孟笑瑋，樊克濤，代向東，王　怡

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

高尿酸血癥動(dòng)物模型的實(shí)驗(yàn)研究*

孟笑瑋，樊克濤，代向東，王怡

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］制備穩(wěn)定持續(xù)、簡(jiǎn)便易行的高尿酸血癥動(dòng)物模型。［方法］采用單純氧嗪酸鉀、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤、腺嘌呤+乙胺丁醇、單純酵母膏、酵母膏+腺嘌呤、酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀不同藥物與不同濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)模型動(dòng)物血清尿酸值。［結(jié)果］單純氧嗪酸鉀、氧嗪酸鉀+次黃嘌呤模型組尿酸值升高，與空白組比較有差異，但模型不穩(wěn)定，重復(fù)性差，個(gè)體差異較大。腺嘌呤+乙胺丁醇、單純酵母膏、酵母膏+腺嘌呤模型組尿酸值與空白組比較無差異。酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀模型組尿酸值升高，與空白組比較有顯著性差異（P＜0.01），且模型穩(wěn)定，個(gè)體差異小。［結(jié)論］采用酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀復(fù)制高尿酸血癥動(dòng)物模型最佳。

高尿酸血癥；動(dòng)物模型；酵母膏

高尿酸血癥是一種嘌呤代謝紊亂性疾病，由于體內(nèi)尿酸生成增多或排泄減少所致。在中國(guó)的發(fā)病率呈逐年上升趨勢(shì)，是痛風(fēng)發(fā)作的病理基礎(chǔ)，與高血壓、糖尿病、心血管疾病等疾病有著密切關(guān)系［1-7］，因此對(duì)本病的研究越來越引起人們的重視，而制備穩(wěn)定的高尿酸血癥動(dòng)物模型是研究高尿酸血癥發(fā)病機(jī)制和篩選治療高尿酸血癥藥物的重要前提。針對(duì)高尿酸形成的因素，動(dòng)物模型亦是通過增加尿酸生成或（和）抑制尿酸排泄兩種途徑進(jìn)行制備。目前高尿酸血癥造模動(dòng)物主要有嚙齒類和禽類，嚙齒類主要為大鼠和小鼠，禽類主要為雞和鵪鶉，造模方法多種多樣，有相關(guān)文獻(xiàn)［8-10］對(duì)造模方法、造模動(dòng)物、各種造模方法的優(yōu)缺點(diǎn)等進(jìn)行了很好的歸納總結(jié)。筆者參考文獻(xiàn)中的造模方法，進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)，并對(duì)實(shí)驗(yàn)過程中遇到的問題以及經(jīng)驗(yàn)體會(huì)進(jìn)行歸納、分析、總結(jié)，希望對(duì)相關(guān)研究人員有所幫助。

1　單純氧嗪酸鉀造模方法

采用雄性昆明小鼠，連續(xù)7 d每日1次腹腔注射氧嗪酸鉀300 mg/kg，結(jié)果顯示，模型組與正常組血清尿酸值無顯著差異。在原有造模藥物、試劑、檢測(cè)方法及儀器等條件不變的情況下，重復(fù)實(shí)驗(yàn)，模型組血清中尿酸值與正常對(duì)照組比較仍無顯著性差異，模型仍未成功。再次進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、檢測(cè)試劑盒更換不同批次、檢測(cè)儀器由半自動(dòng)生化分析儀換為全自動(dòng)生化分析儀，氧嗪酸鉀為Sigma公司的不同批次，季節(jié)由夏季到秋季，取血時(shí)間嚴(yán)格控制在造模后50～60 min內(nèi)，結(jié)果實(shí)驗(yàn)仍然失敗。

筆者在參考文獻(xiàn)［11-12］采用單純氧嗪酸鉀腹腔注射1次造模方法基礎(chǔ)上，采用小鼠腹腔注射氧嗪酸鉀300 mg/kg僅1次和連續(xù)3 d每日1次分別進(jìn)行造模，結(jié)果顯示，兩個(gè)模型組血清尿酸值均升高，與正常組比較均有顯著性差異，且連續(xù)3 d注射組血清中尿酸值有高于僅注射1次的趨勢(shì)，但無顯著性差異。但再次重復(fù)這兩個(gè)模型發(fā)現(xiàn)，血清尿酸值與正常對(duì)照組比較并無顯著增高。因此推測(cè)該模型存在著不穩(wěn)定性。

