王旭洲 陳煒生 余英豪

肺癌是當(dāng)前最常見的惡性腫瘤之一，也是導(dǎo)致死亡的主要原因，非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）約占所有肺癌病例的85%以上[1,2]，目前，表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）、動物微管相關(guān)蛋白4與間變性淋巴瘤激酶融合基因（echinodem microtubule associated protein like 4-Anaplastic lymphoma kinase,EML4-ALK）等相關(guān)位點突變檢測研究已經(jīng)成為肺癌分子靶向治療的熱門方向，相關(guān)的靶向抑制劑吉非替尼、厄洛替尼、克唑替尼目前也廣泛應(yīng)用于臨床，并顯示其較好的治療效果[3-6]。ALK靶向藥物克唑替尼（Crizotinib）臨床前試驗中將熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）作為EML4-ALK融合基因的檢測方法。本文擬通過對NSCLC腫瘤組織EML4-ALK融合基因與EGFR基因突變狀態(tài)進(jìn)行研究，著重探討聯(lián)合運用免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）/蝎形探針擴(kuò)增阻滯突變系統(tǒng)（Scorpions amplification refractory mutation system,Scorpions ARMS）/FISH技術(shù)檢測EML4-ALK基因突變狀態(tài)的可行性。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集南京軍區(qū)福州總醫(yī)院病理科2013年2月-2014年3月間確診的NSCLC 115例，其中男性71例，女性44例；年齡37歲-76歲，平均51.3歲；115例標(biāo)本中，肺原位腺癌，即以往分類稱為細(xì)支氣管肺泡癌（bronchioloalveolar carcinoma,BAC）33例、其他類型腺癌66例、鱗癌9例、大細(xì)胞癌7例。按TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：I期41例、II期39例、III期24例、IV期11例。所有患者術(shù)前均未接受過抗腫瘤治療。選取標(biāo)準(zhǔn)：（1）治療前病理檢查明確診斷為NSCLC，且組織石蠟標(biāo)本保存完整；（2）無相關(guān)禁忌癥，治療前沒有發(fā)現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移；（3）入院前未接受放化療等相關(guān)治療，有可供觀察的影像學(xué)及其相關(guān)臨床治療資料。

1.2 臨床病理學(xué)資料 所有檢測病例均收集手術(shù)切除標(biāo)本，根據(jù)2011年美國國立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)（National Comprehensive Cancer Network,NCCN）指南進(jìn)行標(biāo)本檢查和選取活檢材料，組織標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林溶液固定處理、石蠟包埋、切片和HE及免疫組化染色，由兩名有經(jīng)驗的病理醫(yī)師進(jìn)行診斷及病理分型。

1.3 材料與試劑 免疫組化染色采用SP法，兔抗人ALK單克隆抗體（克隆號D5F3）及其試劑盒均為即用型，購自美國Cell Signaling Technology,Inc（CST）公司?；顧z組織DNA提取試劑為MagCore公司、RNA提取試劑為QIAGEN公司產(chǎn)品；RNA逆轉(zhuǎn)錄DNA，EML4-ALK融合基因21位點（表1）突變以及EGFR突變基因檢測均為廈門艾德公司試劑；FISH檢測EML4-ALK試劑為杭州極地基因生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.4 免疫組化檢測 染色步驟按照試劑盒說明書進(jìn)行，新鮮配制DAB顯色劑顯色。每批染色設(shè)陽性和陰性對照，陰性對照以PBS取代I抗，陽性對照為已知陽性片。EML4-ALK（D5F3）在NSCLC組織中陽性表達(dá)為細(xì)胞質(zhì)和（或）細(xì)胞膜著色。每例切片隨機(jī)觀察5個高倍視野，按陽性細(xì)胞百分比及著色強(qiáng)度綜合計分做半定量積分法判斷結(jié)果。

1.5 組織RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄DNA 組織RNA的提?。呵腥〗M織樣品5 μm-10 μm（樣品表面不要接觸空氣），二甲苯脫蠟，混勻10 s；室溫下離心2 min，吸去上清，加入1 mL無水乙醇，震蕩混勻，室溫下離心2 min，吸去上清，室溫或37 ℃晾干，沉淀中加240 μL Buffer PKD和10 μL蛋白酶K，56 ℃孵化15 min，80 ℃孵化15 min，降至室溫后，加入1/10體積的DNase Booster Buffer 25 μL和10 μL DNase I原液，迅速離心，室溫孵育15 min加入500 μL Buffer RBC，并充分混勻，加1,200 μL無水乙醇，取700 μL樣品轉(zhuǎn)移至MinElute離心柱里≥10,000 rpm離心15 s，棄廢液，重復(fù)上一步直到全部樣品都轉(zhuǎn)移到MinElute離心柱里。加入500 μL Buffer RPE，≥10,000 rpm離心15 s，棄廢液。加入500 μL Buffer RPE，≥10,000 rpm離心2 min將柱子放入干凈的2 mL收集管，全速空管離心5 min，柱子轉(zhuǎn)移到干凈的1.5 mL收集管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加14 μL-30 μL RNase-free水，離心1 min收集RNA。

