羅琛艷，李　浩，肖　洋，段金芳，劉　影，竇志英

延胡索藥材及飲片的UPLC質(zhì)量控制方法*

羅琛艷，李浩，肖洋，段金芳，劉影，竇志英

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193）

［目的］檢測延胡索藥材及飲片中有效成分的含量，建立延胡索藥材和飲片的超高液相色譜法（UPLC）質(zhì)量控制方法。［方法］采用UPLC檢測方法，ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm），乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，調(diào)pH值至5.0（A），流速：0.3 mL/min，柱溫：45℃，進(jìn)樣量：5 μL；梯度洗脫。以延胡索乙素和去氫紫堇堿的含量為指標(biāo)對延胡索的水提液進(jìn)行檢測。［結(jié)果］樣品中延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之間，去氫紫堇堿的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之間，不同樣品延胡索乙素和去氫紫堇堿的含量差異很大。［結(jié)論］UPLC法的靈敏度更高、檢測速度更快，適用于組分多、成分復(fù)雜的中藥材的分析及質(zhì)量的評價(jià)。

延胡索；UPLC；延胡索乙素；去氫紫堇堿

延胡索為罌粟科植物延胡索（Corydalis yanhusuo W.T.Wang）的干燥塊莖［1］。能“行氣中血滯，血中氣滯，專治一身上下諸痛”，止痛效果明顯且無成癮性［2］，應(yīng)用廣泛。延胡索主要的藥效成分為生物堿，已經(jīng)鑒定近40個(gè)生物堿，其中延胡索乙素的止痛效果最佳［3-5］，去氫紫堇堿對心血管系統(tǒng)作用明顯［6-8］，但生物堿的檢測、定量較復(fù)雜且耗時(shí)。超高液相色譜（UPLC）法分析法精度高［9］，目前已廣泛應(yīng)用于代謝組學(xué)、藥物分析、環(huán)境、食品以及化妝品［10-16］等，在中藥分析方面運(yùn)用逐漸增多。延胡索的UPLC檢測方法較少，實(shí)驗(yàn)建立延胡索藥材、飲片中延胡索乙素和去氫紫堇堿的UPLC快速定量法，為延胡索的質(zhì)控、制劑、代謝組學(xué)以及復(fù)方研究等奠定基礎(chǔ)。

1　儀器、試藥和樣品

UPLC超高效液相色譜儀（Waters公司），醋（天津市天立獨(dú)流老醋股份有限公司），甲醇（色譜純/天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），甲酸（色譜純/天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），氨水（分析純/天津市化學(xué)試劑批發(fā)公司），乙腈（Sigma公司），水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司）；延胡索乙素（中國藥品生物制品檢定所，批號(hào)110726-201011），去氫紫堇堿（Zhongxin Innova Laboratories，CAS：30045-16-0）。

2　樣品信息

樣品信息見表1。

3　實(shí)驗(yàn)方法

3.1色譜條件Waters公司ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）。檢測波長：280 nm。流動(dòng)相：乙腈（B）-0.1%甲酸水溶液，氨水調(diào)pH值至5.0（A）。流速：0.3 mL/min。柱溫：45℃。進(jìn)樣量：5 μL。梯度洗脫：0～9 min，15%～29%B；9～15 min，29%～40%B；15～16 min，40%～50%B；16～16.1 min，50%～15%B。見圖1、圖2。

3.2標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備精密稱取延胡索乙素和去氫紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品1.40、1.66 mg，分別加甲醇溶解定容至10 mL容量瓶中，得到濃度分別為0.140、0.166 g/L的標(biāo)準(zhǔn)品溶液。

量取上述延胡索乙素標(biāo)準(zhǔn)溶液1 mL，去氫紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL，加甲醇定容至10 mL容量瓶中，配成濃度分別為0.014 0、0.033 2 g/L的混標(biāo)溶液。

3.3樣品溶液的制備精密稱取10 g飲片，8倍量水，浸泡40 min，一次回流提取45 min，過濾，濾渣加6倍量水，回流提取30 min，過濾，合并濾液，濃縮，移至100 mL容量瓶中，加水定容。精密移取300 μL樣品，加入3倍甲醇混勻，離心（10000r/min，10min），取上清液過0.22 μm微孔濾膜，備用。

