王起龍 李敏 胡成平

分子靶向治療在肺癌的臨床治療中表現(xiàn)出了良好的應用前景。表皮生長因子受體酪氨酸激酶抑制劑（epidemal growth factor receptor-tyrosine kinase inhibitor,EGFR-TKI）研究[1,2]結(jié)果顯示，TKI治療效果顯著的患者存在基因突變，以19外顯子缺失和21外顯子的突變?yōu)橹鳌Ｈ欢S著EGFR-TKI治療方案的臨床推廣，耐藥問題逐漸出現(xiàn)，成為了新的研究熱點。大多數(shù)EGFR突變陽性的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）患者在初始治療大約6個月-12個月后會出現(xiàn)耐藥，從而導致TKI失效；而部分患者即使攜帶EGFR活化突變，仍對TKI不敏感。

臨床發(fā)現(xiàn)的耐藥主要包括原發(fā)性耐藥和繼發(fā)性耐藥兩大類，原發(fā)性耐藥的主要機制為原發(fā)性耐藥突變、次級藥物暴露程度，細胞誘導凋亡障礙等。繼發(fā)性耐藥則主要包括了EGFR的二次突變、藥物暴露程度，異常小分子激活EGFR通路、組織學類型轉(zhuǎn)化等機制[3-5]。TKI繼發(fā)性耐藥已被認為有多重途徑，以上幾種機制均是在基因水平解釋TKI繼發(fā)性耐藥。目前大量的證據(jù)表明基因二次突變是藥物繼發(fā)性耐藥機制的重要組成部分。然而，基因組學在相對較快的耐藥以及藥物應答可逆性方面的解釋仍然顯得不那么充分。研究[5,6]證實，部分耐藥患者靶點基因未發(fā)現(xiàn)突變，也有一些患者旁路被激活。提示除基因組學機制外可能還存在其他繼發(fā)性耐藥機制。

表觀遺傳學是重要遺傳學分支學科，主要研究表觀遺傳變異。表觀遺傳變異是指在基因的DNA序列沒有改變，基因功能卻發(fā)生可遺傳的變化，并最終導致生物表型發(fā)生變化。甲基化則是表觀遺傳學研究中基因組DNA一種主要的表觀遺傳修飾形式，可調(diào)節(jié)基因組功能。DNA甲基化過程主要通過DNA甲基轉(zhuǎn)移酶（DNA methyltransferase,DNMT）來催化。有研究表明：多種肺腺癌細胞株進行比較，對TKI敏感性高的細胞株EGFR啟動子區(qū)域甲基化程度低，而敏感性低的細胞株對應甲基化程度高[7]。我們推斷吉非替尼可能誘導PC9細胞對其產(chǎn)生繼發(fā)性耐藥，以及EGFR啟動子甲基化可能在該過程中起到作用，以期為肺腺癌耐藥提供新的治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料 人肺腺癌PC9細胞株（對EGFR-TKI敏感）和耐藥細胞株P(guān)C9/GR0（對EGFR-TKI耐藥）購自廣州肺癌研究所；液體RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購自美國Gibco公司；MTT購自南京凱基生物科技有限公司；5-Azadc（DNA甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑）購自美國Sigma公司?？俁NA抽提試劑Trizol購自美國Invitrogen公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本東洋紡公司；EGFR探針引物和GAPDH探針引物購自上海生工生物工程有限公司；吉非替尼粉劑購自大連美侖生物技術(shù)有限公司，溶解于DMSO，制成實驗相應濃度1,000倍的溶液，分裝保存于-20 ℃冰箱中備用，實驗時用培養(yǎng)液稀釋至目標濃度，使終溶液中DMSO體積分數(shù)低于0.1%。

1.2 細胞培養(yǎng) 將PC9細胞株培養(yǎng)于含有10%胎牛血清培養(yǎng)液中，接種于培養(yǎng)瓶，放于37 ℃培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。次日換培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察細胞生長情況，每兩天更換一次細胞培養(yǎng)液（含有10%胎牛血清的RPMI-1640），長滿培養(yǎng)瓶后進行消化傳代，待傳代至3代后，80%貼壁的細胞用于實驗。5-Aza-dc干預吉非替尼耐藥細胞株P(guān)C9/GR取對數(shù)生長期的PC9/GR細胞進行試驗，0.25%胰蛋白酶消化成細胞懸液，接種于細胞培養(yǎng)瓶中，分組如下：實驗組：培養(yǎng)PC9/GR細胞，加入1 μmol/L 5-Aza-dc干預72 h，參考研究[8]；對照組：同期培養(yǎng)不加藥的肺癌PC9/GR細胞，加入等容積的DMSO，作為5-Aza-dc干預前狀態(tài)。待細胞貼壁后，對照組每24 h更換培養(yǎng)液一次，而實驗組均每24 h更換含相應濃度5-Aza-dc的培養(yǎng)液一次。

