金鑫瑤，朱　征，陳　娜，李　娜，龐曉麗，王一婧，姜希娟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

·實(shí)驗(yàn)研究·

補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞旁分泌MMP-2/9、TIMP-1、TNF-α的影響*

金鑫瑤，朱征，陳娜，李娜，龐曉麗，王一婧，姜希娟

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］探討補(bǔ)陽還五湯對缺氧誘導(dǎo)心臟成纖維細(xì)胞旁分泌基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）及腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的影響，并從基因和蛋白水平探討其保護(hù)心肌細(xì)胞、預(yù)防心肌纖維化的機(jī)制。［方法］培養(yǎng)小鼠乳鼠心臟成纖維細(xì)胞，將其分為對照組、模型組、補(bǔ)陽還五湯組。采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法和酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法分別檢測各組成纖維細(xì)胞和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1及TNF-α mRNA表達(dá)和蛋白分泌。［結(jié)果］與對照組比較，模型組MMP-2、MMP-9及TNF-α mRNA表達(dá)上調(diào)，蛋白旁分泌增加，TIMP-1表達(dá)下調(diào)（P＜0.05）；與模型組比較，補(bǔ)陽還五湯組MMP-2、MMP-9 mRNA表達(dá)下調(diào)，蛋白旁分泌減少，TIMP-1則上調(diào)（P＜0.05），而TNF-α僅有下調(diào)趨勢，無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。［結(jié)論］補(bǔ)陽還五湯可保護(hù)缺氧心肌，預(yù)防心肌纖維化。其機(jī)制可能與抑制缺氧成纖維細(xì)胞的旁分泌，調(diào)節(jié)MMP-2、MMP-9、TIMP-1的表達(dá)平衡有關(guān)。

補(bǔ)陽還五湯；心臟成纖維細(xì)胞；缺氧；MMP-2；MMP-9；TIMP-1；TNF-α

心肌纖維化是心肌長時(shí)間缺血缺氧壞死后的嚴(yán)重并發(fā)癥及結(jié)局，膠原纖維沉積是其病理基礎(chǔ)［1］。研究顯示炎癥因子參與并促進(jìn)心肌纖維化的進(jìn)程，其中基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制因子1（TIMP-1）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在影響心臟成纖維細(xì)胞的增殖及細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）的降解與沉積方面發(fā)揮著不可或缺的作用［2-5］。此外，缺血缺氧亦可增強(qiáng)心臟成纖維細(xì)胞旁分泌相關(guān)細(xì)胞因子（如TNF-α、MMP-2、MMP-9等）的表達(dá)［6-7］。研究表明，補(bǔ)陽還五湯具有抗炎、保護(hù)缺血區(qū)心肌細(xì)胞的作用，然其機(jī)制尚未明確［8-9］。故本研究從心臟成纖維細(xì)胞入手，構(gòu)建缺氧模型，通過觀察補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞旁分泌MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TNF-α的影響，探討其保護(hù)心肌、預(yù)防心肌纖維化的可能機(jī)制。

1　材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物新生3 d以內(nèi)清潔級昆明小鼠。

1.2實(shí)驗(yàn)試劑及器材RT試劑盒（TIANGEN中國，貨號：KR104-02）；SYBR Green試劑盒（TIANGEN中國，貨號：FP205-02）；MMP-2酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒（USCN中國，貨號：SEA100Mu）；MMP-9 ELISA試劑盒（USCN中國，貨號：SEA553Mu）；TNF-α ELISA試劑盒（USCN中國，貨號：SEA133Mu）；TIMP-1 ELISA試劑盒（USCN中國，貨號：SEA552Mu）。恒溫箱（ZD-85國華企業(yè)）；超凈化工作臺（HITACHI）；聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）儀（ABI 7500 Fast美國）；酶標(biāo)儀（PerkinElmer美國）。

1.3實(shí)驗(yàn)分組實(shí)驗(yàn)分為對照組（缺氧0 h組）、模型組（缺氧24 h組）、補(bǔ)陽還五湯組（缺氧24 h+10%等效劑量補(bǔ)陽還五湯含藥血清組）。

