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        細(xì)針吸取細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測非小細(xì)胞肺癌EGFR、KRAS突變的探討

        2015-09-04 11:59:30張智慧吳希蘭應(yīng)建明李峻嶺邱田郭會(huì)芹趙煥山靈凌云
        中國肺癌雜志 2015年4期
        關(guān)鍵詞:突變率細(xì)針細(xì)胞學(xué)

        張智慧 吳希蘭 應(yīng)建明 李峻嶺 邱田 郭會(huì)芹 趙煥 山靈 凌云

        肺癌是世界上發(fā)病率和病死率最高的腫瘤[1],其中非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)約占80%,70%患者就診時(shí)已處于肺癌晚期。晚期肺癌患者預(yù)后差,采用常規(guī)化療其平均生存期小于1年[2]。近年來表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)-酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor, TKI)為NSCLC的治療帶來了希望,但是用藥前必須檢測EGFR、KRAS的突變情況,因?yàn)镋GFR野生型對TKI藥物不敏感,所以檢測基因的突變非常必要[3]。有些晚期肺癌患者的病理診斷是根據(jù)細(xì)胞學(xué)標(biāo)本做出的,如:轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取、胸腔積液等,部分患者細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可能是其唯一的標(biāo)本來源。能夠手術(shù)的肺癌患者檢測EGFR、KRAS基因突變采用手術(shù)后石蠟包埋組織切片標(biāo)本,但是對于不適宜手術(shù)的晚期肺癌患者其EGFR、KRAS的基因突變檢測,細(xì)胞學(xué)標(biāo)本可能是其重要來源。本研究探討細(xì)胞學(xué)細(xì)針吸取的懸浮液標(biāo)本檢測EGFR、KRAS突變的臨床意義。

        1 材料與方法

        1.1 臨床資料 標(biāo)本來自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院病理科細(xì)胞學(xué)室,自2011年3月-2013年2月間,肺癌患者縱隔和體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取,細(xì)胞學(xué)診斷結(jié)果為非小細(xì)胞癌(包括鱗癌和腺癌),共85例。縱隔轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)超聲內(nèi)鏡引導(dǎo)下的經(jīng)支氣管針吸活檢(endobronchial ultrasound-guided transbrochial needle aspiration, EBUS-TBNA)針吸5例,體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)盲穿針吸80例。其中男性45例,女性40例,年齡31歲-75歲(中位年齡54歲)。同時(shí),19例有手術(shù)后石蠟包埋病理切片標(biāo)本作為匹配進(jìn)行EGFR、KRAS檢測,9例為肺癌原發(fā)灶標(biāo)本,10例為肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本。13例有臨床應(yīng)用TKI抑制劑的治療效果記錄。85例均由組織病理或者免疫細(xì)胞化學(xué)結(jié)果證實(shí)為鱗狀細(xì)胞癌4例、腺癌81例。

        1.2 標(biāo)本的采集 用22 G一次性注射器(針頭規(guī)格0.7 mm)吸取淋巴結(jié),吸出物制作傳統(tǒng)涂片和液基薄層涂片各1張用于細(xì)胞學(xué)臨床診斷,剩余在PreservCyt保存液中的懸浮液標(biāo)本留作EGFR、KRAS檢測,為了保證檢測有足夠的腫瘤細(xì)胞,并且腫瘤細(xì)胞量在70%以上,每例在基因檢測前先觀察液基薄層涂片中腫瘤細(xì)胞的數(shù)量和比例是否達(dá)到標(biāo)準(zhǔn)。

        1.3 DNA的提取 使用QIAamp? DNA mini試劑盒(Qiagen公司,德國)提取基因組DNA,操作按照使用說明書進(jìn)行。使用微量紫外分光光度計(jì)測定DNA濃度、純度。

        1.4 Real-time PCR分析 使用商品化的人EGFR、KRAS基因突變檢測試劑盒(熒光PCR法)檢測EGFR、KRAS基因突變,基因突變檢測試劑盒購自北京雅康博生物科技有限公司,操作按照使用說明書進(jìn)行。

        1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 TKI治療的反應(yīng)率采用實(shí)體瘤評估反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)[4]。細(xì)胞學(xué)樣本和組織學(xué)樣本突變狀態(tài)的一致性,采用Cohen’s k系數(shù)進(jìn)行比較[5]. 一致性關(guān)系分為:0.81-1.00為完全一致;0.61-0.80為大體一致;0.41-0.60為中等一致[6]。