1.3 MTT法檢測PC9細胞半數(shù)抑制濃度 集對數(shù)期的細胞，調(diào)整懸浮液中細胞的濃度，每孔加入100 μL懸浮液，鋪板使待測細胞調(diào)密度至8,000/孔（邊緣孔使用無菌PBS填充）。5%CO2、37 ℃孵育，至細胞單層貼壁（96孔板），加入濃度梯度藥物吉非替尼（0 μmol/L, 0.01 μmol/L, 0.1 μmol/L,1 μmol/L, 10 μmol/L, 100 μmol/L）。5%CO2、37 ℃條件下孵育48 h，使用倒置顯微鏡下觀察。終止培養(yǎng)，然后小心吸去孔內(nèi)培養(yǎng)液。這時每孔中快速加入150 μL DMSO，置于搖床上振蕩10 min，充分溶解結(jié)晶物。在酶聯(lián)免疫檢測儀吸光度（optical delnsity, OD）550 nm處測量各孔的吸光值。

使用改良寇式法進行結(jié)果的計算，可得出細胞的半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration, IC50）。具體公式為：lgIC50=Xm-I[P-(3-Pm-Pn)/4]。

1.4 耐藥細胞株P(guān)C9/GR的制備 肺腺癌細胞株P(guān)C9（對EGFR-TKI敏感）購自廣州呼吸病研究所。經(jīng)過傳代培養(yǎng)之后，取對數(shù)生長期的細胞進行實驗，使用逐步提升濃度體外誘導法誘導其產(chǎn)生耐藥。首先使用MTT法測定吉非替尼對敏感細胞PC9的IC50為（0.01±0.002）μmol/L，然后使用含有0.01 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)48 h，之后更換不含有吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d-7 d，至細胞能夠穩(wěn)定生長并傳代2次，此時再次測定IC50。然后使用含有0.02 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基進行培養(yǎng)48 h，之后更換含有0.01 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基培養(yǎng)5 d-7 d，至細胞能夠穩(wěn)定生長并傳代2次，此時再次測定IC50。以此類推，逐漸提升藥物濃度梯度為0.01 μmol/L、0.02 μmol/L、0.05 μmol/L、0.1 μmol/L、0.2 μmol/L、0.4 μmol/L、1 μmol/L、1.6 μmol/L、3 μmol/L。直至最后，細胞在含有3 μmol/L吉非替尼的培養(yǎng)基中可以穩(wěn)定生長，最后檢測此時處理后的吉非替尼的IC50值，將其命名為PC9/GR，并與所購買的PC9/GR0進行對比，以驗證其是否達到吉非替尼耐藥標準。

1.5 BSP法檢測甲基化水平 取敏感株及耐藥株細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后回收，提取細胞DNA，使用亞硫酸鹽進行甲基化修飾，之后再純化亞硫酸鹽修飾的DNA，然后以此為模板進行PCR擴增。甲基化特異性引物：上游5’-GTTATAGGGGTAGTGGGATATT-3’，下游5’-TAAACAAACTAACCR AACC TTA-3’。PCR反應體系包括10×PCR Buffer 2.5 μL，dNTP Mix 0.5 μL，PCR Primer（igf2 F/igf2 R）0.5 μL/0.5 μL，Template 1 μL，rTaq 0.5 μL，ddH2O 19.5 μL定容至25 μL。反應條件：94 ℃預變性5 min，94 ℃變性30 s、58 ℃退火30 s、72 ℃延伸30 s，共40個循環(huán)。將PCR產(chǎn)物與T載體進行連接，之后進行大腸桿菌的轉(zhuǎn)化、重組菌的鑒定。使用BiQ Analyzer分析軟件對DNA序列和測序序列進行比對。

1.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR 取所培養(yǎng)的不同階段細胞置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，72 h后回收。Trizol法提取細胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，在實時熒光定量PCR儀擴增，GAPDH為內(nèi)參。實時熒光定量PCR：反應體系20 μL體系中，SYBR qPCR Mix 10 μL，上下游引物Mix 1.2 μL（6 pmol），50X ROX reference 0.4 μL（ABI 7500RT-PCR儀器用0.4 μL），cDNA 4 μL，滅菌蒸餾水4.4 μL補齊體系。反應條件：95 ℃ 60 s預變性。95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，進行40個循環(huán)。每組設置3個平行復孔，以△Ct值對結(jié)果進行分析。

1.7 統(tǒng)計學方法 實驗進行中每組重復3次以上，使用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析。計量資料的檢測結(jié)果均以均數(shù)±標準差（Mean±SD）表示，兩組均數(shù)比較用t檢驗，率的比較采用卡方檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 EGFR基因啟動子甲基化與PC9細胞吉非替尼耐藥的相關(guān)性