楊桂梅［13］等采用氧嗪酸鉀1.0、1.5 g/kg灌胃10 d造模成功，孔令東等［14-15］采用氧嗪酸鉀250 mg/kg灌胃7 d造模成功。據(jù)此，筆者采用氧嗪酸鉀1.0 g/kg灌胃造模7 d，結(jié)果顯示模型組血清尿酸值與正常對(duì)照組比較無顯著差異，未得到與文獻(xiàn)一致的結(jié)果。

筆者體會(huì)，用氧嗪酸鉀300 mg/kg腹腔注射1 d或3 d造模雖可成功，造模方法的優(yōu)點(diǎn)也簡(jiǎn)便易行，死亡率極低。缺點(diǎn)是模型存在著不穩(wěn)定性，動(dòng)物個(gè)體差異較大，血清中尿酸值檢測(cè)存在時(shí)效性，要嚴(yán)格掌握注射藥物后的取血時(shí)間（1 h內(nèi)）及檢測(cè)時(shí)間（30 min內(nèi)）。若采用灌胃造模，則需要掌握好氧嗪酸鉀的劑量和造模周期。

2　氧嗪酸鉀聯(lián)合次黃嘌呤造模方法

采用雄性昆明小鼠，皮下注射氧嗪酸鉀300mg/kg，腹腔注射次黃嘌呤50 mg/kg，每日1次，連續(xù)7 d。結(jié)果顯示模型組與正常組比較，尿酸值升高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。重復(fù)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)失敗，之后用不同尿酸試劑盒（中生北控與南京建成）同時(shí)檢測(cè)，結(jié)果顯示，兩種試劑盒檢測(cè)的血清尿酸值基本一致，模型組尿酸值升高，但與正常組比較仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

筆者體會(huì)，此種模型雖未成功，但與單純腹腔注射氧嗪酸鉀比較，組內(nèi)個(gè)體差異與單純注射藥物組相比減小，可見聯(lián)合用藥較單純用藥有一定優(yōu)勢(shì)。

3　腺嘌呤聯(lián)合乙胺丁醇造模方法

筆者采用健康SD雄性大鼠，腺嘌呤100 mg/kg和乙胺丁醇250 mg/kg聯(lián)合造模，連續(xù)灌胃14 d。經(jīng)兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)分析結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組尿酸值升高，但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表1。

表1　兩組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.1 Changes of serum uric acid in rats between two groups（

表1　兩組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.1 Changes of serum uric acid in rats between two groups（

注：與正常組比較，P＞0.05。

組別動(dòng)物數(shù)尿酸值（μmol/L）正常組10149.440±45.11腺嘌呤+乙胺丁醇9154.301±36.13

4　以酵母膏為主的多種聯(lián)合造模方法

4.1分組健康雄性SD大鼠，分為A組：正常組（灌胃飲用水）。B組：酵母膏30 g/kg組（連續(xù)灌胃7d）。C組：酵母膏30 g/kg+腺嘌呤100 mg/kg組（連續(xù)灌胃7 d）。D組：酵母膏30 g/kg+腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸鉀300 mg/kg組（酵母膏聯(lián)合腺嘌呤灌胃造模7 d，最后1 d腹腔注射氧嗪酸鉀1次）。E組：酵母膏30g/kg+氧嗪酸鉀300mg/kg組（酵母膏灌胃造模14d，最后1 d腹腔注射氧嗪酸鉀1次）。酵母膏（北京索萊寶生物科技有限公司），腺嘌呤（Sigma公司），氧嗪酸鉀（Sigma公司），乙胺丁醇（沈陽紅旗制藥有限公司），尿酸試劑盒（南京建成生物工程研究所）。各組均在造模結(jié)束后50～60 min內(nèi)眥取血60 min內(nèi)檢測(cè)血清尿酸值。

4.2結(jié)果分析造模7d，經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，B、C、D組與A組比較，大鼠血尿酸值均有升高的趨勢(shì)，但只有D組與A組比較差異有顯著性（P＜0.01）。結(jié)果見表2。

造模14 d，B組較7 d造模時(shí)尿酸值升高，但與A組比較仍無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。E組尿酸值亦升高，且與A組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05）。結(jié)果見表3。

不同造模方法致大鼠死亡情況，結(jié)果見表4。筆者于實(shí)驗(yàn)過程中對(duì)死亡大鼠進(jìn)行解剖，死亡原因有兩種：造模藥物灌胃體積太大，大鼠胃中脹滿，無法進(jìn)行正常的消化吸收死亡。大鼠胃腸正常，但有胸腔積液，食管破裂死亡（灌胃導(dǎo)致），由于造模藥物體積大，所以每日分兩次灌胃，對(duì)大鼠食管易造成損傷。

表2　4組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.2Changes of serum uric acid in rats among 4 groups

表2　4組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.2Changes of serum uric acid in rats among 4 groups

