliated Hospital， College of Medical Sciences, Shihezi University，Shihezi 832008，China；2. Department of Immunology，College of Medical Sciences,Shihezi University，Shihezi 832002，China )

ObjectiveTo investigate the effects of bone marrow-derived endothelial progenitor cells(EPCs) conditioned medium(EPCs-CM) on the proliferation and osteogenic differentiation of mesenchymal stem cells(MSCs),and to clarify the mechanisms.MethodsThe EPCs and MSCs were isolated from bone marrow of the mice using differential adhesion method.The surface markers of EPCs and MSCs were identified by flow cytometry (FCM).The osteogenic,chondrogenic,and adipogenic induction differentiation abilities of the MSCs were identified.The function of EPCs was identified by tube formation experiment.The MSCs were divided into 0% EPCs-CM group(control group,cultured with LG-DMEM),50% EPCs-CM group(cultured with 50% EPGs-CM and 50% LG-DMEM),and 100% EPCs-CM group(cultured with 100% EPCs-CM).The proliferation activities of the MSCs in various groups were detected by MTT method;the osteogenic differentiation abilities of the MSCs in various groups were detected by Alizarin red staining. ResultsThe FCM results showed that the third passage MSCs were strongly positive for Sca-1,CD29 and negative for CD45,CD11b and could be induced to complete differentiation process into osteoblasts and adipocytes and chondrocytes.The third passage EPCs cultured on Matrigel showed tube-like structures and highly expressed CD34,CD133 and VEGFR2.Compared with control group,the proliferation activities of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were increased(P<0.05),which presented a dose-dependent manner.The Alizarin red staining results showed the number of mineralized nodules and calcium deposition of the MSCs in 50% EPCs-CM group and 100% EPCs-CM group were higher than those in control group after cultured for 21 d(P<0.05).ConclusionThe method of differential adhesion can simultaneously isolate the MSCs and EPCs.EPCs-CM can promote the proliferation and osteogenic differentiation of the MSCs.

mesenchymal stem cells;endothelial progenitor cells;conditioned medium;cell proliferation;osteogenic differentiation

1671-587Ⅹ(2015)02-0218-07

10.13481/j.1671-587x.20150203

2014-08-19

國(guó)家自然科學(xué)基金資助課題(31271458)；人力資源和社會(huì)保障部留學(xué)回國(guó)人員科技活動(dòng)項(xiàng)目資助課題(RSLX201201)；兵團(tuán)科技援疆項(xiàng)目資助課題(2011AB034，2014AB047)

馮文磊(1987-)，男，河南省商丘市人，在讀醫(yī)學(xué)碩士,主要從事干細(xì)胞與再生醫(yī)學(xué)基礎(chǔ)方面的研究。

吳向未，教授，博士研究生導(dǎo)師(Tel:0993-2859449， E-mail：wxwshz@126.com)

R683

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