2.1.1 PC9及PC9/GR細胞形態(tài)學 倒置顯微鏡鏡下見人肺癌細胞PC9（吉非替尼敏感細胞）（圖1A）與PC9/GR（吉非替尼耐藥細胞）（圖1B）形態(tài)呈上皮細胞狀，以貼壁方式生長，貼壁后呈長梭形，形態(tài)無明顯區(qū)別。

2.1.2 PC9及PC9/GR細胞對吉非替尼的耐藥性

2.1.2.1 吉非替尼對PC9細胞增殖的影響 根據(jù)公式求出吉非替尼干預PC9細胞以及PC9/GR細胞48 h的半數(shù)抑制濃度IC50分別為（0.01±0.002） μmol/L、（3.95±0.23） μmol/L（表1、表2）。

2.1.2.2 PC9/GR細胞對吉非替尼的耐藥程度及誘導過程PC9/GR對吉非替尼的耐藥指數(shù)為吉非替尼對PC9/GR細胞的IC50除以吉非替尼對PC9細胞的IC50

經(jīng)過吉非替尼逐步提升濃度體外誘導法干預肺癌敏感細胞株P(guān)C9，吉非替尼對于PC9細胞的半數(shù)抑制濃度隨誘導濃度的上升而不斷上升（圖2）。最終經(jīng)過3 μmol/L吉非替尼干預后所得的PC9細胞根據(jù)上述公式算得耐藥指數(shù)為395。由于其耐藥指數(shù)大于300，且與所購買的耐藥細胞株P(guān)C9/GR0的耐藥指數(shù)（378）進行比較，耐藥程度一致，成功建立模型，命名為PC9/GR細胞，確定為耐吉非替尼的肺癌細胞株，進行下一步的肺癌研究。

2.1.3 PC9及PC9/GR細胞的EGFR基因啟動子甲基化水平檢測 研究檢測了位于人類EGFR基因啟動子區(qū)的甲基化水平，這一區(qū)域共檢測出83個甲基化位點進行比較。每個樣本經(jīng)過亞硫酸氫鹽處理后挑選10個左右克隆測序，結(jié)果所示，發(fā)生異常甲基化位點的甲基化水平變化PC9：59%；PC9/GR：74%，差異具有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖3）。

2.1.4 PC9及PC9/GR細胞的EGFR基因表達 經(jīng)過0.8 μmol/L及3 μmol/L吉非替尼處理得到的PC9/GR細胞株mRNA表達較未經(jīng)過吉非替尼處理的敏感細胞株P(guān)C9明顯增高，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖4）。

2.2 5-Aza-dc干預PC9/GR細胞株TKI敏感性的逆轉(zhuǎn)

2.2.1 經(jīng)5-Aza-dc處理后PC9/GR細胞形態(tài)學 在倒置顯微鏡鏡下見人肺腺癌耐藥細胞PC9/GR細胞（圖5A）形態(tài)呈上皮細胞狀，貼壁方式生長，貼壁后呈長梭形，經(jīng)5-Aza-dc處理后（圖5B）形態(tài)無明顯區(qū)別。

圖 1 人肺腺癌細胞PC9（吉非替尼敏感細胞）（A）及人肺腺癌細胞PC9/GR（吉非替尼耐藥細胞）（B）Fig 1 Human lung adenocarcinoma cell PC9 (gefitinib sensitive) (A)and human lung adenocarcinoma cell PC9/GR (gefitinib resistant) (B)

圖 2 不同濃度（μmol/L）吉非替尼誘導PC9細胞株耐藥過程中IC50（μmol/L）Fig 2 The half maximal inhibitory concentration (IC50) (μmol/L) of PC9 cell in the process of gefitinib resistance

2.2.2 經(jīng)5-Aza-dc處理后PC9/GR細胞的耐藥指數(shù)的變化 吉非替尼干預PC9細胞的IC50為（2.55±0.14）μmol/L（表3）。對照組未經(jīng)5-Aza-dc處理的PC9/GR細胞的IC50為（3.87±0.034）μmol/L（表4）。兩者相比較，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖 3 PC9細胞株EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平（A）及PC9/GR細胞株EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平（B）Fig 3 The methylation of EGFR promoter in PC9 cells (A) and the methylation of EGFR promoter in PC9/GR cells (B)

圖 4 不同耐藥程度PC9細胞EGFR mRNA水平Fig 4 The epidermal growth factor receptor (EGFR) mRNA level of PC9 cell

