武玲等

[摘要] 目的 對比研究常氧（21%）、低氧（5%）和高氧（40%）條件下不同濃度吉非替尼（gefitinib）對人非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）細(xì)胞株A549、HCC827、SK-MES-1增殖的影響，并探討可能的機(jī)制。方法 分別在常氧、低氧和高氧條件下以0、10、20、40、60 μmol/L gefitinib處理A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞，培養(yǎng)24 h 后收集細(xì)胞， 以CCK-8法檢測細(xì)胞增殖抑制率；應(yīng)用實時熒光定量PCR檢測HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA、EGFR mRNA的表達(dá)情況。 結(jié)果 常氧、低氧及高氧條件下，細(xì)胞增殖抑制率隨吉非替尼濃度的增加、氧濃度的升高而增加（均P<0.001）。高氧條件下，與乏氧相關(guān)的HIF-1α、VEGF-C、EGFR mRNA在A549細(xì)胞、HCC827細(xì)胞均明顯減弱（P<0.05），而SK-MES-1細(xì)胞組無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論 吉非替尼可以顯著抑制腫瘤細(xì)胞增殖，且隨著氧濃度增加作用增強(qiáng)，可能機(jī)制是提高氧濃度可以進(jìn)一步下調(diào)活化的HIF-1α、VEGF-C、EGFR mRNA的表達(dá)。

[關(guān)鍵詞] 氧濃度；非小細(xì)胞肺癌；細(xì)胞增殖；吉非替尼；表皮生長因子受體

[中圖分類號] R59 [文獻(xiàn)標(biāo)識碼] A [文章編號] 1674-0742（2015）06（c）-0112-03

[Abstract] Objective To investigate the effects of gefitinib on the proliferation of non-small cell lung cancer （NSCLC） cell line A549， HCC827， and SK-MES-1 under different oxygen conditions and explore the underlying molecular mechanism. Methods Under the condition of normal oxygen， low oxygen and high oxygen， Human NSCLC A549， HCC827， SK-MES-1cells were cultured in 0，10，20，40，60μmol/L gefitinib. The cells were collected one day after and cell proliferation inhibition rate were investigated by CCK-8 assay and of real-time fluorescent quantitative PCR was applied to detect the expression of HIF-1α mRNA， VEGF-C mRNA， EGFR mRNA. Results CCK-8 assay results showed that under the condition of normal oxygen， low oxygen and high oxygen， cell proliferation inhibition rate increase with the increasing of the concentration of gefitinib and the rising of oxygen concentration （P<0.001） .Under the condition of high oxygen， related to the lack of oxygen of HIF - 1 alpha， VEGF - C， EGFR mRNA in A549 cells， HCC827 cells were significantly reduced （P < 0.05）， while SK - MES - 1 cell groups has no statistical significance. Conclusion Gefitinib can significantly inhibit tumor cell proliferation and its effect enhances with the increasing of oxygen concentration. The possible mechanism is that the improvement of the oxygen concentration can further lower the expression of activated HIF-1α， VEGF-C， EGFR mRNA

[Key words] Oxygen concentration； Non-small-cell lung cancer； Cell proliferation； Gefitinib； Epidermal growth factor

絕大多數(shù)的惡性實體腫瘤具有腫瘤細(xì)胞增殖速度快和腫瘤血管結(jié)構(gòu)、功能異常的特點，導(dǎo)致腫瘤組織內(nèi)乏氧，藥物通過物理性彌散途徑到達(dá)作用靶區(qū)困難，降低療效，從而造成腫瘤細(xì)胞耐藥性的發(fā)生[1-2]。缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）是腫瘤細(xì)胞為適應(yīng)乏氧微環(huán)境環(huán)境而啟動的一系列生物學(xué)改變的關(guān)鍵調(diào)控因子[2]。目前，阻斷表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）抑制劑吉非替尼是人肺非小細(xì)胞肺癌癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）靶向治療臨床應(yīng)用廣泛的藥物[3]。如何通過改善腫瘤微環(huán)境提升人肺非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞對吉非替尼的敏感性需要進(jìn)一步研究。該研究采用CCK-8法和RT-PCR法探討適度提高氧濃度，吉非替尼對A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞株增殖的影響及其可能的內(nèi)在機(jī)制，現(xiàn)報道如下。endprint