注：與A組比較，*P＜0.01。

組別動(dòng)物數(shù)尿酸值（μmol/L）A組10125.880±40.98 B組10147.438±39.00 C組9158.024±35.10 D組9286.042±81.67*

表3　3組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.3Changes of serum uric in rats acid among 3 groups

表3　3組大鼠血尿酸值的變化情況Tab.3Changes of serum uric in rats acid among 3 groups

注：與A組比較，*P＜0.05。

組別動(dòng)物數(shù)尿酸值（μmol/L）A組10149.440±45.11 B組10179.624±50.02 E組9213.063±71.07*

表4　不同造模方法大鼠死亡情況統(tǒng)計(jì)Tab.4Mortality of rats in different animal models

筆者所復(fù)制的幾種模型中，酵母膏+腺嘌呤+氧嗪酸鉀組和酵母膏+氧嗪酸鉀組造模是成功的。前者的優(yōu)點(diǎn)是：可形成穩(wěn)定的高尿酸血癥模型，且可重復(fù)性好（筆者后來又進(jìn)行了重復(fù)實(shí)驗(yàn)），造模時(shí)間短。缺點(diǎn)是由于酵母膏灌胃體積較大，故死亡率較高。后者模型雖然成功，但較前者而言，造模時(shí)間較長(zhǎng)，這對(duì)于酵母膏造模本身灌胃體積較大、死亡率高的問題，不占優(yōu)勢(shì)。所以筆者在后續(xù)的研究中再次選擇前者造模方法并將其中酵母膏劑量降至15 g/kg后觀察血清中尿酸值的變化。

5　酵母膏、腺嘌呤聯(lián)和氧嗪酸鉀造模方法

有了以上的研究基礎(chǔ)，亦參考了其他學(xué)者［13，16］對(duì)酵母膏造模的量效研究，筆者為了進(jìn)一步穩(wěn)定模型，并且降低動(dòng)物死亡率，故將酵母膏劑量分別降低至20 g/kg（F組）和15 g/kg（G組），同時(shí)聯(lián)合腺嘌呤100 mg/kg、氧嗪酸鉀300 mg/kg造模，造模方法如前。經(jīng)單因素方差分析結(jié)果顯示，兩個(gè)模型組血清尿酸值明顯升高，與正常組比較差異有顯著性（P＜0.01），并且模型組死亡率均顯著下降。見表5。

表5　3組大鼠血尿酸的變化和死亡率Tab.5Changes of serum uric acid and mortality of rats among 3 groups

6　討論

高尿酸血癥的發(fā)生，主要由于尿酸生成增多或（和）排泄較少所致，所以復(fù)制動(dòng)物模型，應(yīng)該主要從這兩個(gè)途徑入手。筆者通過復(fù)制多種模型，體會(huì)如下。

氧嗪酸鉀是尿酸酶抑制劑，單純腹腔注射氧嗪酸鉀復(fù)制模型，使體內(nèi)尿酸含量急劇增加，此模型靈敏簡(jiǎn)便，這與文獻(xiàn)［11-12］報(bào)道一致，但筆者所做實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)此模型存在著不穩(wěn)定性，受試動(dòng)物個(gè)體間差異較大，不易控制。但此法對(duì)于復(fù)制急性高尿酸血癥模型較為適用。

氧嗪酸鉀和乙胺丁醇均可抑制尿酸的排泄，使體內(nèi)血尿酸濃度增高。次黃嘌呤和腺嘌呤均為尿酸的前體物質(zhì)，其分解后亦可使尿酸濃度增高。氧嗪酸鉀+次黃嘌呤、腺嘌呤+乙胺丁醇兩組均采用聯(lián)合用藥，既增加了尿酸的生成，又抑制了尿酸的排泄，兩條路徑同時(shí)入手，理論上模型應(yīng)該成功，且有相關(guān)模型成功的報(bào)道［17-18］。但筆者實(shí)驗(yàn)失敗，分析模型失敗的兩個(gè)原因可能與造模藥物劑量和周期有關(guān)，實(shí)驗(yàn)所用大鼠和小鼠體內(nèi)均含有尿酸酶，可自動(dòng)分解尿酸，生成尿囊素排除體外。如果造模藥物劑量不當(dāng)或（和）周期太長(zhǎng)，可能會(huì)造成受試動(dòng)物對(duì)藥物的耐受性，故實(shí)驗(yàn)失敗。

