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        血清含量對(duì)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)特性及遷移能力的影響*

        2015-08-29 11:54:49張澤曦李墨靈杜天樂(lè)夏慶梅
        關(guān)鍵詞:劃痕孵育活力

        張澤曦,李墨靈,杜天樂(lè),夏慶梅,張 晗

        ·學(xué)生園地·

        血清含量對(duì)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)特性及遷移能力的影響*

        張澤曦,李墨靈,杜天樂(lè),夏慶梅,張晗

        (天津中醫(yī)藥大學(xué),天津300193)

        [目的]考察不同血清含量以及培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT)細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移特性的影響,為HaCaT細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。[方法]培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,按10%血清濃度全培基(全培基陽(yáng)性對(duì)照組)、2%低濃度血清培基(低血清培基組)及無(wú)血清培基(對(duì)照組)分組,通過(guò)進(jìn)行細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn),CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)、Brdu細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn),分析HaCaT生長(zhǎng)特性。[結(jié)果]在24 h內(nèi),低血清培基組HaCaT細(xì)胞與全培基組相比,細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異,細(xì)胞活力有增高的趨勢(shì)。細(xì)胞孵育48 h后,全培基組細(xì)胞增殖能力及活力明顯升高。24~48 h,全培基組細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力的提升速度明顯高于低血清培基組。[結(jié)論]培養(yǎng)基中血清含量對(duì)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)特性及遷移能力具有重要影響,培養(yǎng)24 h內(nèi)低血清培養(yǎng)條件有利于劃痕實(shí)驗(yàn)的觀察與測(cè)定。

        HaCaT細(xì)胞;劃痕實(shí)驗(yàn);創(chuàng)傷修復(fù);方案優(yōu)化

        角質(zhì)形成細(xì)胞是人表皮的兩大類主要組成細(xì)胞之一。人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT細(xì)胞)是由成人表皮細(xì)胞自發(fā)轉(zhuǎn)化而來(lái)的細(xì)胞系,具有永生性,并與角質(zhì)形成細(xì)胞具有相似的增殖、分化特性,遺傳特性穩(wěn)定[1],是現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中常使用的一種細(xì)胞系。國(guó)內(nèi)外學(xué)者常將該細(xì)胞系應(yīng)用于治療各類皮膚病的藥物實(shí)驗(yàn)研究中,包括皮膚修復(fù)愈合、銀屑病、防曬等研究[2-3]。創(chuàng)傷修復(fù)是一個(gè)涉及表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、成纖維細(xì)胞等多種類型細(xì)胞間相互作用以及多個(gè)病理生理反應(yīng)機(jī)制的復(fù)雜過(guò)程[4-5]。因此,很多人也將HaCaT細(xì)胞應(yīng)用于有關(guān)皮膚燒傷后創(chuàng)傷修復(fù)的研究:研究促進(jìn)創(chuàng)面修復(fù)的因素[6],HaCaT細(xì)胞過(guò)度增殖而引起的創(chuàng)傷后創(chuàng)面過(guò)再生的問(wèn)題[7],以及利用HaCaT細(xì)胞為種子細(xì)胞構(gòu)建新型人組織工程皮膚[8]。

        細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)是一種操作簡(jiǎn)單的研究細(xì)胞遷移的體外實(shí)驗(yàn)方法,在一定程度上模擬了體內(nèi)細(xì)胞遷移的過(guò)程,是研究創(chuàng)傷愈合的常用檢測(cè)方法之一[9-10]。創(chuàng)傷愈合是細(xì)胞遷移和增殖共同作用的結(jié)果,在實(shí)際細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)中,研究者為觀察藥物對(duì)細(xì)胞遷移的作用,常采用低血清培養(yǎng)條件,以降低細(xì)胞增殖能力,減少血清對(duì)藥物作用的干擾。應(yīng)用人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞HaCaT進(jìn)行劃痕實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn),在2%低血清培基孵育細(xì)胞24 h后與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢(shì)更為明顯,繼續(xù)培養(yǎng)24 h后,全培基組劃痕愈合率明顯高于低血清培基組。在此基礎(chǔ)上,通過(guò)培養(yǎng)HaCaT細(xì)胞,進(jìn)行CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)、Brdu增殖實(shí)驗(yàn),考察不同血清含量以及培養(yǎng)不同時(shí)間對(duì)HaCaT細(xì)胞的生長(zhǎng)及遷移特性影響,為HaCaT細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)條件優(yōu)化提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐,現(xiàn)將對(duì)此研究報(bào)道如下。

