底瑋++沈方臻

[摘要] 目的 研究DC-CIK細(xì)胞和不同濃度順鉑對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制作用。 方法 將DC細(xì)胞和CIK細(xì)胞共同培養(yǎng)得到的DC-CIK細(xì)胞與順鉑分別作用于MCF-7細(xì)胞，共同培養(yǎng)12h、24 h和48 h，MTT法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制情況，對(duì)比DC-CIK細(xì)胞和順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效果。 結(jié)果 與DC-CIK細(xì)胞共培養(yǎng)12 h、24 h與48 h，MCF-7細(xì)胞均出現(xiàn)一定的凋亡，增殖受到明顯的抑制；與5×106個(gè)DC-CIK細(xì)胞共培養(yǎng)12h與40 ng/mL順鉑對(duì)其作用12 h的抑制效果相同，共培養(yǎng)24 h與50 ng/mL順鉑對(duì)其作用24 h的效果相同，共培養(yǎng)48 h與60 ng/mL順鉑對(duì)其作用24 h的效果相同。結(jié)論該研究為DC-CIK法治療乳腺癌作出了實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)性研究，為臨床DC-CIK細(xì)胞抑制乳腺癌細(xì)胞提供了理論依據(jù)。

[關(guān)鍵詞] 樹(shù)突狀細(xì)胞；細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞；DC-CIK細(xì)胞；乳腺癌；免疫治療

[中圖分類號(hào)] R73 [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] A [文章編號(hào)] 1674-0742（2015）03（b）-0124-03

樹(shù)突狀細(xì)胞（Dendritic cells，DC）是機(jī)體內(nèi)重要的抗原提呈細(xì)胞，可激發(fā) B 和 T 淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)[1]。細(xì)胞因子誘導(dǎo)殺傷細(xì)胞（cytokine- induced killer cell，CIK）是將人外周血單個(gè)核細(xì)胞在體外與多種細(xì)胞因子及抗體共同培養(yǎng)一段時(shí)間后獲得的一群異質(zhì)細(xì)胞，對(duì)腫瘤細(xì)胞具有高效的溶解毒性[2]。DC能識(shí)別處理腫瘤細(xì)胞，并把腫瘤細(xì)胞的相關(guān)信號(hào)傳遞給CIK細(xì)胞，使之發(fā)揮殺傷腫瘤細(xì)胞的功能。因此，DC能顯著提高CIK細(xì)胞針對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷活性[3]。[A1]本次實(shí)驗(yàn)的起止時(shí)間為2012年10月—2013年7月，實(shí)驗(yàn)從正常人外周血中分離DC和CIK，來(lái)誘導(dǎo)培養(yǎng)DC、CIK 產(chǎn)生DC-CIK細(xì)胞，然后通過(guò)對(duì)比DC-CIK細(xì)胞和化療藥物順鉑對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖抑制效果，來(lái)探索一種更為有效的免疫治療方法，為臨床研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑

DMEM（Eagle medium and modified Eagle medium）（Gibco Invitrogen公司）；Fetal bovine serum（Gibco Invitrogen公司）；penicillin and streptomycin（Gibco Invitrogen公司）； trypsin 0.25% with EDTA（Gibco Invitrogen公司）；7.5% BSA（Gibco Invitrogen公司）；IL-2、IFN-γ、GM-CSF、TNF-α及 CD3單抗（Cytolab公司）。

1.2 方法

1.2.1 CIK細(xì)胞的誘導(dǎo)和擴(kuò)增 取健康成年人外周全血30 mL，用等量Ficol1分離出PBMC。調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/mL，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h。收集非貼壁細(xì)胞，用含10%人AB血清的IMDM調(diào)細(xì)胞濃度為1×106/ml，并加人1000 U/mL的IFN-γ懸浮培養(yǎng)，24h后加入50ng/mL的CD3單克隆抗體和300 U/ml的重組人IL-2，每隔3 d半量換液1次，補(bǔ)充rhIL-2，調(diào)整細(xì)胞濃度始終為1×106/mL。在培養(yǎng)的第7 d，收獲CIK細(xì)胞。然后加入新鮮DMEM完全培養(yǎng)基，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2.2 DC的體外培養(yǎng) 在PBMC培養(yǎng)2 h之后的貼壁細(xì)胞中，加入含1000 U/mL的GM-CSF和1000U/mL的IL-4的GT-T551無(wú)血清培養(yǎng)液，37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。每3 d換液1次并補(bǔ)充細(xì)胞因子，誘導(dǎo)單核細(xì)胞向DC細(xì)胞分化，在培養(yǎng)的第7 d，加入500U/mL重組人TNF-a，誘導(dǎo)DC細(xì)胞成熟；共培養(yǎng)到第9 d。收獲DC細(xì)胞。

