楊紅云，劉曉雷，柴麗娟，王少峽，胡利民

血栓通及單體成分人參皂苷Rd對內毒素激活小膠質細胞的影響*

楊紅云，劉曉雷，柴麗娟，王少峽，胡利民

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津市中藥藥理學重點實驗室，教育部方劑學重點實驗室，天津300193）

［目的］研究血栓通及其單體成分對小膠質細胞（BV-2）的影響及其作用機制。［方法］實驗分為對照組、脂多糖刺激組、加藥組和陽性藥米諾環(huán)素組，CCK-8檢測血栓通（不同稀釋倍數的血栓通及其單體成分）對小膠質細胞活力的影響；Greiss法檢測脂多糖（LPS）誘導小膠質細胞一氧化氮（NO）產生的影響，實時定量聚合酶鏈反應（PCR）檢測炎性基因的表達。［結果］血栓通在0.5～50 mg/L范圍內對LPS誘導的小膠質細胞NO的產生沒有抑制作用；在血栓通5種單體成分中，人參皂苷Rg1、Rb1、Re、三七皂苷對小膠質細胞NO的產生沒有抑制作用；人參皂苷Rd在不影響細胞活力的情況下能明顯抑制NO產生，并且能抑制炎癥基因誘導型一氧化氮合酶（iNOS）及白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA的表達。［結論］血栓通單體成分人參皂苷Rd抑制激活的小膠質細胞產生NO和iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達可能是血栓通發(fā)揮神經保護作用的物質基礎。

血栓通；一氧化氮；炎性介質；小膠質細胞

小膠質細胞是一種神經膠質細胞，是中樞神經系統(tǒng)的第一道，更是最主要的免疫防線，主要功能是清除中樞神經系統(tǒng)中損壞的神經、斑塊及感染性物質。因此腦缺血、神經退行性疾病、感染等引起的許多微環(huán)境因子變化可迅速使小膠質細胞活化?；罨男∧z質細胞能顯著上調許多細胞因子的分泌水平，能夠通過產生抗炎作用而促進神經元的存活；而大部分為一氧化氮（NO）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白介素等細胞毒性物質能直接損傷神經元或引起其他繼發(fā)性損傷。誘導型一氧化氮合酶（iNOS）是合成NO的重要酶類，iNOS對學習記憶的影響是通過NO的作用來實現的［1］。NO是內源性血管舒張因子的主要活性成分［2］，能引起血管擴張，增加血流量，參與機體生理調節(jié)，具有促細胞凋亡和抗細胞凋亡的雙重特性，其促凋亡和抗凋亡的作用很大程度上依賴于量的多少和及其發(fā)揮作用的細胞類型［3］?，F階段治療和緩解神經退行性疾病和腦損傷的重要手段，是抑制活化的小膠質細胞所引發(fā)的炎癥反應［4-5］。中風后通過減弱血腦屏障的通透性和減少神經細胞凋亡抑制小膠質細胞活性而達到保護腦組織的目的［6］。因此調節(jié)小膠質細胞炎癥反應作為神經保護的方案略受到越來越多的關注。

血栓通的主要成分為三七總皂苷，三七總皂苷具有耐缺氧、改善微循環(huán)、增加機體免疫力、抗炎、抗衰老等多方面的生理活性［7］，特別是它具有較強的抗氧化作用，直接清除氧自由基的作用［8］，并且能減輕腦水腫，改善血腦屏障通透性［9］。因此在很多領域都得到了廣泛應用，主要應用在心腦血管系統(tǒng)疾病和中樞神經系統(tǒng)疾?。?0］，對腦血管繼發(fā)性損傷有保護作用，能有效抑制神經細胞凋亡有抑制作用［11］，但其作用機制尚不明確。本實驗采用脂多糖（LPS）激活小膠質細胞，考察注射用血栓通抗神經炎癥的作用及機制。

1　材料與方法

1.1材料與試劑小膠質細胞株BV-2（北京協(xié)和醫(yī)學院），注射用血栓通（吉林敖東股份有限公司），血栓通單體成分人參皂苷Rg1、Rb1、Re、Rd及三七皂苷（中新藥業(yè)）。胰蛋白酶、DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清（Gibco，美國）；T25細胞培養(yǎng)瓶，96孔、48孔、12孔細胞培養(yǎng)板（Corning），NO檢測試劑盒（碧云天），Cell Counting Kit-8（CCK-8，北京同仁化學）；LPS（碧云天），二氧化碳（CO2）恒溫培養(yǎng)箱（THERMO，FORMA3111型，美國），倒置相差顯微鏡（Nikon，TE200，日本），低溫高速離心機（BECKMAN，64R型，美國），實時定量PCR儀（ABI，7500型，美國），DU-800紫外分光光度計（DNA/Protein Analyzer，BECKMAN，美國），PCR1000（BIO RAD，日本），Trizol（invitrogen）。