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞及主要試劑

實驗時間為2014年1月—2015年1月，A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞株均購自中國科學(xué)院細(xì)胞庫， 吉非替尼由英國Astra Zeneca有限公司惠贈。F12K培養(yǎng)基、RPMI-1640培養(yǎng)基、MEM培養(yǎng)基購于HyClone公司。胎牛血清購于天津康源生物有限公司；0.25%胰酶-EDTA購自HyClone公司；CCK-8試劑盒購自日本化工公司；DMSO購自Sigma公司；細(xì)胞RNA提取試劑盒購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自TaKaRa公司；PCR試劑盒購自上海生工生物工程股份有限公司；RT-PCR試劑盒購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組 ①A549細(xì)胞培養(yǎng)于含 10% FBS的F12K培養(yǎng)基中。②HCC827細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。③SK-MES-1細(xì)胞培養(yǎng)于含10%FBS的MEM培養(yǎng)基中。細(xì)胞貼壁80%時以0.25%胰酶消化重懸，調(diào)整細(xì)胞密度按氧條件、藥物濃度分組，待各組細(xì)胞處于對數(shù)生長期，實驗組加入相應(yīng)濃度吉非替尼，對照組加相應(yīng)體積的二甲基亞砜溶液。

1.2.2 藥物配制和使用 取gefitinib（250 mg/片）一片制成粉末，溶于4 mLDMSO配制成140 mmol/L的藥物原液置于-20℃保存， 實驗前用無血清RPMI-1640培養(yǎng)液稀釋成所需濃度， 每次實驗中DMSO的最高終濃度小于0.03%。

1.2.3 細(xì)胞增殖檢測 取對數(shù)生長期細(xì)胞， 每孔100μL接種于96孔培養(yǎng)板中。24 h后分別加入不同濃度的gefitinib（ 0、10、20、40、60 μmol/L）、對應(yīng)的全培養(yǎng)液為空白對照， 每組設(shè)置3個平行復(fù)孔。置不同氧濃度、37℃、5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后， 每孔加CCK-8 10μL混勻， 37℃孵育4 h，酶標(biāo)儀檢測波長450 nm的每孔吸光度值（A值）求其平均值。據(jù)吸光度值計算細(xì)胞抑制率。上述實驗重復(fù)3次。

1.2.4 實時熒光定量PCR檢測 三種人肺癌細(xì)胞調(diào)整細(xì)胞濃度為5×105/mL，每孔 1 mL接種于6孔板，培養(yǎng)約6 h后細(xì)胞貼壁，取出各塊培養(yǎng)板，吸去各孔上清液，按分組每孔2mL加入0、40 μmol/L的gefitinib。空白對照組以相同體積的培養(yǎng)基代替。按分組培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞懸液12 000rpm離心1 min棄上清得到細(xì)胞沉淀。細(xì)胞充分裂解，提取出RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件設(shè)置為42℃ 15 min。RT-PCR每個體系為20 μL，其中cDNA為1.4 μL、引物1.6 μL。每孔均需設(shè)置3個復(fù)孔。此實驗重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計方法

用SPSS 17.0軟件進(jìn)行3×3×5析因設(shè)計、兩兩比較采用F檢驗，實驗數(shù)據(jù)以（x±s）表示， t檢驗和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 常氧、低氧和高氧條件下，吉非替尼對人肺癌A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞株增殖的抑制

同一氧濃度下，不同濃度的gefitinib作用于同一細(xì)胞株24 h，細(xì)胞增殖抑制率顯著高于對照組（P<0.05），由表1、2、3得細(xì)胞增殖抑制率隨gefitinib濃度增加而增加（P<0.05）。但同一氧濃度下，隨藥物濃度增加，不同細(xì)胞的增殖能力不同（P<0.05），可見高氧條件下，HCC827細(xì)胞增殖能力最差。在處理同一種細(xì)胞時，隨著藥物濃度、氧濃度越高，細(xì)胞增殖能力明顯減弱（P<0.05），3種細(xì)胞均可見高氧條件下gefitinib濃度為60 μmol/L時細(xì)胞增值抑制率最高。就相同作用時間、相同濃度gefitinib而言，高氧、常氧和低氧條件下細(xì)胞增殖抑制率有差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。且有HCC827細(xì)胞在高氧條件下，在gefitinib濃度為60 μmol/L時的OD值最小，細(xì)胞增殖能力最差。

2.2 常氧、低氧和高氧條件下相關(guān)指標(biāo)比較

常氧、低氧和高氧條件下，運用0、40 μmol/L的gefitinib作用于A549細(xì)胞24 h后，HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA表達(dá)量在高氧條件下明顯下降，其表達(dá)量分別為0.413μm ol/L和0.479 μmol/L，與常氧、低氧相較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但常氧和低氧條件下差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表4。