1.2.3 DC與CIK細(xì)胞共培養(yǎng) 將DE與CIK細(xì)胞混合，比例為DC：CIK=1：5，培養(yǎng)液為CIK培養(yǎng)液。無(wú)血清培養(yǎng)液中添加重組人IL-2 （300 U/mL）。

1.2.4 細(xì)胞傳代培養(yǎng) 采用凍融法。消化收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MCF-7細(xì)胞，用PBS液離心洗滌2遍，再用PBS液重懸為1×107/mL，封裝入凍存管。

1.2.5 DC-CIK作用于MCF-7 將MCF-7細(xì)胞稀釋為5×105個(gè)細(xì)胞/mL的濃度，每孔100 μL加入96孔板培養(yǎng)24 h。將培養(yǎng)好的DC-CIK細(xì)胞，稀釋為5×106 /mL及10×106 /mL的濃度，每孔100 μL加入到已經(jīng)培養(yǎng)24 hMCF-7細(xì)胞的96孔板中，置于37℃ CO2培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)。每個(gè)組共設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。在共培養(yǎng)時(shí)間上分為12、24和48h3個(gè)組別。每個(gè)96孔板上均設(shè)置空白對(duì)照組，對(duì)照組不干預(yù)。

1.2.6 順鉑作用于MCF-7 將順鉑加入到已經(jīng)培養(yǎng)24 hMCF-7細(xì)胞的96孔板中，使順鉑在96孔培養(yǎng)板中的終濃度依次為10 ng/mL、20 ng/mL、30 ng/mL、40 ng/mL、50 ng/mL、60 ng/mL、70 ng/mL、80ng/mL、90 ng/mL、100ng/mL。然后加入培養(yǎng)基補(bǔ)足夠200 μL。置于37℃ CO2培養(yǎng)箱共同培養(yǎng)。每個(gè)組共設(shè)5個(gè)重復(fù)孔。在共培養(yǎng)時(shí)間上分為12、24和48h3個(gè)組別。每個(gè)96孔培養(yǎng)板上均設(shè)置空白對(duì)照組。

1.2.7 MTT檢測(cè)MCF-7的增殖 在轉(zhuǎn)染12、24、48 h后采用MTT法檢測(cè)MCF-7細(xì)胞的凋亡情況。將各組細(xì)胞制成濃度為2000 個(gè)/ml 的細(xì)胞懸液，然后將200 μL/孔的細(xì)胞懸液接種到96 孔板中繼續(xù)培養(yǎng)，在12 h后每孔加入20 μLMTT（5 mg/mL），再在37℃條件下培養(yǎng)4 h；棄去上清液，每孔加入DMSO為150μl，37℃條件下振蕩15 min，使用酶標(biāo)儀490 nm波長(zhǎng)測(cè)定A 值。并記算各組的殺傷率。殺傷率=[1-（實(shí)驗(yàn)孔A值-效應(yīng)細(xì)胞對(duì)照孔A值）/靶細(xì)胞對(duì)照孔A值]×100%。endprint

1.3 統(tǒng)計(jì)方法

采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以（x±s）表示，組間比較采用t檢驗(yàn)，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 DC-CIK作用于MCF-7后MCF-7的增殖情況

在顯微鏡下觀察MCF-7細(xì)胞增殖情況。在加入DC-CIK后，MCF-7細(xì)胞出現(xiàn)了部分凋亡現(xiàn)象，對(duì)照組MCF-7細(xì)胞呈現(xiàn)正常生長(zhǎng)狀態(tài)。

