魏靜娜，劉征輝，趙琳琳，郭永澤，程　奕，溫春秀

（1.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津300381；2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津300381；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，石家莊050051）

·中藥研究·

知母藥材的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜研究*

魏靜娜1，劉征輝1，趙琳琳1，郭永澤2，程奕2，溫春秀3

（1.天津海世達(dá)檢測(cè)技術(shù)有限公司，天津300381；2.天津市農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測(cè)技術(shù)研究所，天津300381；3.河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所，石家莊050051）

［目的］建立知母藥材的高效液相色譜儀-二極管陣列檢測(cè)器-蒸發(fā)光散射檢測(cè)器聯(lián)用（HPLC/PDA/ELSD）指紋圖譜。［方法］采用Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.1%冰醋酸，梯度洗脫流速1.0 mL/min，柱溫30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)258 nm，ELSD檢測(cè)器載氣氣壓30 Psi，漂移管溫度80℃。［結(jié)果］建立了知母的HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜，在HPLC-PDA色譜圖中標(biāo)定了17個(gè)共有峰，HPLC-ELSD色譜圖中標(biāo)定了14個(gè)共有峰。［結(jié)論］該方法重復(fù)性好，可用于知母藥材的全面質(zhì)量控制。

知母；指紋圖譜；HPLC/PDA/ELSD

知母為百合科植物知母（Anemarrhena asphodeloides Bge.）的干燥根莖，主產(chǎn)于河北、山西及山東等地。春、秋兩季采挖，除去須根及泥沙，曬干，或除去外皮，曬干。切片入藥，生用，或鹽水炙用?，F(xiàn)代藥理研究表明，知母具有抗炎［1-4］、降血糖［5-8］、抗阿爾茨海默?。?-12］等作用，臨床應(yīng)用安全可靠，毒副作用小［13］。在知母藥材的全面質(zhì)量控制方面，目前文獻(xiàn)報(bào)道的，多為采用紫外檢測(cè)器或者蒸發(fā)光散射檢測(cè)器得到的一維圖譜［14-15］，文章采用二級(jí)管陣列/蒸發(fā)光散射（PDA/ELSD）兩種檢測(cè)器串聯(lián)的方式，對(duì)河北省不同栽培區(qū)域的知母藥材指紋圖譜進(jìn)行研究，得到了更加全面的知母藥材質(zhì)量控制方案。

1　儀器與材料

Waters 2695高效液相色譜儀（配有Waters2996 PDA檢測(cè)器，Waters2424 ELSD檢測(cè)器，Empower2色譜工作站），分析天平（METTLERXS205，METTLER AB54），Milli-Q超純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

芒果苷（111607-200402，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所），新芒果苷（X-032-140602，純度≥98%，購(gòu)自成都瑞芬思科技有限公司），知母皂苷BII（111839-201102，純度90.8%，購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所），乙腈（色譜純，Merck公司），冰乙酸（色譜純，天津康科德科技有限公司），乙醇（分析純，天津風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司）。

知母藥材來(lái)源見(jiàn)表1，經(jīng)河北省農(nóng)林科學(xué)院經(jīng)濟(jì)作物研究所溫春秀研究員鑒定為百合科植物知母。

表1　知母藥材來(lái)源Tab.1Origins of Rhizoma Anemarrhenae

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）。流動(dòng)相：乙腈（A）-0.1%冰醋酸（B），梯度洗脫：0～10 min，5%～18%A；10～15 min，18%～25%A；15～25 min，25%A；25～50 min，25%～100%A；50～55 min，100%A；55～60 min，100%～5%A；60～75 min，5%A；流速：1.0 mL/min。PDA檢測(cè)器檢測(cè)波長(zhǎng)：258 nm，ELSD檢測(cè)器：氮?dú)鈮毫?0Psi，漂移管溫度80℃，進(jìn)樣體積：20μL。

2.2對(duì)照品溶液的制備精密稱(chēng)取新芒果苷，芒果苷，知母皂苷BII，加70%乙醇，制成每mL含0.10 mg的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

2.3供試品溶液的制備取干燥的知母藥材粉末（過(guò)60目篩）0.5 g，精密稱(chēng)定，置于50 mL的具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇25 mL，稱(chēng)定重量，超聲處理30 min，冷卻，用70%的乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)0.45μm的微孔濾膜，濾液作為供試品溶液。