        1 材料與方法

        1.1實(shí)驗(yàn)材料

        1.1.1細(xì)胞人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(HaCaT),購(gòu)自北京協(xié)和細(xì)胞庫(kù)。

        1.1.3細(xì)胞培養(yǎng)試劑與檢測(cè)試劑 MEM/eb(sHyClone)、胎牛血清(BI)、雙抗(HyClone青霉素+鏈霉素,青霉素10 000 U/mL,鏈霉素10 000 μg/mL)、胰酶(0.25%胰蛋白酶+0.125%EDTA、BI)、BrdU試劑(羅氏)、CCK-8檢測(cè)試劑盒(Dojindo)。

        1.2實(shí)驗(yàn)方法

        1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)與分組HaCaT細(xì)胞以2×105cells/cm2接種于25 cm2的培養(yǎng)瓶中,在溫度37℃和5%二氧化碳的環(huán)境下,用含10%胎牛血清和1%雙抗的MEM/ebs培基培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞貼滿瓶底90%~100%時(shí),使用胰酶?jìng)鞔?。將HaCaT細(xì)胞分別接種于10%血清濃度全培基(全培基陽(yáng)性對(duì)照組,10%FBS組)、2%低濃度血清培基(低血清培基組,2%FBS組)及無(wú)血清培基(對(duì)照組,0%FBS組)的24或96孔板中培養(yǎng)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

        1.2.2細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)按每孔3×104細(xì)胞濃度接種HaCaT細(xì)胞于96孔板,待板中的細(xì)胞貼壁90%以上,更換無(wú)血清培基,16 h后,將細(xì)胞如上分組,使用細(xì)胞劃痕器進(jìn)行細(xì)胞劃痕,并繼續(xù)培養(yǎng),分別在24、48 h鏡下觀察照相比較,計(jì)算劃痕損傷面積愈合率。

        1.2.3CCK-8法活力檢測(cè)按每孔3×104細(xì)胞濃度接種HaCaT細(xì)胞于96孔板,待板中的細(xì)胞貼壁70%,更換無(wú)血清培基,16 h后按如上分組,培養(yǎng)24 h和48 h后每孔加入100 μL的10%CCK-8試劑,溫箱孵育30 min后用酶標(biāo)儀檢測(cè)A值。

        1.2.4Brdu增殖實(shí)驗(yàn)以每孔3×104細(xì)胞接種HaCaT細(xì)胞于96孔板,待板中的細(xì)胞貼壁70%,待板中的細(xì)胞貼壁70%以上,更換無(wú)血清培基同步化培養(yǎng)16 h,按如上分組,24 h和48 h后,依照BrdU試劑盒說(shuō)明書(shū)操作檢測(cè),在450 nm處測(cè)量A值。

        2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

        2.1細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)細(xì)胞劃痕培養(yǎng)24 h后,無(wú)血清培基組面積愈合率為(17.07±6.15)%,低血清培基組面積愈合率為(40.19±4.7)%,全培基組面積愈合率為(37.94±4.2)%。無(wú)血清培基組與全培基組、低血清培基組相比存在明顯差異(P<0.01)。細(xì)胞劃痕培養(yǎng)48h后,無(wú)血清培基組面積愈合率為(19.95±6.6)%,低血清培基組面積愈合率為(44.68±5.17)%,全培基組(62.37±3.69)%,無(wú)血清培基組與低血清培基組、全培基組相比存在顯著差異(P<0.01)。低血清培基組與全培基組相比,存在明顯差異(P<0.01)。見(jiàn)圖1。