在使用MTT法檢測(cè)DC-CIK作用于MCF-7后12、24、48h細(xì)胞增殖情況顯示，加入5×106 /mLDC-CIK細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞的凋亡率分別為18.3%、26.0%、35.6%，加入10×106 /mLDC-CIK細(xì)胞后，MCF-7細(xì)胞的凋亡率分別為25.8%、42.3%、58.6%，對(duì)照組為3.5%，殺傷作用與作用時(shí)間及效靶比均呈正相關(guān)，L<0.05。

2.2 化療藥物順鉑作用于MCF-7后的增殖情況

化療藥物順鉑作用與MCF-7細(xì)胞后顯示出對(duì)增殖的明顯抑制作用，而且隨著作用時(shí)間及順鉑濃度的增加，抑制的效果也越明顯。L值均<0.01。

2.3 DC-CIK 和順鉑對(duì)MCF-7增殖抑制作用的比較

將DC-CIK 和順鉑對(duì)MCF-7增殖抑制作用的進(jìn)行比較，結(jié)果顯示，5×106個(gè)細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖12 h的抑制作用與40 ng/ml濃度的順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖12 h的抑制作用相等同，而作用24 h的抑制作用與50 ng/mL順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖24 h的抑制作用相等同，作用48 h的的抑制作用與60 ng/mL順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞增殖24 h的抑制作用基本相等同。

3 討論

DC-CIK 細(xì)胞具有很多優(yōu)點(diǎn)，對(duì)原發(fā)性、轉(zhuǎn)移性腫瘤均有良好的療效，并且對(duì)多重耐藥、放化療無(wú)效的腫瘤細(xì)胞也有效；可以明顯的預(yù)防腫瘤的復(fù)發(fā)；能夠顯著地提高機(jī)體免疫力，激發(fā)全身性的抗癌效應(yīng)[4-5]。目前DC-CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌細(xì)胞作用的研究還處在起步階段，劉苗等[6]研究發(fā)現(xiàn)，DC-CIK細(xì)胞在體外可以大量增殖，溶瘤作用強(qiáng)。另有研究表明，CIK細(xì)胞的溶瘤率為15%，而DC-CIK細(xì)胞溶瘤率可以達(dá)到71%，且能誘導(dǎo)機(jī)體分泌高水平的IFN-γ，可調(diào)節(jié)和增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能，提高間接殺瘤作用[7-8]。該研究著眼于實(shí)驗(yàn)室基礎(chǔ)性研究，通過(guò)DC-CIK細(xì)胞對(duì)乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖的體外作用實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)DC-CIK細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞增值存在很好的抑制作用，殺傷癌細(xì)胞作用與作用時(shí)間及效靶比均呈正相關(guān)；在某一濃度與作用時(shí)間上，DC-CIK細(xì)胞與順鉑對(duì)MCF-7細(xì)胞的抑制有相同作用，DC-CIK細(xì)胞對(duì)MCF-7細(xì)胞具有與順鉑類似的增殖抑制作用，并且，該研究結(jié)果提示DC-CIK法可以取得化療藥物相同的對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖抑制作用，且無(wú)化療藥物的副作用，為進(jìn)一步臨床實(shí)驗(yàn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)，在臨床治療乳腺癌方面具有很高的應(yīng)用價(jià)值。

目前，DC- CIK 細(xì)胞在成人腫瘤的臨床治療已經(jīng)開(kāi)展，但開(kāi)展時(shí)間較短，數(shù)據(jù)也不豐富，需繼續(xù)擴(kuò)大 DC -CIK 細(xì)胞治療的臨床應(yīng)用范圍，以獲取更多的臨床資料。另外，DC- CIK 細(xì)胞與天然藥物、其它藥物，甚至疫苗結(jié)合殺傷腫瘤細(xì)胞也是一個(gè)很好的研究方向。曲佳等[9]將冬凌草甲素與DC- CIK 細(xì)胞結(jié)合殺傷人多發(fā)性骨髓瘤RPMI 8266細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素能明顯提高DC- CIK 細(xì)胞的殺瘤活性。李雄兵等[10]將卡介苗與DC- CIK 細(xì)胞聯(lián)合應(yīng)用于裸鼠結(jié)腸癌肝轉(zhuǎn)移的抑制作用，取得了良好的效果，也為DC- CIK 細(xì)胞的臨床應(yīng)用提供了寶貴的經(jīng)驗(yàn)。

