孟輝 高獻(xiàn)爭(zhēng) 張嵐 劉芳 李文才

間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）是一種酪氨酸蛋白激酶，最早在間變性淋巴瘤的一個(gè)亞型中被發(fā)現(xiàn)，故得此名。2007年發(fā)現(xiàn)在非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer,NSCLC）中，由于染色體易位引起間變性淋巴瘤激酶（anaplastic lymphoma kinase,ALK）重排，導(dǎo)致棘皮動(dòng)物微管相關(guān)蛋白4（echinodermmicro tubule associated protein like 4,EML4）-ALK融合基因形成，催化ALK激酶持續(xù)活化，激活下游信號(hào)通路，刺激腫瘤細(xì)胞的無限制增殖[1]。繼表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor,EGFR）突變之后，ALK重排是又一個(gè)NSCLC的驅(qū)動(dòng)基因，ALK重排NSCLC已經(jīng)成為了肺癌的一種新的亞型。這類患者約占5%-7%的NSCLC[2]，通常預(yù)后較差[3]。臨床上ALK重排的檢測(cè)方法主要有熒光原位雜交（fluorescencein situhybridization,FISH）、免疫組織化學(xué)（immunohistochemistry,IHC）和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈擴(kuò)增法（reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR）[4]。其中FISH和RT-PCR是在基因?qū)用嫔蠙z測(cè)ALK重排，IHC是在蛋白表達(dá)層面上檢測(cè)ALK重排。各種方法的靈敏度、特異性以及對(duì)標(biāo)本的需求等各有不同[4,5]。FISH和PCR的靈敏度和特異性較高，適用于ALK診斷，但是這兩種方法的費(fèi)用較高，檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)。RT-PCR還需要新鮮組織，對(duì)標(biāo)本需要量大。常規(guī)IHC費(fèi)用較低，檢測(cè)時(shí)間短，但是結(jié)果的判讀有一定的主觀性，可用于ALK陽性NSCLC的篩查，陽性結(jié)果需要FISH或PCR驗(yàn)證。增強(qiáng)免疫組化法（enhancing ventana-IHC,V-IHC）采用了特異性很強(qiáng)的抗ALK（D5F3）的兔單克隆抗體結(jié)合增強(qiáng)DAB染色液和增強(qiáng)擴(kuò)增試劑盒的檢測(cè)體系，使用BenchMark XT平臺(tái)進(jìn)行自動(dòng)化染色，洗片，背景干凈，陽性信號(hào)強(qiáng)，結(jié)果容易判定。為了在臨床上準(zhǔn)確快速地找到ALK陽性的NSCLC患者，選擇一種特異，靈敏并且價(jià)廉的方法非常重要。為此本研究將利用V-IHC檢測(cè)本中心172例NSCLC患者的ALK重排，陽性的患者進(jìn)一步使用FISH進(jìn)行驗(yàn)證，比較V-IHC和FISH檢測(cè)方法的相關(guān)性，分析V-IHC作為臨床NSCLC患者ALK重排常規(guī)診斷方法的可行性。

1 資料與方法

1.1 臨床樣本采集 收集鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2014年1月-2014年5月172例NSCLC患者組織標(biāo)本，所有標(biāo)本來源于經(jīng)皮肺穿刺術(shù)、纖維支氣管鏡和（或）頸部、鎖骨上淋巴結(jié)活檢和手術(shù)標(biāo)本，且病理診斷為NSCLC。

1.2 樣本處理流程標(biāo)本處理 標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定6 h-24 h，常規(guī)標(biāo)準(zhǔn)自動(dòng)脫水，石蠟包埋。切片厚約4 μm，用于HE染色、V-IHC和FISH檢測(cè)。V-IHC檢測(cè)使用正電荷載玻片。

1.3 HE染色 采用HE染色觀察組織細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞核染色呈深藍(lán)色，胞漿染色呈深淺不同的粉紅色，顯示各種組織細(xì)胞成分的形態(tài)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。

