謝勉 何朝生 魏慎海

轉(zhuǎn)化生長因子β（transforming growth factor β, TGF-β）是一類具有多種生物學(xué)功能的多肽類生長因子超家族，目前已發(fā)現(xiàn)5種TGF-β亞型，在哺乳類動物中有TGF-β1、TGF-β2和TGF-β3三種亞型，其中，TGF-β1是人體中發(fā)現(xiàn)最多的一種亞型。TGF-β對肺癌具有雙重作用。肺癌早期TGF-β信號通路中各個成分改變都將影響TGF-β對肺癌的抑制作用，促進(jìn)肺癌的發(fā)生。在肺癌晚期，由于TGF-β具備的其他功能，如刺激腫瘤血管生長，降低細(xì)胞間的粘附以及合成細(xì)胞外基質(zhì)等，為肺癌的生長、轉(zhuǎn)移提供微環(huán)境，使肺癌更具侵襲性。

Smads蛋白可分為三類：第一類是受體活化Smads（receptor-activited Smads, R-Smads），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5和Smad8；第二類是共有Smad（Co-Smad），即Smad4，他是TGF-β超家族信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中必不可少的調(diào)控轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵因子。第三類被稱為抑制性Smad（inhibitory Smads, I-Smads），包括Smad6和Smad7。Smads蛋白作為受體后下游信號傳遞分子，其失活或突變同樣可導(dǎo)致TGF-β對肺癌生長抑制作用的喪失。

我們前期實(shí)驗(yàn)研究（Western blot）發(fā)現(xiàn)8株肺癌細(xì)胞株的TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)較正常支氣管上皮細(xì)胞增高，Smad4蛋白表達(dá)較正常支氣管上皮細(xì)胞下降，而其他Smads蛋白表達(dá)無明顯差異（結(jié)果未發(fā)表）。本研究擬采用免疫組化方法觀察非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer, NSCLC）中TGF-β1、Smad2、Smad4蛋白的表達(dá)，以揭示TGF-β1/Smad信號傳導(dǎo)通路在肺癌中的變化，探討TGF-β1/Smad在肺癌發(fā)生發(fā)展中的相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料 連續(xù)選取我院胸外科2003年1月-2003年12月85例行根治性肺葉切除加縱隔淋巴結(jié)清掃的初診肺癌患者；排除存在第二腫瘤患者。其中男性61例，女性24例；年齡34歲-77歲，中位年齡60歲。47例腺癌，28例鱗癌，10例腺鱗癌；I期25例，II期22例，IIIa期38例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移53例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移32例；術(shù)后輔助化療患者共66例，I期13例，II期20例，IIIa期33例；2例IIIa期患者接受術(shù)后輔助放療?；颊邚?fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移后接受規(guī)范化放療或靶向治療。患者隨訪至2009年4月1日?？偵嫫诙x為首次手術(shù)至死亡或末次隨訪時間。隨訪5年以上，生存期4個月-74個月，83例患者完成隨訪，2例患者失訪。中位生存期36個月，尚存活17人。

1.2 免疫組化試驗(yàn)

1.2.1 試劑 兔抗人TGF-β1多克隆抗體（sc-146），稀釋度為1:400；兔抗人p-Smad2/3多克隆抗體（sc-11769-R），稀釋度為1:400；兔抗人Smad4多克隆抗體（sc-7154），稀釋度為1:100，以上試劑購自Santa Cruz公司。辣根酶標(biāo)記羊抗兔多聚體（pv-6001）工作液試劑盒購自北京中山公司。

1.2.2 試驗(yàn)步驟 依據(jù)說明書以TGF-β1陽性的乳腺癌，Smad2、Smad4陽性的胰腺癌分別為TGF-β1、Smad2、Smad4的陽性對照，用PBS緩沖液作為陰性對照，采用sp三步法進(jìn)行免疫組化檢測。具體步驟如下：組織標(biāo)本常規(guī)石蠟包埋，制備4 μm切片，貼附于APES處理的載破片上，65 ℃烘烤1 h，二甲苯脫蠟，梯度乙醇脫水，3%H2O2室溫孵育10 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min，置于抗原修復(fù)液中微波爐抗原修復(fù)，使溫度保持92 ℃-98 ℃持續(xù)10 min-15 min，室溫冷卻20 min-30 min使蛋白恢復(fù)原有空間構(gòu)型，PBS沖洗5 min×4次，滴加山羊血清封閉以消除電荷吸附所造成的非特異性背景染色，室溫放置30 min；加稀釋的一抗，4 ℃孵育過夜；PBS沖洗5 min×4次；滴加生物素標(biāo)記二抗，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 min×4次；滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素，37 ℃孵育30 min，PBS沖洗5 ℃×4次；DAB顯色，自來水沖洗，復(fù)染蘇木素，1%鹽酸酒精分化，封片。