表1 EML4-ALK（ARMS方法）融合基因檢測類型Tab1 EML4-ALK (ARMS) fusion gene detection type

逆轉(zhuǎn)錄DNA：取逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液18.5 μL，逆轉(zhuǎn)錄酶0.5 U；加入RNA樣品6 μL；42 ℃保溫1 h；95 ℃保溫5 min后冰上冷卻，得到cDNA溶液進(jìn)行熒光定量PCR檢測。

1.6 ARMS法 每管試劑均按照每測試中含35 μL反應(yīng)液和0.3 μL Taq酶的比例，震蕩混勻15 s，快速離心15 s，以每管35 μL分裝到PCR反應(yīng)管中。分別加入cDNA 5 μL，按照第一階段：95 ℃ 5 min 1個循環(huán)；第二階段：95 ℃ 25 s，64 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s 15個循環(huán)；第三階段：93 ℃ 25 s，60 ℃ 35 s，72 ℃ 20 s 31個循環(huán)；在第三階段60 ℃時收集FAM信號，執(zhí)行熒光定量PCR程序。探針收集模式設(shè)置為Reporter Dye: FAM；Quencher Dye: TAMせ/VIC；Passive Reference:NONE。

1.7 FISH法 參照產(chǎn)品說明中操作步驟進(jìn)行試驗。

1.8 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SSPS 13.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，計數(shù)資料比較采用χ2檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 IHC中EML4-ALK（D5F3）表達(dá) 115例NSCLC中32例有D5F3表達(dá)，83例未見表達(dá)，總表達(dá)率為27.8%；其中IHC 1+6例（5.2%）；IHC 2+ 15例（13%）；IHC 3+ 11例（9.6%）。

2.2 ARMS法EML4-ALK融合基因突變情況 115例中27例檢出EML4-ALK融合基因突變，突變率為23.5%，對比IHC結(jié)果：IHC 1+為3例（2.6%）（P＜0.05）；IHC 2+為13例（11.3%）（P＜0.05）；IHC 3+為11例（9.5%）（P＞0.05），有88例未檢出EML4-ALK融合基因（P＞0.05）（圖1）；其中IHC 3+的11例均檢測出EML4-ALK融合基因突變；陽性表達(dá)率符合率為100%，83例IHC未表達(dá)的病例也均未檢測出EML4-ALK融合基因。EML4拼接EML4-ALKvariant 1外顯子13 variant 3a/b-/-/ins69/-/-/-/EML4-ALKvariant 3a/b外顯子6 variant 1-/-/ins33/-/EML4-ALKvariant 2外顯子20 variant 2-/-/ins18/-與ALK拼接外顯子20的融合類型有23例；EML4拼接EML4-ALKvariant 5a/b外顯子2-/ins117外顯子17 ins68與ALK拼接外顯子20的融合類型有4例；上述兩種同時存在的有3例。

2.3 FISH法中EML4-ALK融合基因表達(dá)情況 115例中，23例檢測出EML4-ALK基因位點融合，檢出率為20%，其中對比IHC結(jié)果顯示：IHC 1+為1例；IHC 2+為11例；IHC 3+為11例，有92例FISH未檢出EML4-ALK融合基因；IHC 3+的11例均檢測出EML4-ALK融合基因突變，陽性表達(dá)率符合率為100%，IHC未表達(dá)的83例中也均未檢測出EML4-ALK融合基因（圖2）。

2.4 ARMS法中EGFR基因突變情況 115例中共檢測出EGFR基因突變53例（46%），其中19外顯子del突變有32例；20外顯子T790M耐藥基因突變的有5例；21外顯子L858R突變的有9例；21外顯子L861Q突變的有6例；20外顯子罕見S761I罕見基因突變的有1例。6例EGFR突變基因與EML4-ALK融合基因同時發(fā)生突變，而5例T790M突變的中有3例與其他位點同時存在。