1.4 V-IHC檢測(cè) 參照V-IHC試劑盒說明書進(jìn)行。采用抗ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（免疫組織化學(xué)法）染色對(duì)福爾馬林固定、石蠟包埋的NSCLC組織切片進(jìn)行臨床評(píng)估，使用增強(qiáng)DAB染色液和增強(qiáng)擴(kuò)增試劑盒，在VENTANA BenchMark XT平臺(tái)進(jìn)行染色。分別選取組織切片用于抗ALK（D5F3）兔單克隆抗體試劑（免疫組織化學(xué)法），兔單克隆陰性質(zhì)控抗體，ALK陽性NSCLC病例及ALK陰性NSCLC病例作為系統(tǒng)水平質(zhì)控，以確保染色儀器系統(tǒng)和相關(guān)檢測(cè)試劑的性能合乎要求。如果這種系統(tǒng)水平質(zhì)控不合格，就應(yīng)重新染色。

1.5 FISH法檢測(cè)ALK融合基因 參照原位雜交試劑盒說明書（vysis ALK-FISH-break-apart Kit）進(jìn)行，略加改進(jìn)。使用前，先于病例組與對(duì)照組的HE染色標(biāo)本中找到有癌灶部位。在找到的癌灶部位利用靶基因DNA探頭對(duì)標(biāo)志基因進(jìn)行檢測(cè)。具體步驟：切片預(yù)處理：4 μm-5 μm石蠟切片65 ℃烤片3 min，常規(guī)脫蠟至水，滴加已復(fù)溫的酶預(yù)處理液，室溫孵育5 min-10 min，蒸餾水洗3次，每次2 min，中性甲醛室溫固定10 min。梯度乙醇脫水（75%、85%、100%乙醇各2 min脫水），自然干燥或電吹風(fēng)吹30 s。變性與雜交：每片滴加10 μL ALK探針混合物，立即用專用雜交蓋片覆蓋81 ℃變性6 min-10 min，42 ℃，雜交過夜（超過10 h）；洗滌：浸入0.4×SSC/0.3%NP-40洗滌液1.5 min，后浸入2×SSC/0.1%NP-40洗滌液0.5 min。70%乙醇洗滌5 min，自然干燥。10 μL-15 μL DAPI復(fù)染。

1.6 結(jié)果判讀 根據(jù)V-IHC試劑盒說明書，ALK陽性腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是任何百分比的腫瘤細(xì)胞的胞漿內(nèi)有很強(qiáng)的顆粒狀染色。FISH法參照原位雜交試劑盒說明書，ALK重排的腫瘤細(xì)胞特征是橘紅色和綠色信號(hào)互相分離，間距至少超過2個(gè)信號(hào)直徑。無ALK重排的腫瘤細(xì)胞特征是橘紅色和綠色信號(hào)重合為黃色或者相互粘合。FISH陽性結(jié)果的判定標(biāo)準(zhǔn)是計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，如果至少有25個(gè)（50%）的細(xì)胞存在信號(hào)分離，直接判定為陽性。如果信號(hào)分離的細(xì)胞僅為10%-50%，則需要重復(fù)計(jì)數(shù)50個(gè)腫瘤細(xì)胞，累加100個(gè)細(xì)胞中至少15個(gè)細(xì)胞存在信號(hào)分離（≥15%），則為ALK陽性。

2 結(jié)果

2.1 NSCLCALK重排的V-IHC檢測(cè) 采用系統(tǒng)水平質(zhì)控排除非特異性背景染色。這些非特異染色包括：肺泡巨噬細(xì)胞中淺色的胞漿點(diǎn)狀著色，神經(jīng)來源的細(xì)胞（神經(jīng)細(xì)胞和神經(jīng)節(jié)細(xì)胞）和腺上皮染色，淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)中一些散在的淋巴網(wǎng)狀細(xì)胞及NSCLC中正常粘液（包括粘蛋白）內(nèi)以及壞死區(qū)域的染色。ALK陽性的判定標(biāo)準(zhǔn)是任何百分比的腫瘤細(xì)胞內(nèi)很強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色，在整個(gè)腫瘤中有著一致的強(qiáng)度（圖1）。利用以上標(biāo)準(zhǔn)判定檢測(cè)在172例NSCLC患者有12例為ALK重排陽性，陽性率為6.98%。陽性標(biāo)本中男性8例，女性4例。組織學(xué)分型8例為腺癌，4例為鱗狀細(xì)胞癌（圖2），其中有1例為鱗狀上皮原位癌。在這些ALK陽性病例中，腫瘤臨床分期66.7%（8/12）為肺癌中晚期（III期-IV期）。ALK融合基因陽性NSCLC患者的臨床病理特征見表1。