1.2BV-2小鼠小膠質細胞株的培養(yǎng)37℃水浴復蘇細胞，接種于corning T25培養(yǎng)瓶中，放于孵箱中培養(yǎng)［5%CO2、95%氮氣（N2）、37℃飽和濕度］，待細胞融合后用胰蛋白酶消化種板。

1.3血栓通及單體對小膠質細胞活力的影響待細胞匯合后胰酶消化，調整細胞濃度至4×105個/mL，接種于96孔板，每孔加液量為0.1 mL，培養(yǎng)過夜，將細胞完全培養(yǎng)液替換為含有血栓通（終濃度分別為50 mg/L）及其單體成分的（10 μmol/L）基礎培養(yǎng)液孵育24 h，棄去上清，加入用基礎培養(yǎng)基配制的CCK-8（終濃度V/V1∶10）繼續(xù)孵育0.5h后于450 nm處讀取吸光度值。

1.4血栓通及其單體對小膠質細胞NO產生的影響待細胞匯合后胰酶消化，調整細胞的濃度為4×105個/mL，接種到48孔板，每孔加液量為0.4 mL，培養(yǎng)過夜，將細胞完全培養(yǎng)液替換為含有不同濃度的血栓通（終濃度分別為50、5、0.5 mg/L）和血栓通單體成分（終濃度10 μmol/L）的基礎培養(yǎng)液預孵0.5 h，后加入LPS（終濃度0.1 mg/L）刺激，繼續(xù)培養(yǎng)24h后吸取50μL細胞上清，Greiss法檢測NO濃度。

1.5人參皂苷Rd對小膠質細胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響待細胞匯合后胰酶消化，調整細胞濃度至4×105個/mL，接種到12孔板，每孔加液量為2.5 mL，培養(yǎng)過夜，將細胞完全培養(yǎng)液替換為含有血栓通單體成分（終濃度10 μmol/L）的基礎培養(yǎng)基預孵0.5h，然后加入LPS（0.1mg/L）刺激，37℃孵育8 h后提取總核糖核酸（RNA）。用DU800檢測RNA濃度及A260/A2801.5μgRNA反轉錄為cDNA（20μL體系）。取1μL的cDNA產物作為模板加入炎癥基因引物進行擴增，看家基因GAPDH作為內參。數據采用2-△△CT相對定量法分析。

1.6統(tǒng)計學方法采用SPSS18.0軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料用均數±標準差表示，組間差異性比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，若方差齊采用LSD法，若方差不齊采用Dunnett’s T3法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2．1CCK-8檢測血栓通對小膠質細胞活力的影響與對照組相比，陽性藥米諾環(huán)素組、血栓通組（50 mg/L）細胞活力沒有統(tǒng)計學差異，表明米諾環(huán)素、血栓通（50 mg/L）均沒有細胞毒作用。見表1。

表1　血栓通對小膠質細胞活力的影響

表1　血栓通對小膠質細胞活力的影響

注：結果重復3次，趨勢一致。

組別對照組血栓通組米諾環(huán)素組n 6 6 6 1.261 0±0.077 2 50 mg/L00　1.361 2±0.041 2 10 μmol/L　1.381 6±0.101 5濃度　吸光度-

2.2Greiss法檢測血栓通對小膠質細胞分泌NO的影響與對照組相比，LPS組能顯著增加NO的釋放，與LPS組相比，陽性對照組米諾環(huán)素能明顯抑制NO的釋放，血栓通（0.5～50 mg/L）不能抑制NO的釋放。見表2。

表2　血栓通對小膠質細胞NO的影響

表2　血栓通對小膠質細胞NO的影響

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，##P＜0.01。結果重復3次，趨勢一致。

組別對照組LPS組血栓通組米諾環(huán)素組n 6 6 6　6濃度　NO濃度（μmol/L）-0-1.326 8±0.241 3 00.1 mg/L　015.919 3±1.090 1** 50.0 mg/L　013.062 1±1.154 9 05.0 mg/L　014.184 6±1.701 1 00.5 mg/L　015.142 2±0.536 5 0010.0 μmol/L　005.387 3±0.444 5##

2.3CCK-8檢測血栓通單體對小膠質細胞活力的影響與對照組相比，人參皂苷Rd、Rg1、Rb1、Re，三七皂苷組細胞活力均沒有統(tǒng)計學差異，表明這5種單體成分無細胞毒作用。見表3。

表3　血栓通單體成分對小膠質細胞活力的影響

表3　血栓通單體成分對小膠質細胞活力的影響

注：結果重復3次，趨勢一致。

組別對照組人參皂苷Rd人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1人參皂苷Re三七皂苷組n 6 6 6 6 6 6濃度（μmol/L）　吸光度-1.167±0.057 1 10　1.219±0.066 3 10　1.222±0.078 8 10　1.187±0.057 8 10　1.193±0.055 9 10　1.137±0.062 7