3 討論

EML4-ALK基因是NSCLC的一個潛在治療靶點，目前已有了ALK抑制劑-克唑替尼[7,8]，克唑替尼同時也是MET/HGF受體酪氨酸激酶抑制劑?？诉蛱婺釋儆谝环N選擇性ATP競爭性小分子抑制劑，c-Met/肝細(xì)胞生長因子受體（hepatocyte growth factor receptor,HGFR）和ALK酪氨酸激酶及他們的致癌變異體有抑制作用[8-11]。本研究顯示ALK（D5F3）在NSCLC的表達(dá)率為27.8%，與相關(guān)報道[12,13]的數(shù)據(jù)接近。將IHC方法劃分為1+/2+/3+不同的表達(dá)水平，通過不同分子技術(shù)進(jìn)行進(jìn)一步驗證檢測，發(fā)現(xiàn)AMRS和FISH檢測得到如下結(jié)果：IHC 1+：6例，AMRS檢測出3例，符合率為50.0%，F(xiàn)ISH檢測出1例，符合率為17.0%；IHC 2+：15例，AMRS檢測出13例，符合率為87.0%，F(xiàn)ISH檢測出11例，符合率為73.3%；IHC 3+ 11例，AMRS檢測出11例，符合率為100.0%，F(xiàn)ISH檢測出11例，符合率為100%；其EML4-ALK融合基因與蛋白表達(dá)呈正比關(guān)系，IHC 3+表達(dá)與AMRS和FISH的一致性為100.0%。說明運用ALK（D5F3）IHC對NSCLC病例進(jìn)行篩查，就能對陰性及IHC 3+病例做出初步判斷，再對IHC 1+以上病例進(jìn)行分子病理驗證，能夠快速、準(zhǔn)確對融合基因突變位點做出判斷。同時從三種方法的符合率上也發(fā)現(xiàn)了IHC方法的不確定性，最終確定結(jié)果還需要以分子表達(dá)為依據(jù)。本文結(jié)果顯示，RT-PCR與FISH法陽性率基本相似。但與PCR不同，F(xiàn)ISH不能鑒別出不同的EML4-ALK融合基因變異體，且成本更高，分離的熒光信號不易解釋。運用AMRS技術(shù)檢測EML4-ALK融合基因有著敏感性較強(qiáng)的優(yōu)勢，且能夠區(qū)分相應(yīng)的融合基因分型[12]，結(jié)合FISH方法可以對肺癌，特別是NSCLC中EML4-ALK融合基因狀態(tài)做出準(zhǔn)確推測。

圖1 HE與IHC顯色對應(yīng)情況。A、B：實性腺癌（HE染色，×10）；C：管狀腺癌（HE染色，×20）；D：IHC 2+（IHC SP法，×10）；E：IHC 3+（IHC SP法，×10）；F：IHC 1+（IHC SP法，×20）；圖片D、E、F分別與HE圖片A、B、C相對應(yīng)。Fig1 The HE and IHC color correspondence. A,B: solid adenocarcinoma (HE staining,×10); C: tubular adenocarcinoma (HE staining,×20); D:IHC 2+ (IHC SP method,×10); E: IHC 3+ (IHC SP method,×10); F: IHC 1+ (IHC SP method, ×20). Image D,E,F,are corresponding to image A,B,C,respectively. HE: hematoxylin-eosin staining; IHC: immunohistochemistry.

圖2 FISH雙分離探針信號表達(dá)。A：FISH雙分離探針（IHC 3+）陽性信號表達(dá)；B：FISH雙分離探針（IHC 1+）陰性信號表達(dá)。Fig2 FISH dual probe signal separation expression.A: FISH dual separation of the probe (IHC 3+) positive signal representation; B: FISH dual probe (IHC 1+) signal separation negative expression. FISH: fluorescence in situ hybridization.

以往在肺癌檢測相應(yīng)的驅(qū)動基因中通常認(rèn)為EGFR與EML4-ALK融合基因存在排斥性，不能同時出現(xiàn)其EGFR與EML4-ALK融合基因的同時突變[13-15]。我們通過研究發(fā)現(xiàn)了6例上述兩種驅(qū)動基因的同時突變，在AMRS方法檢測的同時，應(yīng)用FISH方法進(jìn)行了驗證，均顯示相同結(jié)果。因此，我們認(rèn)為EGFR與EML4-ALK融合基因雙突變并非完全排斥，只是這種情況存在的幾率偏低。

另外，在NSCLC中融合基因陽性率是否存在地理或種族差異；EML4-ALK融合基因是否確實是克唑替尼療效的預(yù)測分子；克唑替尼是否比現(xiàn)有的治療手段有更明顯的客觀療效和生存期優(yōu)勢；對共存突變的NSCLC患者，多靶點抑制劑會不會是更好的選擇仍有待于進(jìn)一步研究。但融合基因作為NSCLC新的驅(qū)動基因亞型，以及對EML4-ALK、ROS1、RET等基因作用研究不斷深入，充分表明了融合基因在NSCLC中的重要作用[16-18]。