3.4方法學(xué)

3.4.1線性關(guān)系考察分別精密移取延胡索乙素、去氫紫堇堿儲(chǔ)備液適量，用甲醇稀釋一系列濃度的對照品溶液，延胡索乙素的濃度分別為28.0、24.5、21.0、17.5、14.0、10.5、7.0、3.5 mg/L，去氫紫堇堿的濃度分別為66.4、58.1、49.8、41.5、33.2、24.9、16.6、8.3μg/mL，進(jìn)樣量為5 μL，測定峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)（Y），質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，延胡索乙素的回歸方程為=15 742X+2 455，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 6，線性范圍在0.017 5～0.140 0 μg；去氫紫堇堿的回歸方程為=28 506X+16 093，相關(guān)系數(shù)r= 0.999 1，線性范圍0.041 5～0.332 0 μg。

表1　樣品信息

圖1　標(biāo)準(zhǔn)品色譜圖（a：去氫紫堇堿；b：延胡索乙素）

圖2　延胡索樣品圖

3.4.2精密度實(shí)驗(yàn)吸取延胡索乙素和去氫紫堇堿混標(biāo)溶液，在色譜條件“3.1”下，連續(xù)進(jìn)樣6針，記錄峰面積，計(jì)算RSD%分別為：0.51%、0.34%，表明儀器精密度良好。

3.4.3穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)精密稱取藥材，按“3.3”項(xiàng)提取處理方法，按“3.1”色譜條件在0、2、4、8、12、24 h分別進(jìn)樣，記錄峰面積，計(jì)算RSD分別為：0.61%、0.67%，表明樣品中延胡索乙素和去氫紫堇堿在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

3.4.4重現(xiàn)性實(shí)驗(yàn)精密稱取同1個(gè)樣品6份，按“3.3”提取處理方法，在“3.1”色譜條件下測定峰面積，計(jì)算各對照品的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，結(jié)果延胡索乙素的RSD為：2.44%，去氫紫堇堿的RSD為：2.94%，表明重現(xiàn)性良好。

3.4.5加樣回收實(shí)驗(yàn)精密稱定已測知含量的飲片約5.0 g，加入延胡索乙素和去氫紫堇堿標(biāo)準(zhǔn)品，相當(dāng)于生藥藥材中延胡索乙素的100%、去氫紫堇堿的100%，按“3.3”項(xiàng)下操作制備供試品溶液，在“3.1”色譜條件下分析。見表2。

表2　加樣回收率實(shí)驗(yàn)

4　溶出量測定結(jié)果

根據(jù)“3.3”項(xiàng)下方法制備樣品，用“3.1”項(xiàng)色譜條件進(jìn)行含量測定，以延胡索乙素（權(quán)重60%），去氫紫堇堿（權(quán)重40%）的加權(quán)含量（mg/g）為指標(biāo)，具體結(jié)果見表3。

表3　延胡索乙素、去氫紫堇堿的含量及加權(quán)得分mg/g

表3　延胡索乙素、去氫紫堇堿的含量及加權(quán)得分mg/g

序號(hào)　延胡索乙素　去氫紫堇堿　加權(quán)總含量1　0.461 3±0.012 5　1.519 2±0.034 8　0.884 5 2　0.379 6±0.014 5　0.966 0±0.080 1　0.614 2 3　0.316 3±0.018 0　0.781 0±0.067 0　0.502 2 4　0.681 7±0.004 3　1.311 6±0.009 2　0.933 7 5　0.775 5±0.021 5　1.442 3±0.008 4　1.042 2 6　0.605 2±0.014 5　2.670 8±0.160 9　1.431 4 7　0.289 7±0.014 3　2.687 1±0.175 5　1.248 7 8　0.287 5±0.016 4　2.769 3±0.171 5　1.280 2 9　0.414 4±0.031 0　1.501 1±0.101 7　0.849 1 10　0.229 1±0.003 6　2.419 9±0.138 5　1.105 4 11　0.428 7±0.045 8　1.880 0±0.066 1　1.009 2 12　0.632 9±0.016 8　2.729 9±0.077 8　1.471 7 13　0.323 0±0.025 2　2.931 0±0.223 0　1.366 2 14　0.609 0±0.035 0　1.289 6±0.052 1　0.881 2 15　0.699 2±0.016 7　2.099 2±0.021 7　1.259 2 16　0.518 8±0.043 9　2.972 1±0.198 6　1.500 1 17　0.632 5±0.005 9　2.538 1±0.046 4　1.394 7 18　0.527 9±0.030 7　2.570 1±0.150 6　1.344 8 19　0.476 7±0.023 2　1.591 5±0.091 2　0.922 6 20　0.381 9±0.009 7　1.810 0±0.104 0　0.953 1