1.2.3 免疫組化結(jié)果的判斷 每張切片隨機(jī)取3個高倍視野，著色部位明顯高于背景或背景不著色而細(xì)胞著色者為陽性細(xì)胞染色，以陽性腫瘤細(xì)胞比例的平均值定義為該腫瘤陽性細(xì)胞百分比。TGF-β1結(jié)果判斷參照Huang等[1]的標(biāo)準(zhǔn)：陰性為無著色癌細(xì)胞（-）；弱陽性為著色癌細(xì)胞比例小于25%（+）；中度陽性為著色癌細(xì)胞比例為25%-75%（++）；強(qiáng)陽性為著色癌細(xì)胞比例大于75%（+++）。Smad2、Smad4結(jié)果判斷參照Yang等[2]的標(biāo)準(zhǔn)：陰性為無著色癌細(xì)胞（-）；陽性為著色癌細(xì)胞比例為5%-30%（+）；強(qiáng)陽性為著色癌細(xì)胞比例大于30%（++）。以癌旁間質(zhì)細(xì)胞中出現(xiàn)同上染色顆粒為癌旁組織陽性表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 16.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Pearson卡方、校正卡方檢驗(yàn)或Fisher's精確檢驗(yàn)。Logistic回歸分析TGF-β1、Smad2、Smad4、P分期、N分期、T分期作為獨(dú)立變量對總生存期的預(yù)測影響；首先行單因素Cox和Kaplan-Meier分析，多因素分析采用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)回歸模型。Log-rank檢驗(yàn)評價單因素生存分析結(jié)果。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 TGF-β1的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 TGF-β1主要定位于腫瘤細(xì)胞，陽性結(jié)果為細(xì)胞胞漿呈棕褐色（圖1A）。85例肺癌組織中，TGF-β1表達(dá)陰性為37例（43.53%），TGF-β1表達(dá)弱陽性為13例（15.29%），TGF-β1表達(dá)中度陽性為15例（17.65%），TGF-β1表達(dá)強(qiáng)陽性為20例（23.53%）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N1和N2）的TGF-β1表達(dá)率明顯高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移組（N0）（P=0.002）。III期肺癌TGF-β1表達(dá)明顯高于I期、II期（P＜0.001）。TGF-β1的表達(dá)與患者年齡、性別、組織類型以及遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)無關(guān)（表1）。

2.2 Smad2、Smad4的表達(dá)與臨床病理的關(guān)系 Smad2主要定位于腫瘤細(xì)胞，陽性結(jié)果為細(xì)胞核呈棕褐色（圖1B）。Smad2表達(dá)陽性78例（91.76%）。Smad2的表達(dá)與各臨床病理因素?zé)o關(guān)（表1）。Smad4主要定位于腫瘤細(xì)胞，陽性結(jié)果為細(xì)胞胞漿呈棕褐色（圖1C）。Smad4表達(dá)陽性76例（89.41%）。Smad4表達(dá)陰性者肺癌分期較晚（P=0.014）（表1）。

2.3 TGF-β1、Smad2、Smad4的表達(dá)與生存期的關(guān)系TGF-β1表達(dá)陰性組的生存期與TGF-β1表達(dá)陽性組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.294）（圖2A）。肺腺癌中，TGF-β1表達(dá)陰性組生存期長于TGF-β1表達(dá)陽性性組（P=0.038）（圖2B）。TGF-β1表達(dá)陽性組5年總生存率為25.7%；TGF-β1表達(dá)陰性組為51.6%，較TGF-β1表達(dá)陽性組明顯增加（P=0.003）（表1）。TGF-β1表達(dá)陰性組和陽性組5年無病生存率無明顯差異（P=0.124）。Smad2、Smad4的表達(dá)與5年P(guān)FS率無關(guān)。Smad2和Smad4的表達(dá)與生存期無關(guān)（Smad2P=0.409；Smad4P=0.596）（圖3）。85例肺癌單因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）和肺癌分期（P=0.001）與預(yù)后有關(guān)，多因素分析顯示淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（P=0.001）為獨(dú)立的預(yù)后因素（表2）。47例肺腺癌多因素分析顯示TGF-β1（P=0.032）和N分期（P=0.028）為獨(dú)立的預(yù)后因素（表3）。

表1 85例非小細(xì)胞肺癌患者的TGF-β1、Smad2和Smad4表達(dá)與臨床病理指標(biāo)的關(guān)系Tab1 The correlationship between the expressions of TGF-β1, Smad2, Smad4 and clinicopathological characteristics in 85 NSCLC patients

圖1 非小細(xì)胞肺癌TGF-β1、Smad2和Smad4的表達(dá)。A：肺鱗癌表達(dá)TGF-β1，呈細(xì)胞漿陽性（SP，×200）；B：肺腺癌表達(dá)Smad2，呈細(xì)胞核陽性（SP，×200）；C：肺鱗癌表達(dá)Smad4，呈細(xì)胞漿陽性（SP，×400）；D：陰性對照（SP，×400）。Fig1 TGF-β1, Smad2, and Smad4 expression in non-small cell lung cancer. A: TGF-β1 expression in lung squamous carcinoma(cellular localization in cytoplasm) (×200); B: Smad2 expression in lung adenocarcinoma (cellular localization in nucleus) (×200); C: Smad4 expression in lung squamous carcinoma (cellular localization in cytoplasm) (×400); D: Negative control (×400).