酵母膏亦為尿酸的前體物質(zhì)，酵母膏聯(lián)合腺嘌呤和氧嗪酸鉀造模，也是從兩條途徑同時(shí)入手，而且使用兩種前體物質(zhì)，從而保證了模型成功的幾率。且酵母膏采用灌胃而非飼喂，就避免了模型動(dòng)物間由于攝入造模藥物劑量不同而導(dǎo)致的差異。經(jīng)過筆者實(shí)驗(yàn)，此造模方法可形成穩(wěn)定的高尿酸血癥模型，且造模時(shí)間短，可重復(fù)性好。但模型持續(xù)性不好，筆者對(duì)酵母膏（20 g/kg、15 g/kg）+腺嘌呤+氧嗪酸鉀組停止造模5 d，檢測(cè)其血清尿酸，與正常組已無差異。由于酵母膏灌胃體積較大，所以死亡率較高，故筆者將酵母膏劑量由30 g/kg降低至20 g/kg和15 g/kg，死亡率也隨之降低，但尿酸值并無差異。值得注意的是，酵母膏按30、20、15 g/kg劑量造模，須每日分兩次灌胃，且兩次中間間隔時(shí)間越長(zhǎng)（＞6 h）死亡率越低。綜上所述，采用酵母膏15～20 g/kg+腺嘌呤100 mg/kg+氧嗪酸鉀300 mg/kg復(fù)制急性高尿酸血癥動(dòng)物模型為佳。

中醫(yī)文獻(xiàn)中并沒有“高尿酸血癥”一詞的明確記載，有學(xué)者［19］認(rèn)為其屬于“濕毒”范疇，而從臨床轉(zhuǎn)歸來看，其屬于“熱痹”、“痛風(fēng)”、“歷節(jié)”等范疇。還有學(xué)者［20］認(rèn)為把高尿酸血癥命名為“濁瘀病”比較恰當(dāng)，既明確了中醫(yī)病因病機(jī)，又與“痛風(fēng)”、“痹證”相區(qū)別。中醫(yī)認(rèn)為，脾腎虧虛，濕、痰、瘀侵襲人體，閉阻經(jīng)脈，氣血壅滯是高尿酸血癥的主要病因病機(jī)，故治療此病多以清熱祛濕、泄?jié)峄鰹橹?，常用單味中藥有萆薢、黃柏、土茯苓、牛膝等。中藥復(fù)方有二妙丸、加味四妙湯、當(dāng)歸拈痛湯等，能有效降低體內(nèi)尿酸含量，緩解痛風(fēng)癥狀，效果顯著［21-23］。西醫(yī)治療高尿酸血癥有一定的局限，僅能控制體內(nèi)尿酸濃度，不能根除本病，用藥以非甾體類抗炎藥、秋水仙堿、激素類藥物、促尿酸排泄藥為主，毒副作用大，易對(duì)人體造成一定的危害。西醫(yī)西藥的這些不足，為中醫(yī)藥治療高尿酸血癥的發(fā)展提供了更廣闊的空間，而尋找并復(fù)制一種或幾種穩(wěn)定、持續(xù)、科學(xué)、安全并與人類病理生理相近的動(dòng)物模型，是進(jìn)行研究工作的重要前提，以上模型的成功建立，對(duì)于研究中醫(yī)藥治療高尿酸血癥具有重要意義。

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（本文編輯：馬英，高杉）

Experimental research of hyperuricemia animal models

MENG Xiao-wei，F(xiàn)AN Ke-tao，DAI Xiang-dong，WANG Yi
（Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］Preparation of stable and sustainable，simple animal model of hyperuricemia.［Methods］Using a simple oteracil potassium，oteracil potassium+hypoxanthine，adenine+ethambutol，pure yeast extract，yeast extract+adenine，adenine+yeast extract +oteracil potassium different drugs and different concentrations to experiment and detecting model animal serum uric acid levels.［Results］Simple oteracil potassium，potassium oxonate+hypoxanthine，model group increased uric acid levels，there were differences compared with the control group，but the larger model is unstable，poor reproducibility，individual differences.Adenine+ethambutol，pure yeast extract and yeast extract+adenine，there was no difference between the model group and control group uric acid levels.Yeast extract+adenine+oteracil potassium increased uric acid levels in the model group，the control group there was a significant difference（P＜0.01），and the model was stable，small individual differences.［Conclusion］Using yeast extract+adenine+oteracil potassium can copy best hyperuricemic model.

hyperuricemia；animal model；yeast extract

R589.7

A

1672-1519（2015）10-0614-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.10.09

教育部創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)發(fā)展計(jì)劃（IRT1276）；“重大新藥創(chuàng)制”資助項(xiàng)目（2012ZX09304007）。

孟笑瑋（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹嗅t(yī)藥防治心血管疾病的藥理研究。

王怡，E-mail：vip_wangyi@126.com。

（2015-05-13）