1.4模型制作及給藥

1.4.1分離培養(yǎng)心臟成纖維細(xì)胞取20只新生昆明小鼠，75%乙醇消毒后無菌條件下剪開胸腔取出心臟。用D-Hanks液（Gibco美國）清洗去除多余血液，剪去血管及多余結(jié)締組織，并將心臟剪成約1mm3大小的小塊。加入0.8%的胰酶和1%的Ⅱ型膠原酶各1 mL置于37℃恒溫?fù)u床內(nèi)消化，收集消化液，離心后棄上清液。用含10%胎牛血清（FBS）、1%雙抗的全培重懸細(xì)胞，接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.4.2成纖維細(xì)胞的鑒定選用狀態(tài)良好的第2代心臟成纖維細(xì)胞，采用免疫熒光法檢測Vimentin蛋白的表達(dá)。取培養(yǎng)3代的心臟成纖維細(xì)胞，以0.25%的胰蛋白酶消化后離心，全培重懸后將細(xì)胞接種到鋪好無菌玻片（事先用膠包被）的24孔板中。待細(xì)胞長至合適的密度時(shí)取出玻片，多聚甲醛固定。以5%牛血清白蛋白（BSA）封閉30 min，滴加兔抗小鼠Vimentin抗體，4℃過夜。滴加山羊抗兔免疫球蛋白復(fù)合物G（IgG），室溫避光孵育2 h。鏡下觀察，統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)。當(dāng)陽性細(xì)胞數(shù)達(dá)95%以上時(shí)進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。見圖1。

圖1　成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定圖Fig.1CF identity was carried out by immunofluorescence assay detection of vimentin protein expression

1.4.3制作心臟成纖維細(xì)胞缺氧模型取生長狀態(tài)良好的第2代成纖維細(xì)胞，調(diào)整細(xì)胞密度為4.8× 105/mL，接種到6孔板中，每孔2.5 mL。將細(xì)胞培養(yǎng)（37℃、5%CO2培養(yǎng)箱）24 h，然后，置于三氣培養(yǎng)箱中缺氧［5%CO2+94%氮?dú)猓∟2）+1%氧氣（O2）］24 h，進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。見圖2。

圖2　缺氧前后成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察Fig.2Form of fibroblasts under the microscope

1.4.4制備補(bǔ)陽還五湯含藥血清補(bǔ)陽還五湯購于天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院國藥堂。以原方劑量將補(bǔ)陽還五湯制作成藥物浸膏，按人和動(dòng)物間體表面積折算的等效劑量對雄性SD大鼠灌胃1周，第7天灌胃1 h后，乙醚麻醉后無菌條件下腹主動(dòng)脈取血10 mL，室溫靜置2 h，4℃1 250轉(zhuǎn)離心10 min。收集血清并經(jīng)56℃水浴滅活60 min，分裝，-20℃冰箱凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.5藥物干預(yù)實(shí)驗(yàn)分為3組，按照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)補(bǔ)陽還五湯組給予10%補(bǔ)陽還五湯含藥血清干預(yù)。分別取各組的細(xì)胞培養(yǎng)上清液和成纖維細(xì)胞，標(biāo)記后-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5指標(biāo)檢測各組樣本來自上述實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)前將樣本從-80℃冰箱中取出，緩慢平衡至室溫。

1.5.1逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（RT-PCR）法檢測各組成纖維細(xì)胞中MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1 mRNA的表達(dá)情況按試劑盒說明提取樣本心臟成纖維細(xì)胞的總RNA，檢測RNA純度及濃度。以提取的總RNA為模板，根據(jù)試劑盒實(shí)驗(yàn)步驟反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。再以cDNA為模板，行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測MMP-2、MMP-9、TNF-α、TIMP-1 mRNA相對表達(dá)量。引物由上海生物工程股份有限公司合成（具體見表1）。PCR反應(yīng)體系：cDNA 0.75 μL，2× SuperRealpremixplus12.5μL，F(xiàn)orwardPrimer（10μmol/L）0.75 μL，Reverse Primer（10 μmol/L）0.75 μL，50×rox reference dye 0.5 μL，超純水（ddH2O）9.75 μL，總體積25 μL。PCR反應(yīng)條件：95℃15min，預(yù)變性及熱啟動(dòng)→95℃10 s，變性→60℃30 s，退火→72℃充分延伸，40個(gè)循環(huán)，采集熒光。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因GAPDH的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算出各樣品中目的基因的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表1　具體引物序列Tab.1Information of primer