延胡索乙素的含量在0.229 1～0.775 5 mg/g之間，去氫紫堇堿的含量在0.781 0～2.931 0 mg/g之間，延胡索乙素和去氫紫堇堿加權(quán)后的溶出量在0.502 2～1.471 7 mg/g之間。

5　討論

UPLC法是在高效液相色譜法（HPLC）系統(tǒng)的基礎(chǔ)上，提高色譜柱效能達(dá)到的高分析精度。文獻(xiàn)報(bào)道［17-18］HPLC法檢測延胡索成分，達(dá)到色譜峰分離度良好，分析時(shí)間需40～70 min。本實(shí)驗(yàn)檢測延胡索的分析時(shí)間只需13 min，檢測出10個(gè)色譜峰，延胡素乙素和去氫紫堇堿的保留時(shí)間為8.06 min和6.78 min。UPLC比HPLC更快速、簡便、靈敏、有機(jī)試劑用量少［19-20］。在實(shí)驗(yàn)過程中，多次出現(xiàn)系統(tǒng)堵塞現(xiàn)象，對進(jìn)入U(xiǎn)PLC系統(tǒng)的樣品水提液都需流動(dòng)相沉淀除雜。

由實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，延胡索樣品中延胡索乙素最低含量為0.229 1 mg/g，最高為0.775 5 mg/g；去氫紫堇堿的含量最低為0.7810mg/g，最高為2.9310mg/g；含量差異顯著。2010版藥典中以濃氨水-甲醇（1∶20）的混合液為提取溶劑，對延胡索中延胡索乙素的含量有限定；臨床湯方應(yīng)用多以水為溶劑，建議規(guī)定水提液中延胡索乙素及其它生物堿含量的最低限度。

本方法不僅可以用于延胡索藥材和飲片中有效成分的檢測，同時(shí)在已發(fā)表文章［21］用于復(fù)方金鈴子散、元胡止痛片和延胡索湯中延胡索有效成分的含量測定，建立了延胡索藥材、飲片和復(fù)方的UPLC快速評價(jià)方法。

［1］國家藥典委員會(huì).中國藥典2010年版一部［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:70-71.

［2］金國章，王月娥，張振德，等.延胡索的藥理研究—ⅩⅢ.延胡索乙素對動(dòng)物成癮性的實(shí)驗(yàn)［J］.生理學(xué)報(bào)，1978，30（1）: 67-74.

［3］胥彬，金國章.延胡索的藥理研究Ⅱ，延胡索乙素和丑素的耐藥性［J］.生理學(xué)報(bào)，1957，21（2）:158-162.

［4］杜蘭芳，杜永平，徐暉，等.延胡索乙素對大鼠外周鎮(zhèn)痛作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國中醫(yī)急癥，2009，18（5）:781-783.

［5］王殊秀，冷玉芳，高向梅，等.延胡索乙素對大鼠慢性神經(jīng)病理性疼痛的影響［J］.臨床麻醉學(xué)雜志，2012，28（7）:705-707.

［6］蔣燮榮，吳慶仙，施化蓮，等.脫氫紫堇堿對心血管系統(tǒng)的藥理作用［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，1982，17（1）:61-65.

［7］付彥君，尤春來，張效禹，等.去氫紫堇堿對大鼠離體胸主動(dòng)脈平滑肌的作用［J］.中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2001，15（5）:326-329.

［8］趙昕.脫氫紫堇堿對培養(yǎng)心肌細(xì)胞內(nèi)鈣調(diào)控的作用機(jī)制的研究［D］.沈陽：中國醫(yī)科大學(xué)，2004.

［9］石俊敏，管佳，張慶文，等.超高效液相色譜在藥物分析中的應(yīng)用［J］.藥物分析雜志，2008，28（9）:1583-1588.