圖1 肺腺癌ALK增強(qiáng)免疫組化染色及FISH染色。肺腺癌組織增強(qiáng)免疫組化染色顯示ALK蛋白表達(dá)陽性（A：陽性，×100），ALK陽性腫瘤病例中存在很強(qiáng)的顆粒狀胞漿染色，信號(hào)均勻分布，在整個(gè)腫瘤部分中有著一致的強(qiáng)度；兔單克隆陰性質(zhì)控抗體對(duì)照?qǐng)D片（B：×100），A、B圖顯示為同一個(gè)腫瘤組織標(biāo)本；FISH檢測(cè)（C：陽性，×1,000）。Fig1 ALK fusion gene in lung adenocarcinoma (V-IHC and FISH). ALK fusion protein positive in lung adenocarcinoma (A: positive,×100),strong granular cytoplasmic staining exists strong tumor cases,with the uniform signal distribution and the same intensity in the whole tumor section;Rabbit monoclonal antibody negative quality control section (B: ×100). A,B display tissue specimens for the same tumor; FISH detection (C:positive,×1,000).

表1 172例非小細(xì)胞肺癌患者的臨床和病理特征Tab1 Clinical and pathological characteristics of 172 cases of non-small cell lung cancer

2.2 FISH驗(yàn)證 對(duì)V-IHC檢測(cè)到的12例ALK陽性的患者標(biāo)本行FISH驗(yàn)證，陽性判定的標(biāo)準(zhǔn)是計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，至少有15個(gè)細(xì)胞呈現(xiàn)紅綠信號(hào)的分離，且距離超過2個(gè)信號(hào)直徑（圖1C）。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)判定11例患者為FISH陽性，1例為FISH陰性，符合率為91.7%（11/12）。這例FISH陰性的患者（鱗狀細(xì)胞癌）V-IHC染色呈現(xiàn)出染色不均的特點(diǎn)（圖2A）。

3 討論

圖2 肺鱗癌ALK融合基因增強(qiáng)免疫組化染色（×100）。A：肺鱗癌增強(qiáng)免疫組化染色ALK陽性癌灶部位（箭頭所示）；B：圖片A的單克隆陰性對(duì)照?qǐng)D片（箭頭所示為同一癌灶部位）；C：肺鱗癌增強(qiáng)免疫組化染色強(qiáng)的顆粒狀著色，陽性效果顯著；D：圖片C的單克隆陰性對(duì)照?qǐng)D片。Fig2 ALK fusion gene in lung squamous cell carcinoma using V-IHC staining way (×100). A display ALK positive of V-IHC staining in pulmonary squamous cell carcinoma (arrow); B shows a monoclonal negative control section of A (arrow shows the same position of the squamous cell carcinoma tissue); C: Strong V-IHC positive granular staining of ALK in lung squamous cell carcinoma; D: Rabbit monoclonal antibody negative quality control section of C.

在ALK重排被發(fā)現(xiàn)為NSCLC的驅(qū)動(dòng)因素的4年后，ALK激酶抑制劑-克唑替尼（Crizotinib，中文商品名：賽可瑞）于2011年在美國被批準(zhǔn)治療ALK陽性的局部晚期和轉(zhuǎn)移性NSCLC?？诉蛱婺嵋痪€治療的客觀緩解率（objective response rate,ORR）為74%，中位無疾病進(jìn)展生存期（median progression free survival,m-PFS）為10.9 mo。二線治療的有效率為50%-60%，m-PFS為7.0 mo[6-8]。隨著靶向藥物克唑替尼2013年在中國上市，面對(duì)中國每年肺癌的新發(fā)病例接近35,000例的現(xiàn)狀，臨床上迫切需要尋找經(jīng)濟(jì)簡(jiǎn)便的方法，準(zhǔn)確快速地找到ALK陽性的NSCLC患者。由羅氏公司開發(fā)的V-IHC診斷試劑盒已經(jīng)在歐洲和中國獲批用于診斷ALK陽性NSCLC。由于其自動(dòng)化操作，可使檢測(cè)流程和判讀得以標(biāo)準(zhǔn)化。該技術(shù)平臺(tái)使用了基于非內(nèi)源性半抗原，信號(hào)擴(kuò)增多聚體和辣根過氧化酶（HRP）的染色信號(hào)方法技術(shù)，在不影響特異性的前提下，提高了ALK檢測(cè)的靈敏度。結(jié)果判讀采用二分類，即僅為陰性和陽性，陽性結(jié)果即可診斷為ALK陽性NSCLC。有研究證實(shí)V-IHC與FISH結(jié)果的吻合率為98.8%，判讀的重復(fù)性為99.7%。本中心利用V-IHC方法對(duì)172例NSCLC患者行ALK檢測(cè)，有12例為ALK陽性。陽性的標(biāo)本再經(jīng)過FISH驗(yàn)證，11例為FISH陽性，V-IHC和FISH檢測(cè)ALK重排的符合率91.7%。而且將12例陽性病例進(jìn)行EGFR突變檢測(cè)，結(jié)果均為野生型，數(shù)據(jù)未提供。