1.5.2ELISA法檢測各組細(xì)胞培養(yǎng)上清液中MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TNF-α的蛋白分泌情況嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行操作。每孔依次加入樣品及標(biāo)準(zhǔn)品50μL，加入檢測溶液A50μL，貼覆膜，37℃孵育1h，棄液洗滌，加入檢測溶液B 100 μL，貼覆膜，37℃孵育30 min，棄液洗滌。加底物溶液90 μL，貼覆膜，37℃避光顯色30 min，加終止溶液50 μL，終止反應(yīng)，此時(shí)藍(lán)色立即轉(zhuǎn)為黃色。在確保酶標(biāo)板底無水滴及孔內(nèi)無氣泡后，用酶標(biāo)儀在450 nm波長下測量各孔的吸光度，每組6個(gè)復(fù)孔，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次，取其平均值。

1.6統(tǒng)計(jì)學(xué)處理使用SPSS 18.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，3組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)及鑒定P1代成纖維細(xì)胞面積增大，更扁平、立體感差。免疫熒光染色結(jié)果表明，對于Vimentin蛋白表達(dá)陽性的成纖維細(xì)胞，其細(xì)胞質(zhì)在熒光顯微鏡下呈現(xiàn)綠色。見圖1。

2.2缺氧前后細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察缺氧0 h，細(xì)胞狀態(tài)良好，細(xì)胞立體感強(qiáng)，胞核明顯；缺氧24 h后觀察發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞核明顯，細(xì)胞內(nèi)顆粒增多，細(xì)胞立體感差，可見大量漂浮細(xì)胞。見圖2。

2.3各組成纖維細(xì)胞中細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)

RT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn)模型組缺氧24 h成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TNF-α mRNA表達(dá)明顯上調(diào)，TIMP-1 mRNA的表達(dá)下調(diào)，與對照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)的心臟成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TNF-αmRNA表達(dá)下調(diào)，與模型組比較MMP-2、MMP-9的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNF-α雖有下調(diào)趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。TIMP-1表達(dá)上調(diào)，與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2　補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TNF-α mRNA表達(dá)的影響Tab.2Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α mRNA in hypoxia induced cardiac fibroblasts

表2　補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TNF-α mRNA表達(dá)的影響Tab.2Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α mRNA in hypoxia induced cardiac fibroblasts

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

2.4各組成纖維細(xì)胞培養(yǎng)上清液中細(xì)胞因子蛋白的旁分泌ELISA法檢測發(fā)現(xiàn)，缺氧24 h后心臟成纖維細(xì)胞旁分泌MMP-2、MMP-9、TNF-α明顯增加，TIMP-1蛋白的分泌下降，與對照組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。給藥后補(bǔ)陽還五湯組與模型組比較細(xì)胞培養(yǎng)液中MMP-2、MMP-9、TNF-α蛋白分泌減少，TIMP-1的蛋白分泌量增加。兩組MMP-2、 MMP-9、TIMP-1的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），TNF-α雖有下降趨勢，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）。見表3。

表3　補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞旁分泌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TNF-α因子的影響Tab.3Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α in hypoxia induced cardiac fibroblasts

表3　補(bǔ)陽還五湯對缺氧心臟成纖維細(xì)胞旁分泌MMP-2、MMP-9、TIMP-1和TNF-α因子的影響Tab.3Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α in hypoxia induced cardiac fibroblasts

注：與對照組比較，*P＜0.05；與模型組比較，#P＜0.05。

組別n對照組模型組補(bǔ)陽還五湯組4 4 4 MMP-2（ng/mL）83.05±15.22 152.00±31.8* 100.40±25.3#MMP-9（ng/mL）92.47±27.38 5 506.04±51.46* 2 272.76±17.37#TNF-α（pg/mL）20.01±0.66 90.50±21.62* 79.23±32.80 TIMP-1（ng/mL）1.21±0.31 0.78±0.13* 0.97±0.11#