        2 結(jié)果

        2.1 樣本的滿意率 共檢測轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本85例,5例由于提取DNA量不足,無法進(jìn)行檢測,為不滿意標(biāo)本,其中包括EBUS-TBNA針吸2例(2/5),占40%,體表轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)盲穿針吸3例(3/80),占3.8%。3例盲穿針吸病例經(jīng)過重新吸取,補(bǔ)充細(xì)胞量,使提取DNA量充足,能夠進(jìn)行檢測,但是EBUS-TBNA針吸2例未能進(jìn)行補(bǔ)救。至此,能進(jìn)行檢測的有效標(biāo)本共83例。我們獲得了平均31.06 ng/μL的DNA。

        2.2EGFR突變 檢測肺癌轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本83例,EGFR基因突變31例,突變率為37.3%。1例同時(shí)檢測到20號和21號外顯子上2個(gè)突變點(diǎn),另1例2個(gè)突變點(diǎn)同時(shí)位于19號和21號外顯子上。31例突變中19號、21號、20號和18號的突變率分別為51.5%(17/33)、42.5%(14/33)、3.0%(1/33)和3.0%(1/33)。19號和21號外顯子上EGFR基因的突變占94.0%。分析各外顯子突變類型,主要為第19號外顯子的缺失突變和第21號外顯子L858R點(diǎn)突變。EGFR基因突變檢測結(jié)果見圖1A和圖1B。31例突變中,2例為鱗狀細(xì)胞癌(2/4),突變率50%;29例腺癌(29/79),突變率36.7%。女性突變占女性患者的60.0%(24/40),男性突變占男性患者的16.3%(7/43)。EGFR的突變情況及突變率見表1和表2。

        檢測細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的同時(shí),有19例福爾馬林固定石蠟包埋切片(formalin fixed paraffin-embedded, FFPE)標(biāo)本作為匹配進(jìn)行檢測。轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本10例,其結(jié)果與細(xì)針針吸標(biāo)本的檢測結(jié)果一致(kappa=1.0),9例組織學(xué)為肺部原發(fā)灶標(biāo)本,細(xì)胞學(xué)為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶標(biāo)本,同一病例原發(fā)灶與轉(zhuǎn)移灶兩種標(biāo)本檢測結(jié)果是一致的(kappa=1.0)。

        2.3KRAS突變 83例同時(shí)進(jìn)行了KRAS基因檢測,基因突變6例,主要發(fā)生在2號外顯子12和13號密碼子上的點(diǎn)突變,突變率7.2%。此6例EGFR均為野生型,未見突變。KRAS基因突變檢測結(jié)果見圖2。KRAS突變情況及突變率見表2和表3。細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測有基因突變,臨床分期為IV期的13例患者,臨床上使用了TKI藥物,包括吉非替尼、埃克替尼、厄洛替尼、阿法替尼等。連續(xù)用藥觀察,時(shí)間從5個(gè)月-36個(gè)月,臨床療效為:2例達(dá)到完全緩解(complete remission, CR)(16.7%);8例是部分緩解(partial remission, PR)(66.7%);3例為最佳穩(wěn)定疾?。╯table disease, SD)(25.0%),SD達(dá)到11個(gè)月-15個(gè)月。從用藥情況看,突變位點(diǎn)位于19號和21號外顯子的療效明顯,由于例數(shù)少,無法計(jì)算統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        表 1 EGFR的突變情況Tab 1 EGFR mutation status

        表 3 KRAS的突變情況Tab 3 KRAS mutation status

        圖 1 Real-time PCR檢測EGFR基因突變。A:EGFR基因野生型;B:EGFR基因突變型。Fig 1 Real-time PCR detect EGFR gene mutation. A: EGFR gene wild type; B: EGFR gene mutation type.