綜上所述，隨著醫(yī)學(xué)生物科技的迅猛發(fā)展，細(xì)胞免疫治療逐漸成為一種嶄新的治療模式，尤其是DC-CIK 細(xì)胞，目前已經(jīng)小規(guī)模應(yīng)用于臨床治療惡性腫瘤，并取得了很好的治療效果。在目前的癌癥多學(xué)科綜合治療理念下，為使乳腺癌患者獲得最佳的治療效果，在接受手術(shù)、放化療等標(biāo)準(zhǔn)治療后，細(xì)胞免疫治療不失為一種比較可取的輔助治療手段，而DC-CIK 細(xì)胞將成為首選方案。該療法可單獨(dú)用于治療，也適宜作為手術(shù)或放化療后的輔助療法，以提高療效和改善生存質(zhì)量。因此，該法已成為腫瘤治療的手段之一，為預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)、消除患者體內(nèi)殘留的腫瘤細(xì)胞、改善晚期腫瘤患者的生存質(zhì)量提供了新的治療途徑。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 尤渺寧，任軍，邱立軍，等.樹(shù)突狀細(xì)胞體腔回輸治療惡性體腔積液的療效觀察及護(hù)理[J].護(hù)士進(jìn)修雜志， 2013， 28（1）： 87- 88.

[2] 于卉影，孫英慧，藺迪，等.腫瘤患者自體CIK細(xì)胞輸注增強(qiáng)再次制備時(shí)CD3+CD56+細(xì)胞的體外擴(kuò)增能力[J].細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志， 2014， 30（7）：748-753.

[3] 王睿斌， 郝筱詩(shī)，齊保聚，等.晚期直腸癌患者DC-CIK 免疫干預(yù)前后D二聚體改變的臨床研究[J].2014， 18（2）： 247- 250.

[4] 匡幼林，鄧遠(yuǎn)忠，梁思敏，等樹(shù)突狀細(xì)胞與細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞抗前列腺癌細(xì)胞的免疫效應(yīng)[J].重慶醫(yī)學(xué)， 2014，43，（17）： 2167- 2169.

[5] 龔奕， 陳幸華， 張曦， 等. DC-CIK細(xì)胞輸注治療急性髓細(xì)胞白血病50例分析[J]. 重慶醫(yī)學(xué)， 2011， 40（30）： 3039- 3041.

[6] 劉苗， 金潤(rùn)銘， 姜毅. 樹(shù)突細(xì)胞聯(lián)合細(xì)胞因子誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞生物學(xué)特性和體外殺瘤機(jī)制[J]. 實(shí)用兒科臨床雜志， 2011， 26（1）： 35- 38.

[7] Wang Q J， Wang H， Pan K et al. Comparative study on anti- tumor immune response of autologous cytokine induced killer （CIK） cells， dendritic cells- CIK （DC-CIK） and semi- allogeneic DC- CIK[J].Cancer，2010；29 （7）： 641- 647.

[8] Linn YG， Hui KM. Cytokine- induced killers： NK- like T cells with cytotolytic specificity against leukia [J]. Leuk Lymphoma，2003（44）： 1457- 1462.

[9] 曲佳，詹星，馮可欣，等.冬凌草甲素聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞殺傷RPMI 8266 細(xì)胞的研究[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志， 2014， 30（14）： 2208- 2210.

[10] 李雄兵， 劉漢鋒， 蔡正文， 等. 卡介苗聯(lián)合DC-CIK細(xì)胞對(duì)裸鼠結(jié)腸癌生長(zhǎng)及肝轉(zhuǎn)移的抑制作用[J]. 2014， 36（4）： 424- 427.

（收稿日期：2014-12-25）endprint