3　討論

3.1成纖維細(xì)胞旁分泌功能對于缺血心肌損傷的影響成纖維細(xì)胞作為心肌最重要的間質(zhì)細(xì)胞，占人類心臟細(xì)胞60%～70%，其旁分泌作用對心肌細(xì)胞微環(huán)境的調(diào)控具有重要的影響［10］。當(dāng)局部心肌長時(shí)間缺血缺氧時(shí)，為應(yīng)對刺激，成纖維細(xì)胞改變其增生性和遷移特性，自分泌和旁分泌細(xì)胞因子，調(diào)控心肌細(xì)胞肥大、纖維母細(xì)胞增殖和ECM蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)，促使心肌纖維化的形成［11-12］。研究表明缺氧心臟成纖維細(xì)胞可分泌炎癥因子MMP-2、MMP-9、TIMP-1、TNF-α［6，13］，其中MMP-2、MMP-9、TIMP-1在ECM的重塑中起著重要作用。過度表達(dá)的MMP-2、MMP-9可破壞膠原蛋白ECM網(wǎng)絡(luò)，促進(jìn)成纖維細(xì)胞遷移、增殖、分化、炎癥細(xì)胞的游走及后續(xù)ECM沉積［2］。而TIMPs家族抑制MMPs家族功能，兩者共同維護(hù)ECM穩(wěn)態(tài)。研究顯示，MMP/TIMP的平衡在心室重構(gòu)和心肌纖維化的進(jìn)程中起著重要作用［14］。TIMP-1高表達(dá)可下調(diào)MMP-2、MMP-9 mRNA及蛋白的表達(dá)，同時(shí)抑制其活性［15］。因此，抑制成纖維細(xì)胞的炎癥因子分泌，協(xié)調(diào)MMP/TIMP的平衡，有利于控制和延緩心肌纖維化。

3.2補(bǔ)陽還五湯的作用補(bǔ)陽還五湯由清代醫(yī)家王清任所創(chuàng)，方中重用黃芪，配伍活血化瘀之藥當(dāng)歸尾等起到補(bǔ)氣活血化瘀的作用?，F(xiàn)代的藥理學(xué)研究主要發(fā)現(xiàn)其具有抑制炎性反應(yīng)、抗動(dòng)脈粥樣硬化、保護(hù)心腦血管、抗血栓等作用，但其機(jī)制還不完全清楚［8，16-17］。故本研究以成纖維細(xì)胞為切入點(diǎn)，從炎癥角度入手，構(gòu)建缺氧誘導(dǎo)的成纖維細(xì)胞模型，探討補(bǔ)陽還五湯影響缺氧心臟成纖維細(xì)胞的旁分泌進(jìn)而保護(hù)心肌，預(yù)防心肌纖維化的作用。研究結(jié)果表明模型組細(xì)胞及培養(yǎng)液中MMP-2、MMP-9、TNF-α的表達(dá)明顯上調(diào)，而TIMP-1表達(dá)下調(diào)。說明成纖維細(xì)胞缺氧后發(fā)生表型轉(zhuǎn)變，分泌能力增強(qiáng)，導(dǎo)致MMP/TIMP的表達(dá)不平衡。補(bǔ)陽還五湯干預(yù)后，MMP-2、MMP-9、TNF-α的表達(dá)下調(diào)，而TIMP-1的表達(dá)上調(diào)。尤其是MMP-2、MMP-9、TIMP-1的變化有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，說明補(bǔ)陽還五湯保護(hù)缺氧心肌，預(yù)防心肌纖維化可能與抑制缺氧成纖維細(xì)胞的旁分泌，調(diào)控MMP/TIMP的表達(dá)有關(guān)。

［1］Watson CJ，Collier P，Tea I，et al.Hypoxia-induced epigenetic modifications are associated with cardiac tissue fibrosis and the development of a myofibroblast-like phenotype［J］.Human molecular genetics，2014，23（8）：2176-2188.

［2］Porter KE，Turner NA.Cardiac fibroblasts：at the heart of myocardial remodeling［J］.Pharmacology&therapeutics，2009，123（2）：255-278.

［3］Yabluchanskiy A，Ma Y，Iyer RP，et al.Matrix metalloproteinase-9：many shades of function in cardiovascular disease［J］.Physiology，2013，28（6）：391-403.

［4］Kandalam V，Basu R，Moore L，et al.Lack of tissue inhibitor of metalloproteinases 2 leads to exacerbated left ventricular dysfunction and adverse extracellular matrix remodeling in response to biomechanical stress［J］.Circulation，2011，124（19）：2094-2105.

［5］劉曉蕾，張艷，禮海.益氣活血中藥對心力衰竭大鼠MMP-1、TIMP-1影響的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津中醫(yī)藥，2011，26（6）：503-505.

［6］Spinale FG，Villarreal F.Targeting matrix metalloproteinases in heart disease：Lessons from endogenous inhibitors［J］.Biochemical pharmacology，2014，90（1）：7-15.

［7］Ramirez TA，Jourdan-Le SC，Joy A，et al.Chronic and intermittent hypoxia differentially regulate left ventricular inflammatory and extracellular matrix responses［J］.Hypertension Research，2012，35（8）：811-818.