        圖 2 Real-time PCR檢測KRAS基因突變。A:KRAS基因野生型;B:KRAS基因突變型。Fig 2 Real-time PCR detect KRAS gene mutation. A: KRAS gene wild type; B: KRAS gene mutation type.

        3 討論

        隨著分子生物學(xué)在臨床的應(yīng)用,基因檢測技術(shù)的成熟,分子靶向藥物在肺癌治療中的作用越來越受到重視,其療效也被臨床認(rèn)可。分子靶向藥物應(yīng)用前EGFR和KRAS基因突變的檢測,使用活檢切除或者手術(shù)后石蠟包埋切片標(biāo)本的檢測結(jié)果已經(jīng)有文獻(xiàn)報(bào)道[7-9]。細(xì)胞學(xué)漿膜腔積液石蠟包埋塊標(biāo)本,以及16 G-20 G粗針穿刺獲取標(biāo)本制成石蠟包埋塊檢測EGFR和KRAS的基因突變在國內(nèi)也有報(bào)道[10-12]。以上檢測均使用細(xì)胞石蠟包埋塊標(biāo)本。當(dāng)今臨床提倡腫瘤患者診斷和治療應(yīng)該采取損傷小,患者痛苦少的方法。尤其對于一些就診時(shí)已經(jīng)是晚期,出現(xiàn)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者,臨床應(yīng)用細(xì)針吸取獲取標(biāo)本做出診斷后,剩余懸浮液標(biāo)本能否提取DNA,進(jìn)行EGFR和KRAS基因檢測,國內(nèi)尚未見報(bào)道。對于晚期淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的肺癌患者,細(xì)針吸取取材容易,創(chuàng)傷小,是其重要的標(biāo)本來源。

        細(xì)胞學(xué)標(biāo)本檢測EGFR基因突變,突變率為20%-50%[11,13,14]。均采用靈敏度較高的技術(shù)進(jìn)行檢測。何臣等應(yīng)用酶切富集PCR方法,對30例NSCLC胸腔積液游離核酸EGFR基因外顯子19缺失和外顯子21 L858R突變進(jìn)行分析,30例NSCLC患者中,EGFR基因外顯子19缺失10例(33.3%),外顯子21 L858R突變5例(16.7%)。丁麗等[14]收集23例晚期NSCLC患者惡性胸腔積液,經(jīng)反復(fù)離心后取沉淀細(xì)胞行石蠟包埋,巢式PCR法擴(kuò)增外顯子19、20、21,取擴(kuò)增片段行DNA測序分析。結(jié)果顯示23例中8例發(fā)生EGFR基因突變,4例在外顯子19,2例在外顯子21,2例發(fā)生復(fù)合突變。7例突變患者服用吉非替尼治療,中位無進(jìn)展生存時(shí)間達(dá)9.5個(gè)月。王等[11]同樣采用密度梯度離心后,將21例胸水細(xì)胞包埋,制成蠟塊檢測EGFR基因突變,突變率為42.9%。以上檢測病例數(shù)均未超過50例,并且采用細(xì)胞塊包埋方法。本研究是大樣本轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本檢測EGFR和KRAS的報(bào)道,采用診斷后剩余懸浮液標(biāo)本,使用靈敏度比較高的熒光PCR方法進(jìn)行檢測,結(jié)果EGFR基因突變率為37.3%,EGFR基因突變51.5%出現(xiàn)在19號外顯子,42.5%出現(xiàn)在21號外顯子,與細(xì)胞學(xué)包埋蠟塊標(biāo)本的結(jié)果相一致。