對(duì)于V-IHC檢測(cè)ALK陰性的標(biāo)本是否需要FISH驗(yàn)證？有研究[9]比較了217例經(jīng)過V-IHC檢測(cè)為ALK陰性的患者行FISH驗(yàn)證，同樣也是ALK陰性?；谠撗芯繑?shù)據(jù)和出于檢測(cè)費(fèi)用的考慮，本研究對(duì)V-IHC檢測(cè)ALK陰性的標(biāo)本沒有再行FISH驗(yàn)證。

與常規(guī)IHC手動(dòng)洗片不同，V-IHC采用強(qiáng)度較大的機(jī)器洗片，以減少背景干擾。為了避免標(biāo)本在洗滌過程中脫落，推薦使用正電荷載玻片，切片厚度為3 μm-5 μm。在V-IHC檢測(cè)為ALK陽性的標(biāo)本中有1例存在著染色不均的現(xiàn)象（圖2A、圖2B）。本例FISH檢測(cè)時(shí)可以計(jì)數(shù)到足夠數(shù)量的腫瘤細(xì)胞，但是結(jié)果為FISH陰性。推測(cè)可能存在熒光原位雜交探針未覆蓋或染色過程中脫片等原因，也可能和腫瘤異質(zhì)性有關(guān)。

為了減少染色不均的現(xiàn)象，固定液必須是10%中性福爾馬林，在操作上確保固定時(shí)間不要低于6 h，組織塊與固定液要充分接觸。建議外科醫(yī)生在固定之前對(duì)手術(shù)大標(biāo)本切割2刀-3刀，使標(biāo)本充分浸泡于固定液中。腫瘤異質(zhì)性指的是腫瘤不同部位，或者原發(fā)瘤和轉(zhuǎn)移瘤的基因表達(dá)不一致的現(xiàn)象。為了避免腫瘤異質(zhì)性對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響，最好對(duì)腫瘤多點(diǎn)取樣同步檢測(cè)。V-IHC可在亮視野中觀察，對(duì)于觀察染色不均及腫瘤異質(zhì)性的標(biāo)本V-IHC較FISH有一定優(yōu)勢(shì)，如圖2。

對(duì)于V-IHC染色不均的患者，在標(biāo)本足夠的情況下最好采用FISH驗(yàn)證。但是FISH的判讀必須要計(jì)數(shù)100個(gè)腫瘤細(xì)胞，至少有15%的陽性細(xì)胞才能判定為陽性。有時(shí)候小活檢標(biāo)本量太少，難以滿足100個(gè)細(xì)胞的計(jì)數(shù)，可能會(huì)影響FISH的判讀，導(dǎo)致判斷為FISH陰性。

ALK重排在東亞地區(qū)肺癌患者中的發(fā)生率約為3%-7%[10]。本研究發(fā)現(xiàn)ALK重排在中國患者中為6.89%，接近于東亞人群。ALK陽性的NSCLC以腺癌為主，鱗癌非常少見[11]。我們研究發(fā)現(xiàn)6.9%的鱗癌患者為ALK陽性，高于文獻(xiàn)的報(bào)道。推測(cè)可能為鱗癌組織里混有腺癌的成分。進(jìn)一步重復(fù)檢測(cè)，排除了腺鱗癌的可能。由于該研究樣本量比較小，難以反映鱗癌中ALK陽性比例，需要加大樣本量予以驗(yàn)證。無論怎樣，ALK陽性的鱗癌患者也是克唑替尼的適用人群。

總的來說，V-IHC靈敏度和特異性高于常規(guī)IHC，結(jié)果容易判讀。V-IHC與FISH比較吻合度高，價(jià)格便宜，檢測(cè)時(shí)間短。標(biāo)本用量小，僅需要1-2張石蠟切片。V-IHC是NSCLC的ALK檢測(cè)切實(shí)可行的方法，適用于ALK陽性NSCLC的診斷。