        2.2CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)細(xì)胞孵育24 h后,無(wú)血清培基組A值為(0.58±0.03),低血清培基組A值為(0.68±0.05),全培基組A值為(0.62±0.03)。24 h檢測(cè),低血清培基、全培基組與無(wú)血清培基組相比存在差異(P<0.05),低血清培基組與全培基組相比存在差異(P<0.05)。細(xì)胞孵育48 h后,無(wú)血清培基組A值為(0.63±0.08),低血清培基組A值為(0.73± 0.03),全培基組A值為(0.88±0.05)。低血清培基組、全培基組與無(wú)血清培基組相比,均存在顯著差異(P<0.01)。低血清培基組與全培基組相比存在顯著差異(P<0.01)。與24 h相比,48 h的無(wú)血清培基組細(xì)胞平均活力增長(zhǎng)了9%,低血清培基組細(xì)胞平均活力增長(zhǎng)了7%,全培基組細(xì)胞平均活力增長(zhǎng)了42%。24~48 h,全培基組細(xì)胞活力明顯高于低血清培基組和無(wú)血清培基組。見(jiàn)表1、圖2。

        圖1 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞劃痕的影響

        表1 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

        表1 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

        注:與24 h的0%FBS相比,*P<0.05;與24 h的10%FBS組相比,#P<0.05;與48 h的0%FBS組相比,△P<0.01;與48 h的10%FBS組相比,▲P<0.01。

        組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時(shí)間(h) CCK-8 A值24 0.58±0.030 48 0.63±0.080* 24 0.68±0.050*#48 0.73±0.030△▲24 0.62±0.038 48 0.88±0.050△

        圖2 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞活力的影響

        2.3Brdu實(shí)驗(yàn)細(xì)胞孵育24 h后無(wú)血清培基組吸光度為(1.13±0.28),低血清培基組吸光度為(1.58± 0.14),全培基組吸光度(1.48±0.06),與無(wú)血清培基組相比、低血清培基組、全培基組間均存在明顯差異(P<0.01)。細(xì)胞孵育48 h后無(wú)血清培基組吸光度為(1.20±0.14),低血清培基組吸光度為(1.73±0.12),全培基組吸光度為(1.87±0.11)。與24 h相比,48 h的無(wú)血清培基組細(xì)胞增殖率平均值提高了6%,低血清培基組細(xì)胞增殖率平均值提高9%,全培基組細(xì)胞增值率平均值提高了26%。24~48 h,全培基組細(xì)胞增殖能力提高速度明顯高于低血清培基組和無(wú)血清培基組。見(jiàn)表2、圖3。

        表2 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響

        表2 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響

        注:與孵育24 h的0%FBS相比,*P<0.01;與孵育48 h的0% FBS組相比,#P<0.01。

        組別0%FBS組2%FBS組10%FBS組n 6 6 6 6 6 6時(shí)間(h) CCK-8 A值24 1.13±0.28 48 1.20±0.14 24 1.58±0.14* 48 1.73±0.12#24 1.48±0.068 48 1.87±0.11#

        圖3 不同培基對(duì)HaCaT細(xì)胞增殖能力的影響

        3 結(jié)論與討論

        在本研究中,采用HaCaT細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞劃痕、CCK-8細(xì)胞活力檢測(cè)、Brdu增殖實(shí)驗(yàn),結(jié)果顯示:在24 h內(nèi),低血清培基組HaCaT細(xì)胞與全培基組相比,細(xì)胞增殖能力無(wú)明顯差異,細(xì)胞活力有增高的趨勢(shì)。隨著孵育時(shí)間的延長(zhǎng),細(xì)胞孵育48 h后,全培基組細(xì)胞增殖能力及細(xì)胞活力明顯升高,其增殖速率明顯高于低血清培基組。