2.4Greiss法檢測血栓通單體成分對小膠質細胞分泌NO的影響與對照組相比，LPS組能顯著增加NO的釋放。與LPS組相比，人參皂苷Rd在無細胞毒的情況下能明顯抑制NO的釋放，人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Re、三七皂苷對NO無明顯抑制作用。見表4。

表4　血栓通單體成分對小膠質細胞分泌NO的影響μmol/L

表4　血栓通單體成分對小膠質細胞分泌NO的影響μmol/L

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，##P＜0.01。結果重復3次，趨勢一致。

組別對照組LPS組人參皂苷Rd n 6 6 6 6 6 6 6 -1.071 9±0.223 6 00.0.1　12.513 1±1.543 0** 10　8.656 9±1.464 4##濃度　NO濃度-人參皂苷Rg1人參皂苷Rb1 10　12.464 1±0.439 1 10　10.705 9±0.458 9人參皂苷Re三七皂苷10　11.990 2±0.539 4 10　12.977 1±2.324 8

2.5人參皂苷Rd對小膠質細胞iNOS、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）mRNA表達的影響與對照組相比，LPS組能明顯提高iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達；與LPS組比較，人參皂苷Rd能顯著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA的表達。見表5。

表5　人參皂苷Rd對小膠質細胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響μmol/L

表5　人參皂苷Rd對小膠質細胞iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA表達的影響μmol/L

注：與對照組比較，**P＜0.01；與LPS組比較，#P＜0.05，##P＜0.01。結果重復3次，趨勢一致。

組別　iNOS　IL-1β　IL-6對照組　1.048±0.403　1 711.006±290.135　1.049±000.415 LPS組　32.451±2.366**1 718.022±294.243**6 465.623±837.678**人參皂苷Rd　11.293±0.390##1 241.609±302.286#1 118.268±115.271##n 6 6 6濃度-0.1 mg/L 10 μmol/L

3　討論

血栓通0.5～50 mg/L范圍內對LPS誘導的小膠質細胞NO的產生沒有抑制作用，在血栓通5種單體成分中，人參皂苷Rd可以在不影響細胞活力的情況下抑制NO產生，同時能顯著抑制iNOS、IL-1β、IL-6 mRNA等炎癥基因的表達。

小膠質細胞是中樞神經系統(tǒng)的巨噬細胞，具有免疫防御和炎癥反應［12］?；罨男∧z質細胞可合成和分泌一系列細胞因子、蛋白質或其他生物活性分子，這些物質中某些發(fā)揮神經保護作用，某些可產生神經毒性作用，進而導致神經元死亡［13-14］。

小膠質細胞受到刺激后迅速激活，其形態(tài)功能發(fā)生明顯改變。抑制小膠質細胞活化可以減輕腦內繼發(fā)性損傷，同時使受損的組織和細胞得到修復。研究表明，血栓通單體成分人參皂苷Rd在不影響細胞活力的前提下，能明顯抑制小膠質細胞活化釋放NO、抑制多數炎癥基因mRNA的表達。因此，血栓通可能是通過抑制小膠質細胞活化減少炎癥介質的釋放來發(fā)揮其神經保護作用的機制之一。

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Effect of Xueshuantong and Ginsenoside Rd on lipopolysaccharides actived microglia cells

YANG Hong-yun，LIU Xiao-lei，CHAI Li-juan，WANG Shao-xia，HU Li-min
（Key Laboratory of Pharmacology of Traditional Chinese Medical Formulae，Ministry of Education，Tianjin Key Laboratory of Chinese medicine Pharmacology，Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To study the effects of Xueshuantong and its monomer on actived microglia（BV-2）and its mechanism.［Methods］The experiment was divided into control group，lipopolysaccharide（LPS）group，dosing group and positive control group（mino），detecting of Xueshuantong（different dilution multiples of Xueshuantong and its monomer composition）to the vitality of microglia and nitric oxide（NO）induced by LPS using the Greiss method.［Results］Between 0.5～50 μg/mL，Xueshuantong could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，among the 5 kinds of monomer composition of Xueshuantong，ginsenoside Rg1，Rb1，Re and Notoginsenoside could not inhibit the microglia release NO induced by LPS，however，ginsenoside Rd could inhibit NO secretion without affecting the cell vitality，and inhibit the mRNA expression of iNOS，IL-1β，IL-6.［Conclusion］The monomer composition of ginsenoside Rd in Xueshuangtong can inhibit activated microglia release NO and the mRNA of iNOS，IL-1β，IL-6 significantly.It may be one of neural protection mechanism.

Xueshuantong；nitric oxide；inflammatory mediator；microglia

R285.5

A

1673-9043（2015）06-0342-04

10.11656/j.issn.1673-9043.2015.12.07

國家重大新藥創(chuàng)制項目資助（2012ZX09101201-004）。

楊紅云（1987-），女，碩士研究生，主要從事神經藥理學研究。

王少峽，E-mail:wangshaoxia1978@hotmail.com。

（2015-07-13）