［8］王晚霞，李榮亨.補(bǔ)陽還五湯作用機(jī)制研究進(jìn)展［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2008，7（5）：574-576.

［9］姜希娟，胡先同，張洪俠，等.補(bǔ)陽還五湯對易損斑塊模型家兔心臟和肝臟組織學(xué)的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2013，28（4）：197-199.

［10］Banerjee I，F(xiàn)useler JW，Price RL，et al.Determination of cell types and numbers during cardiac development in the neonatal and adult rat and mouse［J］.American Journal of Physiology-Heart and Circulatory Physiology，2007，293（3）：H1883-H1891.

［11］CamellitiP，BorgTK，KohlP.Structuralandfunctional characterisation of cardiac fibroblasts［J］.Cardiovascular research，2005，65（1）：40-51.

［12］Gao Y，Chu M，Hong J，et al.Hypoxia induces cardiac fibroblast proliferation and phenotypic switch：a role for caveolae and caveolin-1/PTEN mediated pathway［J］.Journal of thoracic disease，2014，6（10）：1458.

［13］Turner NA，Aley PK，Hall KT，et al.Simvastatin inhibits TNF-α induced invasion of human cardiac myofibroblasts via both MMP-9-dependent and-independent mechanisms［J］.Journal of molecular and cellular cardiology，2007，43（2）：168-176.

［14］Kinoshita T，Ishikawa Y，Arita M，et al.Antifibrotic response of cardiac fibroblasts in hypertensive hearts through enhanced TIMP-1 expression by basic fibroblast growth factor［J］.Cardiovascular Pathology，2014，23（2）：92-100.

［15］Nieuwesteeg MA，Willson JA，Cepeda M，et al.Functional characterization of tissue Inhibitor of metalloproteinase-1（TIMP-1）N-and C-terminal domains during xenopus laevis development［J］. Scientific World Journal，2014（2014）：1-10.

［16］張紅珍.補(bǔ)陽還五湯對動(dòng)脈粥樣硬化大鼠模型血脂的影響［J］.中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志，2012，10（11）：1346-1347.

［17］XingSL，LiZH，SunJH，etal.Antioxidanteffectof Buyanghuanwutang［J］.Chinese Journal of Anatomy，2005，28（5）：529-531.

（本文編輯：馬英，高杉）

Effects of Buyang Huanwu decoction on the expression of MMP-2/9，TIMP-1，TNF-α in hypoxia induced cardiac fibroblasts

JIN Xin-yao，ZHU Zheng，CHEN Na，LI Na，PANG Xiao-li，WANG Yi-jing，JIANG Xi-juan
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the effect of Buyang Huanwu decoction on the paracrine of cardiac fibroblasts MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α in mice with hypoxia and explore the molecular mechanism in protecting myocardial cells.［Methods］Culture cardiac fibroblasts of neonatal mice，divided into three groups：control group，model group，traditional Chinese medicine（TCM）group，copied the anoxic model in condition of 5%CO2+94%N2+1%O2for 24 h.MMP-2，MMP-9，TIMP-1 and TNF-α mRNA and protein expression were detected by RT-PCR and ELISA.［Results］Compared to control group，the mRNA and protein expression of MMP-2，MMP-9 and TNF-α in model group were increased，while the TIMP-1's expression were induced.After Buyang Huanwu decoction intervention，the MMP-2，MMP-9 and TNF-α in TCM group were decreased，and the TIMP-1 was increased（P＜0.05）.While compared to model group TNF-α had no significant difference（P＞0.05）.［Conclusion］Buyang Huanwu decoction can reduce the expression of MMP-2，MMP-9 and increase TIMP-1 in hypoxic cardiac fibroblasts to protect myocardial cells，prevent and relieve the development of myofibrosis.

Buyang Huanwu decoction；cardiac fibroblast；hypoxia；MMP-2；MMP-9；TIMP-1；TNF-α

R541

A

1672-1519（2015）10-0606-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.07

天津中醫(yī)藥大學(xué)創(chuàng)新基金（cxjj2013c04）；大學(xué)生創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)訓(xùn)練計(jì)劃項(xiàng)目（201410063011）。

金鑫瑤（1991-），女，碩士研究生，主要研究方向?yàn)橹嗅t(yī)臨床。

姜希娟，E-mail：xijuanjiang@foxmai.com.cn。

（2015-05-21）