3 討論

圖 5 人肺腺癌耐藥細胞PC9/GR細胞（A）和5-Aza-dc處理后人肺腺癌耐藥細胞PC9/GR細胞（B）Fig 5 Human lung adenocarcinoma cell PC9/GR (A) and human lung adenocarcinoma cell PC9/GR after treated with 5-Aza-dc (B)

表 1 吉非替尼對PC9細胞增殖的影響Tab 1 Influence of gefitinib to PC9's proliferation

表 2 吉非替尼對PC9/GR細胞增殖的影響Tab 2 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation

表 3 吉非替尼對干預組PC9/GR細胞增殖的影響Tab 3 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation in experiment group

表 4 吉非替尼對對照組PC9/GR細胞增殖的影響Tab 4 Influence of gefitinib to PC9/GR's proliferation in control group

本實驗選用吉非替尼藥物濃度遞增的方法來進行耐藥細胞模型的建立，最終結(jié)果顯示其耐藥性達到了耐藥標準，且與購買的耐藥細胞相比具有良好的一致。耐藥肺癌細胞株P(guān)C9/GR的IC50較敏感株P(guān)C9的IC50明顯升高，這種細胞模型優(yōu)點在于更貼近臨床患者產(chǎn)生耐藥的過程，其造模時間約為4個月（第28代細胞），與臨床出現(xiàn)耐藥的時間大致吻合。

實驗表明，PC9/GR細胞株甲基化水平與PC9細胞株相比，異常甲基化升高。TKI耐藥的肺癌細胞其EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平較TKI敏感的肺癌細胞更高。在多種腫瘤已經(jīng)證實，DNA啟動子區(qū)域的甲基化狀態(tài)和腫瘤耐藥可能相關(guān)。Scartozzi等[9]進行52例結(jié)直腸癌的EGFR基因甲基化水平和EGFR單克隆抗體治療敏感性之間關(guān)系的分析，結(jié)果顯示，EGFR基因出現(xiàn)甲基化患者的疾病控制率和客觀緩解率均顯著低于EGFR基因未甲基化患者。Montero等[10]研究表明，存在有EGFR基因甲基化的乳腺癌細胞株CAMA1和MB453對吉非替尼敏感性低。EGFR表達量的變化可能是甲基化水平變化的一個影響結(jié)果。不同種類肺癌細胞株的EGFR mRNA表達水平和啟動子甲基化水平存在差別，產(chǎn)生差異的分子機制尚不明確。另外，同一種細胞的EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平也可能有多種途徑調(diào)控，甲基化也可能影響EGFR表達。本研究結(jié)果顯示，耐藥株細胞EGFR基因的mRNA表達量較敏感株高，與某些研究的不同種肺癌細胞株的結(jié)果相異，推測啟動子甲基化不是影響EGFR mRNA表達的唯一原因。

實驗結(jié)果提示經(jīng)去甲基化藥物5-Aza-dc處理之后，耐藥細胞株P(guān)C9/GR對吉非替尼的敏感性有所回升，提示去甲基化藥物5-Aza-dc作用于PC9/GR后，可以使其耐藥性在一定程度上逆轉(zhuǎn)，吉非替尼對PC9的抑制增殖作用加強。研究發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用去甲基化藥物5-Aza-dc可以增強原TKI不敏感肺腺癌細胞株H1650、H1299對吉非替尼的敏感性。同樣類似的結(jié)果可以在其余腫瘤的治療中發(fā)現(xiàn)。張曉偉等的研究提示，DNA甲基化和鼻咽癌細胞紫杉醇的耐藥形成有關(guān)，使用5-aza-dc對鼻咽癌紫杉醇敏感細胞以及紫杉醇耐藥細胞的增殖均有一定的抑制作用，而紫杉醇耐藥細胞對其表現(xiàn)出更高的敏感性。經(jīng)5-aza-dc處理之后的耐藥細胞對紫杉醇藥物的敏感性明顯上升，從而可以部分程度逆轉(zhuǎn)鼻咽癌對紫杉醇的化療耐藥[11]。5-Aza-dc是一種常用的去甲基化藥物，其臨床藥物已經(jīng)被美國食品藥品監(jiān)督管理局批準使用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤治療當中，在多種實體瘤的應用同時正在臨床研究中，然而，由于其在各臨床研究中所用劑量普遍較高，副作用較大，實體瘤的研究中并未得到預想的結(jié)果。然而，低劑量的應用方法被一些研究者認同。本試驗采用低劑量干預[8,12]，結(jié)果顯示在一定程度上吉非替尼藥物敏感性恢復。

總之，PC9細胞株繼發(fā)性TKI耐藥后，其EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平升高。使用去甲基化藥物5-Aza-dc干預后，其對吉非替尼的敏感性在一定程度上恢復，其繼發(fā)性耐藥的出現(xiàn)可能與EGFR啟動子區(qū)域甲基化水平升高有關(guān)。