［10］馬曉麗，孟磊，李新霞，等.基于UPLC/Q-TOF MS的糖尿病尿液代謝組學(xué)研究［J］.分析測試學(xué)報(bào)，2014，33（6）:621-627.

［11］劉芷，賈英，趙旭，等.五味子的UPLC指紋圖譜研究［J］.中草藥，2014，45（11）:1631-1633.

［12］鄭雅楠，廖茂梁，孫衛(wèi)，等.穿山龍超高效液相色譜特征指紋圖譜的研究［J］.現(xiàn)代藥物與臨床，2015，30（1）:28-32.

［13］陳勇，陳重均，李勁，等.超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法檢測三七藥材中10種真菌毒素［J］.藥學(xué)學(xué)報(bào)，2015，50（1）: 81-85.

［14］袁培耘，陳卓，楊成閣，等.ASE-UPLC-PDA法測定PM2.5中16種多環(huán)芳烴［J］.環(huán)境科學(xué)與技術(shù)，2015，38（2）:89-93.

［15］徐能斌，錢飛中，馮加永，等.超高效液相色譜-質(zhì)譜法檢測土壤中的羥基化多溴聯(lián)苯醚［J］.分析化學(xué)，2015，43（2）: 251-256.

［16］譚建華，李慧勇，席紹峰，等.超高效液相色譜法同時(shí)鑒定育發(fā)化妝品中17種植物提取物標(biāo)識(shí)成分［J］.分析化學(xué)，2015，43（1）:110-114.

［17］竇志英，孫巍，田麗莉，等.HPLC法比較延胡索生品與不同炮制品中3種有效成分的含量［J］.中藥材，2007，30（4）: 399-401.

［18］羅利云.不同產(chǎn)地延胡索有效成分的含量測定［J］.臨床醫(yī)學(xué)工程，2011，18（10）:1622-1624.

［19］陳佳，王鋼力，姚令文，等.UPLC和H PLC方法對丹參藥材中丹酚酸B含量測定結(jié)果的比對［J］.藥物分析雜志，2008，28（5）:749-751.

［20］吳櫻，楊義芳，羅明利，等.康視明合劑中柚皮苷的UFLC法測定［J］.中國醫(yī)藥工業(yè)雜志，2007，38（12）:868-869.

［21］吳梓君，張靜怡，羅琛艷，等.延胡索生熟飲片在復(fù)方配伍后藥效成分溶出規(guī)律研究［J］.天津中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2014，33（3）:181-184.

The UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces

LUO Chen-yan，LI Hao，XIAO Yang，DUAN Jin-fang，LIU Ying，DOU Zhi-ying
（Tianjin University of Traditional Chinese medicine，Tianjin 300193，China）

［Objectiye］To develop a UPLC quality control method of Corydalis Rhizamo herbs and herbal pieces by determining the contents of active components.［Methods］The separation was performed on an ACQUITY UPLC BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）column in the UPLC method.The mobile phases consisted of acetonitrile（B）and 0.1%formic acid aqueous solution（A，pH=5.0）with gradient elution.The flow rate and column temperature were set at 0.3 mL/min and 45℃，respectively.The injection volume was 5 μL.The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were taken as indexes for the water extract of corydalis rhizoma.［Results］The content of tetrahydropalmatine was in the range of 0.229 1～0.775 5 mg/g and that of dehydrocorydaline was 0.781 0～2.931 0 mg/g. The contents of tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline varied greatly in different samples of Corydalis Rhizamo.［Conclusion］Tetrahydropalmatine and dehydrocorydaline were stable in the water extract，which could be used as the index components for the quality control of Corydalis Rhizamo.The UPLC method was fast，efficient and of higher sensitivity.It was suitable for the rapid detection of active components and the quality evaluation of traditional Chinese medicines.

Corydalis Rhazamo；UPLC；tetrahydropalmatine；dehydrocorydaline

R284

A

1673-9043（2015）06-0357-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.11

2011年中醫(yī)藥行業(yè)科研專項(xiàng)（20110700709）。

羅琛艷（1989-），女，碩士研究生，研究方向?yàn)橹兴幊煞盅芯亢唾|(zhì)量控制。

竇志英，E-mail：zhiyingdou@163.com。

（2015-07-14）