姜紅濤 姚秀林

[摘要] 目的 比較實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細胞培養(yǎng)法檢測流行性感冒病毒的差異。方法 采用實時熒光定量RT-PCR及經(jīng)典的狗腎傳代細胞病毒分離2種方法，同時對流感監(jiān)測點送檢的80份疑似流感標(biāo)本檢測流感病毒。 結(jié)果 細胞培養(yǎng)病毒分離的陽性數(shù)為26份，實時熒光定量RT-PCR的陽性數(shù)為36份，χ2=8.1， P<0.005。 結(jié)論 通過該實驗，驗證了實時熒光定量RT-PCR的確快速敏感，適用于實驗室快速診斷。

[關(guān)鍵詞] 實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)；細胞培養(yǎng)法；流感病毒

[中圖分類號] R4 [文獻標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）03（b）-0192-02

2013年出現(xiàn)的流感病毒H7N9經(jīng)自然重配，致病迅速，易變異，給人們帶來極度恐慌，引起WHO 的高度重視[1]，從而使流感病毒病原學(xué)的準(zhǔn)確快速診斷顯得尤為重要。該實驗室在2014年1月采用整群抽樣法對撫順市流感監(jiān)測哨點醫(yī)院的80份疑似流感樣標(biāo)本進行了實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）法與細胞培養(yǎng)法進行了檢測流行性感冒病毒的方法比較，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2014年1月在撫順市國家級流感監(jiān)測哨點醫(yī)院，每周采集內(nèi)科和兒科門診就診的流感樣病例（體溫≥38℃，同時伴有咳嗽或者咽喉疼痛等癥狀的急性呼吸道感染者）的咽拭子標(biāo)本，放人pH 7.4-7.6的DMEM采樣液中，當(dāng)日低溫送流感實驗室檢測，每周采集 20份流感樣病例的咽拭子標(biāo)本。

1.2 主要試劑

①抗A（H1N1）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（H3N2）亞型血清，抗A（SWL1）亞型血清，抗B型Yamagata系病毒血清，抗B型Victoria系病毒血清由國家流感中心提供。MDCK細胞，遼寧省疾控中心提供；胰酶、Hank液、胎牛血清﹑牛血清白蛋白組分V， 采購于BI公司。DMEM培養(yǎng)基，采購于GIBCO公司。

②提取RNA試劑盒為QIAGEN。

1.3 主要儀器

AB PCR儀；二氧化碳培養(yǎng)箱 ；倒置顯微鏡等。

1.4 實驗方法

1.4.1 采用細胞培養(yǎng)法分離流感病毒，細胞為狗腎傳代細胞（MDCK） 每份標(biāo)本接種細胞瓶2瓶，置34.5℃吸附1 h，倒掉感染液，再用Hanks液洗2遍，加入病毒維持液，置34.5 ℃培養(yǎng)，每天觀察病理變化（CPU），當(dāng)CPU出現(xiàn)3～4個加號時，按常規(guī)法檢查維持液中的紅細胞凝集活性。將HA≥1：16的標(biāo)本采用血凝抑制方法（HI）進行流感病毒型別鑒定[2]。確定病毒的型別和亞型。并送國家流感中心做進一步鑒定。HA≤1：16的標(biāo)本未做分型鑒定。

1.4.2 RT-PCR反應(yīng)體系的配置[3-4] 反應(yīng)條件：60℃ 5min→ 50℃ 30min→ 95℃ 15min→95℃ 15s，55℃退火30 s（收集熒光），72℃延伸 30s 45 cycle→ 72℃ 5min→4℃ 保存。見表1。

1.5 統(tǒng)計方法

配對設(shè)計的χ2檢驗，公式：χ2=（|b-c|-1）2/b+c v=1，P<0.005差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的結(jié)果

細胞培養(yǎng)分離病毒26株，陽性百分率32.50%，RT-PCR檢出36株，陽性百分率45.00%，見表2。

2.2 兩種檢驗方法統(tǒng)計結(jié)果比較

細胞培養(yǎng)分離病毒36株，陽性26株，RT-PCR檢出36株，兩種檢驗方法統(tǒng)計結(jié)果為χ2=8.1，因為χ20.005，1=7.88，所以P<0.005，兩種檢驗方法敏感性差異有統(tǒng)計學(xué)意義。見表3。

2.3 兩種方法對80份咽拭液檢測流行性感冒病毒的分型結(jié)果

細胞培養(yǎng)分離病毒H1N1（22份），H3N2（4份），熒光定量RT-PCR分離病毒H1N1（31份），H3N2（4份），By（1份）。

3 討論

流感病毒病原學(xué)相關(guān)檢測目前常用的有病毒分離培養(yǎng)法、快速檢測、分子生物學(xué)方法等。病毒分離是診斷流感病毒的金標(biāo)準(zhǔn)[5]，但耗時長是其缺點。而且宿主細胞生長狀態(tài)也是影響病毒生長及復(fù)制的關(guān)鍵因素[6]，導(dǎo)致疑似流感樣標(biāo)本到實驗室后，培養(yǎng)完成時間不確定。同時培養(yǎng)液中營養(yǎng)物質(zhì)的持續(xù)消耗以及宿主細胞的逐漸死亡是導(dǎo)致病毒滴度降低的直接原因[7]，收獲的病毒滴度高低存在著很多的不確定因素。而且，標(biāo)本采集后的保存運送等環(huán)節(jié)都對MDCK培養(yǎng)分離流感病毒存在較大的影響。而實時熒光定量RT-PCR法應(yīng)用于流感病毒實驗室診斷，國內(nèi)外早已有許多報導(dǎo)[8]，它具有靈敏度高、特異性好、檢測所需時間短等等優(yōu)點，尤其在應(yīng)急疫情快速診斷中得到了廣泛的應(yīng)用。它與經(jīng)典的MDCK細胞分離法相比，檢測時間可縮短到1 d之內(nèi)。由于在封閉管中進行，省略了電泳這一步驟，減少了以往PCR技術(shù)導(dǎo)致的假陽性可能[8]。

該實驗室對2014年1月流感監(jiān)測點送檢的80份標(biāo)本，采用細胞培養(yǎng)、實時熒光定量RT-PCR 兩種方法檢測，同時進行比較， 結(jié)果證實，實時熒光定量RT-PCR法對流行性感冒病毒的檢出率為45.00%，高于細胞培養(yǎng)法的病毒檢出率32.50%。實時熒光定量RT-PCR法和細胞培養(yǎng)法兩種檢驗方法χ2檢驗結(jié)果為χ2=8.1，P<0.005。對流感病毒的檢出敏感性差異顯著，對流感病毒的分型也是準(zhǔn)確無誤，在病毒含量較低的標(biāo)本中不存在漏檢情況發(fā)生。通過這兩種方法的比較，與浙江省疾病預(yù)防控制中心通過比較得出的，實時熒光定量RT-PCR法對大量疑似標(biāo)本進行實驗室快速鑒別診斷，實用性強，快速敏感[9]的結(jié)論一致。驗證了實時熒光定量RT-PCR法確實是實驗室快速診斷流行性感冒病毒的首選方法，用實時熒光定量RT-PCR法檢測為流感病毒陽性的標(biāo)本接種MDCK細胞，培養(yǎng)分離流感病毒，可以降低細胞培養(yǎng)法分離流感病毒的成本，減少不必要的試劑材料的消耗，提高檢測效率。這僅僅是本實驗室的驗證結(jié)論，還需要其它研究中心加以驗證。

[參考文獻]

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（收稿日期：2014-12-16）