2.4方法學(xué)考察

2.4.1穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)取1號(hào)知母藥材粉末，精密稱(chēng)定，按照“2.3”項(xiàng)下的方法，制備供試品溶液，分別于0、2、4、6、8、12、24、36、48 h檢測(cè)指紋圖譜。主要共有峰保留時(shí)間及峰面積比值的RSD值分別為0.05%～0.031%，0.06%～0.013%（PDA色譜圖中的主要共有峰），1.1%～1.8%（ELSD色譜圖中的主要共有峰），表明供試品溶液在48 h內(nèi)穩(wěn)定。同時(shí)發(fā)現(xiàn)50 min后，色譜圖中再?zèng)]有特征峰出現(xiàn)，色譜記錄時(shí)間50 min即可。

2.4.2精密度實(shí)驗(yàn)取“2.2”項(xiàng)下的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，各色譜峰的峰面積比值RSD均小于3%，表明精密度良好，儀器很穩(wěn)定。

2.4.3重復(fù)性實(shí)驗(yàn)取1號(hào)樣品，按照“2.3”項(xiàng)下的供試品溶液制備方法，平行制備6份供試品溶液，按照“2.1”項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣，PDA色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為0.15%～0.39%，ELSD色譜圖中主要共有峰的峰面積比RSD為1.1%～2.8%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.5指紋圖譜的建立根據(jù)11批供試品溶液HPLC/PDA/ELSD指紋圖譜所給出的峰數(shù)、峰值和峰位等相關(guān)參數(shù)，進(jìn)行比較分析，得到圖1-2所示的指紋圖譜共有模式圖。

圖1　11批知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜共有模式圖Fig.1Mutual mode of HPLC-PDA fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

圖2　11批知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜共有模式圖Fig.2Mutual mode of HPLC-ELSD fingerprint of 11 batches Rhizoma Anemarrhenae

2.6指紋圖譜分析與評(píng)價(jià)

2.6.1共有峰的確定根據(jù)11批供試品溶液所得測(cè)試結(jié)果，確定HPLC-PDA指紋圖譜有17個(gè)峰為各批樣品所共有，同法確定了HPLC-ELSD指紋圖譜中的14個(gè)共有峰。見(jiàn)圖3-4。

圖3　知母藥材的HPLC-PDA指紋圖譜Fig.3HPLC-PDA fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

圖4　知母藥材的HPLC-ELSD指紋圖譜Fig.4HPLC-ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

2.6.2參比峰的選擇在各批次樣品的HPLCPDA圖譜中，芒果苷的峰面積較大，較穩(wěn)定，所以選取芒果苷的峰（9號(hào)峰）為HPLC-PDA圖譜的參照峰；同理選取知母皂苷BII的峰（5號(hào)峰）作為HPLC-ELSD圖譜的參照峰。

2.6.3指紋圖譜的相似度評(píng)價(jià)采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)2004A版”對(duì)各批知母藥材的指紋圖譜進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，生成對(duì)照?qǐng)D譜，計(jì)算各樣品圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度，只有10號(hào)樣品的PDA圖譜與對(duì)照?qǐng)D譜的相似度在0.9以下，其他都在0.9以上。見(jiàn)表2。

表2　知母指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)結(jié)果Tab.2Similarity analysis of Rhizoma Anemarrhenae fingerprint

3　討論

3.1檢測(cè)器的選擇知母中的主要化學(xué)成分有甾體皂苷類(lèi)、雙苯吡酮類(lèi)、多糖類(lèi)、木脂素類(lèi)等［16-17］，如果單純使用PDA檢測(cè)器，由于甾體皂苷類(lèi)成分沒(méi)有紫外吸收，所以，此類(lèi)成分的含量將無(wú)法控制，而ELSD檢測(cè)器作為通用型檢測(cè)器，雖然理論上，只要待測(cè)物質(zhì)的沸點(diǎn)高于流動(dòng)相，就可以使用ELSD檢測(cè)器檢出，但由于靈敏度低，所以，單純使用ELSD檢測(cè)器建立的指紋圖譜中，會(huì)缺少一些含量較低的物質(zhì)的信息。本實(shí)驗(yàn)采用HPLC/PDA/ELSD聯(lián)用的方式，建立了知母藥材的多維指紋圖譜，彌補(bǔ)了采用單一檢測(cè)器的局限性，可以更立體的控制知母藥材的質(zhì)量［18-19］。

3.2檢測(cè)波長(zhǎng)的選擇實(shí)驗(yàn)采用3D數(shù)據(jù)采集，記錄了供試品溶液在190～400 nm的全波長(zhǎng)色譜圖，在不同的波長(zhǎng)下提取色譜圖，當(dāng)波長(zhǎng)低于260 nm時(shí)，基線不平，而波長(zhǎng)大于260 nm時(shí)，各主要色譜峰的吸收又會(huì)降低，所以，選取了芒果苷的最大吸收波長(zhǎng)258 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.3流動(dòng)相系統(tǒng)的選擇實(shí)驗(yàn)考察了乙腈-冰醋酸水溶液和乙腈-甲酸水溶液兩個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)，發(fā)現(xiàn)使用乙腈-冰醋酸水溶液，各峰的分離度更好，出峰時(shí)間分布更均勻，因此，最終選用了乙腈-冰醋酸水溶液作為流動(dòng)相。