3 討論

吉非替尼是一種選擇性酪氨酸酶抑制劑，通過與ATP競爭性結(jié)合胞外的配體結(jié)合位點，阻斷酪氨酸激酶的活化過程，抑制EGFR激活，從而抑制細(xì)胞增殖和血管生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡[3]。值得注意的是，藥物臨床有效率低[4]。考慮與實體腫瘤細(xì)胞和細(xì)胞間質(zhì)兩者之間所構(gòu)成的腫瘤-宿主界面微環(huán)境的平衡狀態(tài)有關(guān)[5]。腫瘤微環(huán)境的新生血管的結(jié)構(gòu)與功能異常、乏氧，導(dǎo)致遠(yuǎn)離血管的腫瘤組織不能達(dá)到有效的治療藥物濃度[5]，這是實體腫瘤非手術(shù)治療療效差的主要因素，增加了惡性腫瘤的侵襲性和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移幾率[6]。

該實驗選用人非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞株原發(fā)耐藥株A549、敏感株HCC827、鱗狀細(xì)胞癌SK-MES-1為研究對象，改變氧濃度及藥物濃度，檢測其對細(xì)胞增殖、HIF-1α、VEGF-C 及EGFR 的mRNA表達(dá)的研究。以探討能否通過改變氧濃度提高細(xì)胞對于藥物的敏感性。研究結(jié)果顯示，隨著氧濃度的適度提高、藥物濃度的增加，A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞的增殖受到明顯抑制，且以HCC827細(xì)胞株為著。另外，A549細(xì)胞株可見HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA、EGFR mRNA表達(dá)量在高氧條件下明顯下降，值得注意的是在常氧和低氧條件下，EGFR mRNA的表達(dá)隨氧濃度增加而下降，HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA表達(dá)無差異。HCC827細(xì)胞VEGF-C mRNA、EGFR mRNA表達(dá)量隨著氧濃度升高，表達(dá)量下降，而HIF-1α mRNA表達(dá)量僅在高氧條件下明顯下降。SK-MES-1細(xì)胞24 h后，HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA、EGFRmRNA表達(dá)量無明顯改變。已有研究證實通過調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)可以改善乏氧微環(huán)境導(dǎo)致的吉非替尼耐藥的發(fā)生[7]。西妥昔單抗、雷帕霉素均已被證實可以作用于乏氧微環(huán)境下非小細(xì)胞肺癌中乏氧誘導(dǎo)因子HIF-1α的表達(dá)來誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡[8-9]。多項研究發(fā)現(xiàn)[8-10]，血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor ，VEGF）是HIF-1α下游的一個重要的靶點，在腫瘤細(xì)胞乏氧微環(huán)境中HIF-1α和VEGF的表達(dá)明顯上調(diào)，VEGF mRNA表達(dá)量隨HIF-1α mRNA表達(dá)量增高而增高。實驗證實[10]，通過一些手段阻斷HIF-1α表達(dá)可以抑制腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生VEGF，抑制腫瘤異常血管生成。該實驗說明適度給予高氧可以下調(diào)HIF-1α mRNA的表達(dá)，進(jìn)一步下調(diào)腫瘤細(xì)胞A549、HCC827細(xì)胞VEGFmRNA的表達(dá)來參與抑制腫瘤異常血管的新生，改善正常血管的血供，從而改善腫瘤乏氧的微環(huán)境，提高腫瘤微環(huán)境的藥物濃度。然而肺鱗癌SK-MES-1細(xì)胞株各實驗組的結(jié)果與二者有差異，可能是由其他機(jī)制導(dǎo)致，尚需進(jìn)一步深入研究。該研究數(shù)據(jù)與目前國內(nèi)外研究成果相近，但該研究數(shù)據(jù)顯示，高氧情況下吉非替尼能夠有效抑制A549、HCC827以及SK-MES-1細(xì)胞的增值。該研究中，常氧、低氧和高氧條件下，運用0、40 μmol/L的gefitinib作用于A549細(xì)胞24 h后，HIF-1α mRNA、VEGF-C mRNA表達(dá)量在高氧條件下明顯下降，其表達(dá)量分別為0.413 μm ol/L和0.479 μmol/L，與常氧、低氧相較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），但常氧和低氧條件下差異無統(tǒng)計學(xué)意義。endprint

綜上所述，該研究通過適度提高腫瘤微環(huán)境的氧濃度，論證能否提高腫瘤細(xì)胞對吉非替尼的敏感性。結(jié)果表明，高氧情況下吉非替尼可以顯著抑制A549、HCC827、SK-MES-1細(xì)胞的增殖，且可能通過下調(diào)HIF-1相關(guān)基因表達(dá)有關(guān)。研究結(jié)果提示，適度提高氧濃度能夠改善腫瘤組織缺氧所致的低氧應(yīng)激基因的表達(dá)和腫瘤細(xì)胞凋亡功能異常，從而提高腫瘤細(xì)胞對藥物的敏感性，且這種改變具有一定的普遍性，有一定的臨床指導(dǎo)意義。

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（收稿日期：2015-03-27）endprint