        細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)常用于檢測(cè)藥物對(duì)皮膚角質(zhì)、成纖維細(xì)胞,血管內(nèi)皮、平滑肌細(xì)胞,神經(jīng)元以及腫瘤細(xì)胞的遷移或侵襲能力[11-12],是考察細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力的常用實(shí)驗(yàn)之一[13-14]。在劃痕實(shí)驗(yàn)操作方法中,常推薦研究者采用無(wú)血清或低血清培養(yǎng)條件,減少血清對(duì)細(xì)胞增殖的影響[15-16]。但實(shí)驗(yàn)中,若只研究藥物對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響,同時(shí)考慮到藥物孵育時(shí)間(24~72 h),研究者常采用低血清培養(yǎng)條件,以期降低細(xì)胞增殖能力,減少變量干擾的同時(shí)保證細(xì)胞正常的存活狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn),劃痕24 h后,低血清培基孵育細(xì)胞與全培基組相比劃痕損傷愈合趨勢(shì)更為明顯,同時(shí)CCK-8和Brdu實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)低血清培基組與全培基組相比在24 h并不能抑制細(xì)胞增殖能力,且細(xì)胞活力較全培基組有升高的趨勢(shì)。出現(xiàn)這種現(xiàn)象考慮可能有兩種原因:1)低血清濃度的培基可能使該細(xì)胞產(chǎn)生代償性增殖[17]。2)在24 h內(nèi),低血清培基中的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)因子可能負(fù)擔(dān)其增殖所需,而隨著細(xì)胞增殖到一定數(shù)量,低血清培基的營(yíng)養(yǎng)與生長(zhǎng)因子已經(jīng)不足以負(fù)擔(dān)該細(xì)胞繼續(xù)增殖。因此隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng),低血清培基組細(xì)胞的增殖速率逐漸下降。在培養(yǎng)48 h后,全培基組顯示其劃痕愈合率明顯高于低血清培基組,全培基組細(xì)胞增殖能力與活力明顯升高,其增殖速率明顯高于低血清培基組。根據(jù)考察藥物作用的不同以及藥物孵育時(shí)間的長(zhǎng)短,應(yīng)重視無(wú)血清或低血清培養(yǎng)條件的選擇。絲裂霉素(MMC)具有抑制成纖維等細(xì)胞分裂增殖的能力[18],是劃痕實(shí)驗(yàn)中經(jīng)常使用的細(xì)胞增殖抑制劑之一[19-20]。在實(shí)驗(yàn)中,若只考察藥物短時(shí)間內(nèi)(24 h以內(nèi))對(duì)細(xì)胞遷移能力的影響,采用無(wú)血清培養(yǎng)條件可能較為適宜,或者考慮加入適量絲裂霉素。

        上述研究提示,雖然劃痕實(shí)驗(yàn)是一種操作簡(jiǎn)單,普遍使用的經(jīng)典實(shí)驗(yàn)方法,但在實(shí)際的操作過(guò)程中仍應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、?xì)胞狀態(tài)、藥物選擇與孵育時(shí)間等因素選擇適宜的實(shí)驗(yàn)條件,調(diào)整實(shí)驗(yàn)方法,從而得到更穩(wěn)定準(zhǔn)確科學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。培養(yǎng)基中血清含量對(duì)HaCaT細(xì)胞生長(zhǎng)特性及遷移能力具有重要影響,選擇適宜血清培養(yǎng)條件有利于劃痕實(shí)驗(yàn)觀察與測(cè)定。

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        Effect of serum content on the growth characteristic in the HaCaT cells

        ZHANG Ze-xi,LI Mo-ling,DU Tian-le,XIA Qing-mei,ZHANG Han
        (Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

        [Objective]By studying the growth characteristic of the HaCaT cells in conditions of the serum free medium,low serum medium and the serum medium.Put forward the optimization scheme of the HaCaT Wound scratch assay.[Methods]Culture HaCaT cell,grouped into 10%serum medium(positive control group),2%low serum prudential(low serum prudential group)and serum free prudential(control group),through the HaCaT wound scratch assay,CCK-8 assay,Brdu assay,analysis the HaCaT growth characteristics.[Results]With in 24 h,low serum prudential group HaCaT cells compared with the positive control group,no difference between the cell proliferation,cell vitality had increase tendency,incubation cells after 48 h,positive control group cell proliferation ability and cell viability higher than low serum prudential group.Between 24 h and 48 h,10%serum medium positive control group cell proliferation ability and speed of cell viability was obviously higher than that of low serum prudential group.[Conclusion]If it is only in the actual experiments,study drug in a short period of time(within 24 h)on HaCaT cell migration ability,the influence of culture in serum-free conditions may be more appropriate.

        HaCaT cell;wound scratch assay;wound healing;optimization experiment

        R285.5

        A

        1673-9043(2015)06-0369-04

        10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.14

        大學(xué)生科技創(chuàng)新基金(CXJJ2012C02);國(guó)家自然基金(81373789)。

        張澤曦(1993-),男,天津中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院2011級(jí)學(xué)生。

        張晗,E-mail:zhanghan0023@126.com。

        (2015-08-15)

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