        手術(shù)切除后組織學(xué)標(biāo)本檢測EGFR基因突變率為16%-58%[15,16],本研究突變率在37.3%。研究中19例細(xì)胞學(xué)針吸同時(shí)匹配FFPE切片標(biāo)本進(jìn)行了檢測,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)活檢切除標(biāo)本10例,其結(jié)果與細(xì)胞學(xué)針吸標(biāo)本的檢測結(jié)果一致(kappa=1.0),說明同一病例不同取材標(biāo)本的檢測結(jié)果未存在差異。9例肺部原發(fā)灶與淋巴結(jié)針吸細(xì)胞學(xué)標(biāo)本的檢測結(jié)果也是一致的(kappa=1.0)。文獻(xiàn)報(bào)道肺部原發(fā)灶和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶不同部位EGFR檢測結(jié)果存在差異,本研究這樣的病例僅9例,由于例數(shù)少,不足以作為統(tǒng)計(jì)依據(jù)。

        突變位于19號和21號外顯子,使EGFR受體激酶和對酪氨酸激酶拮抗劑的敏感性增加,癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性明顯增強(qiáng)[17]。細(xì)胞學(xué)結(jié)果顯示EGFR突變,無病理標(biāo)本匹配的13例臨床分期為IV期的患者,臨床給予TKI藥物進(jìn)行觀察,療效為:2例達(dá)到完全緩解CR,此2例基因突變位于19號外顯子;8例達(dá)到部分緩解PR,5個(gè)突變點(diǎn)位于19號外顯子,4個(gè)位于21號外顯子(其中1例有2個(gè)突變點(diǎn));3例為最佳SD,2個(gè)突變位點(diǎn)位于19號外顯子,1個(gè)位于21號外顯子,SD已經(jīng)達(dá)到11個(gè)月-15個(gè)月。

        有關(guān)肺癌淋巴結(jié)細(xì)針吸取標(biāo)本提取DNA,進(jìn)行EGFR和KRAS基因突變的檢測,國外已有報(bào)道。Billah等[18]檢測166例NSCLC患者EGFR的基因突變,突變率分別是腺癌29.0%,非腺癌7.0%,KRAS為23.6%。Lozano等[19]檢測了138例NSCLC患者的原發(fā)灶和轉(zhuǎn)移淋巴結(jié),EGFR突變率為17%,KRAS為12%,均發(fā)現(xiàn)EGFR和KRAS的突變是相互排斥的。其研究結(jié)果反映的是歐美群體。本研究結(jié)果83例NSCLC的EGFR突變率為37.3%,腺癌細(xì)胞為36.7%,4例鱗狀細(xì)胞癌有2例發(fā)生突變,突變率為50.0%,由于鱗狀細(xì)胞癌例數(shù)少,無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。歐美群體EGFR的突變率低于亞洲群體,和手術(shù)后組織切片檢測結(jié)果相一致[11,13-17,20]。

        EGFR和KRAS基因突變是相互排斥的,文獻(xiàn)[21,22]報(bào)道KRAS基因突變范圍為4.7%-13.0%。本研究KRAS基因突變率為7.2%,與文獻(xiàn)報(bào)道相一致,與國內(nèi)組織學(xué)標(biāo)本的檢測結(jié)果也是相符合。有報(bào)道稱KRAS突變率分別為23.6%和12%,明顯高于亞洲群體。在肺腺癌中,歐美群體EGFR的突變率低于亞洲群體,KRAS的基因突變率高于亞洲群體。EGFR突變在肺腺癌、女性患者、非吸煙及東亞人群發(fā)生率高,吉非替尼在東方人群整體生存率和緩解率明顯高于西方人群[23-25]。

        目前,關(guān)于檢測EGFR、KRAS的突變狀態(tài)作為NSCLC患者TKI療效的預(yù)測指標(biāo)廣為臨床所接收,對于不能手術(shù)的肺癌患者,如何找到組織標(biāo)本的替代者逐漸成為探討熱點(diǎn)。本研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)移淋巴結(jié)的細(xì)針吸取可能是較好的組織替代標(biāo)本,利用診斷后剩余的細(xì)胞懸液標(biāo)本進(jìn)行檢測,標(biāo)本制作簡單、方便,因而具有較高的臨床實(shí)用性,有助于晚期肺癌患者的個(gè)體化治療。

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