3.4色譜柱的選擇實(shí)驗(yàn)考察了Waters SunFireTMC18、Waters Symmetry C18、Waters Symmetry ShieldTMRP C18和Dikma Diamonsil C18，結(jié)果表明，使用Waters Symmetry ShieldTMRP C18時(shí)，各峰分布更均勻，分離度更好，所以采用此色譜柱。

郭曉曄等［20］的研究揭示了栽培“西陵知母”中不同化學(xué)成分在一年中的各月份，呈現(xiàn)不同的規(guī)律性變化。實(shí)驗(yàn)使用的藥材均采收于初秋8、9月份，采收于其他季節(jié)的知母藥材，可能會(huì)由于其中某些化學(xué)成分的含量處于不同時(shí)期，而與本實(shí)驗(yàn)建立的對(duì)照指紋圖譜相似度較低。

［1］衛(wèi)智權(quán)，鄧家剛，閻莉，等.芒果苷對(duì)慢性炎癥大鼠外周血單核細(xì)胞髓樣分化因子88表達(dá)的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（4）：482-486.

［2］劉蕓，鄭瑞.知母醇/水提取物對(duì)α-淀粉酶抑制作用研究［J］.陜西中醫(yī)，2013，34（7）：897-898.

［3］衛(wèi)智權(quán)，閻莉，鄧家剛，等.芒果苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的慢性炎癥大鼠MAPK通路及血清細(xì)胞因子的影響［J］.中草藥，2013，44（1）：52-58.

［4］劉卓，隋海娟，閆恩志，等.知母皂苷對(duì)脂多糖誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞炎癥介質(zhì)釋放影響［J］.中國(guó)公共衛(wèi)生，2013，29（3）：384-386.

［5］李學(xué)堅(jiān)，杜正彩，鄧家剛，等.芒果苷?；苌锝笛腔钚缘难芯浚跩］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2013，24（1）：51-53.

［6］馬潔桃，張嶺，來(lái)偉旗，等.芒果苷對(duì)L6細(xì)胞葡萄糖消耗的影響及其作用機(jī)制研究［J］.中國(guó)預(yù)防醫(yī)學(xué)雜志，2012，13（9）：662-666.

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［8］肖復(fù)茜，李洪秀，隋海娟，等.知母皂苷元對(duì)高糖引起的體外培養(yǎng)大鼠海馬神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2013，29（1）：107-112.

［9］盧英，金英，隋海娟，等.知母皂苷元通過(guò)上調(diào)PI3K/Akt信號(hào)通路減輕淀粉β蛋白誘導(dǎo)的乳大鼠海馬神經(jīng)元突觸損傷［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2013，27（4）：635-640.

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（本文編輯：高杉，于春泉）

Study on HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae

WEI Jing-na1，LIU Zheng-hui1，ZHAO Lin-lin1，GUO Yong-ze2，CHENG Yi2，WEN Chun-xiu3
（1．Tianjin High-Standard Quality Testing Lab，Tianjin 300381，China；2.Tianjin Agricultural Quality Standards and Testing Technology Research Institute，Tianjin 300381，China；3.Institute of Cash Crops，Hebei Academy of Agriculture and Forestry Science，Shijiazhuang 050051，China）

［Objective］To establish the HPLC/PDA/ELSD fingerprint of Rhizoma Anemarrhenae.［Methods］This experiment had been done on Waters Symmetry ShieldTMRP C18（5 μm，4.6 mm×250 mm）analytical column of 30℃，with a gradient eluted acetonitrile-0.1% acetic acid mobile phase system of 1.0 mL/min.The detection wavelength had been set at 258 nm，N2pressure was 30 Psi，and the temperature of the drift tube was 80℃.［Results］The mutual modes of the HPLC/PDA/ELSD fingerprint were set up under the established condition.The 17 mutual peaks in the HPLC-PDA fingerprint and 14 mutual peaks in the HPLC-ELSD fingerprint of 11 samples were confirmed.［Conclusion］The method that had been established in this experiment is a good method to totally control the quality of Rhizoma Anemarrhenae.

Rhizoma Anemarrhenae；fingerprint；HPLC/PDA/ELSD

R284.1

A

1672-1519（2015）10-0618-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.10

“十二五”科技部國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目（2011B A107B064）。

魏靜娜（1981-），女，碩士，工程師，研究方向?yàn)樗幤焚|(zhì)量分析。

程奕，E-mail：cychengyi@yahoo.com。

（2015-04-27）