圖2 NSCLC患者TGF-β1表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線。A：NSCLC患者TGF-β1表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線；B：肺腺癌患者TGF-β1表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線。Fig2 Influence of TGF-β1 expression on overall survival. A: Influence of TGF-β1 expression on overall survival in NSCLC patients (Kaplan-Meier multivariate analysis); B: Influence of TGF-β1 expression on overall survival in lung adenocarcinoma patients (Kaplan-Meier multivariate analysis).

圖3 NSCLC患者Smad2和Smad4表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線。A：NSCLC患者Smad2表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線；B：NSCLC患者Smad4表達(dá)陰性組和陽性組的生存曲線。Fig3 Influence of Smad2 and Smad4 expression on overall survival. A : Influence of Smad2 expression on overall survival in NSCLC patients(Kaplan-Meier multivariate analysis); B: Influence of Smad4 expression on overall survival in NSCLC patients (Kaplan-Meier multivariate analysis).

3 討論

TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑在參與腫瘤形成過程中發(fā)揮重要作用。TGF-β在腫瘤細(xì)胞中過度表達(dá)不僅通過刺激血管發(fā)生及其潛在的免疫抑制作用促進(jìn)腫瘤發(fā)展，而且能夠直接影響腫瘤細(xì)胞的浸潤和轉(zhuǎn)移。TGF-β對腫瘤的直接影響可以通過Smads依賴途徑或干擾Smads依賴途徑介導(dǎo)完成。TGF-β1能誘導(dǎo)c-sis的表達(dá)，但抑制c-myc的表達(dá)，這種誘導(dǎo)或抑制作用與作用細(xì)胞種類及TGF-β的不同功能有關(guān)。TGF-β1的自分泌作用在較晚期的腫瘤中受到抑制，減弱了對原癌基因c-myc的抑制作用，加速腫瘤細(xì)胞從G1期進(jìn)入S期，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。我們的研究表明TGF-β1陽性表達(dá)與肺癌分期較晚和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，85例NSCLC中TGF-β1表達(dá)陽性率為56.47%，III期肺癌TGF-β1表達(dá)明顯高于I期、II期（P＜0.001）。Hasegawa等[4]采用酶聯(lián)免疫吸附方法實(shí)驗(yàn)亦發(fā)現(xiàn)III期NSCLC患者TGF-β1蛋白水平明顯高于I期、II期的患者。

Smad2是TGFβ抗增殖應(yīng)答和調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的重要級聯(lián)分子，是TGFβ-Smad信號通路中關(guān)鍵轉(zhuǎn)導(dǎo)分子之一，其生物活性改變將會影響通路功能，引起細(xì)胞周期或細(xì)胞表型的改變[5-7]。在TGFβ-Smad信號通路中任一因子失活均可干擾TGFβ-Smad信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路功能，導(dǎo)致細(xì)胞生物行為變化。本研究結(jié)果顯示在NSCLC中Smad2表達(dá)陽性者分期相對較早，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Smad4表達(dá)陽性者肺癌分期較早（P=0.009），說明Smad蛋白可能充當(dāng)腫瘤抑制因子，另外一些癌基因蛋白通過與Smad蛋白相作用抑制Smad蛋白的功能[8]。腫瘤細(xì)胞可以選擇性逃逸信號誘導(dǎo)的增長抑制或凋亡反應(yīng)，TGF-β1這些對腫瘤的直接影響都是通過Smads蛋白自主的途徑所介導(dǎo)，或通過干擾Smads依賴的途徑而作用的。TGF-β1介導(dǎo)的生長抑制功能可被顯性失活的Smad2、Smad3或Smad4全部抑制。Nye等[7]考察了人肺癌中分離到的6個Smad2和Smad4突變子的生物學(xué)和生物化學(xué)功能，發(fā)現(xiàn)由于不能同野生型Smads形成同源和（或）異源寡聚物，Smad2和Smad4的所有突變體均在TGF-β轉(zhuǎn)導(dǎo)的轉(zhuǎn)化生長抑制信號中缺失，且不能活化由Smad/hFSAT-1介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄，結(jié)果提示Smads突變體之間不能形成功能性配對，這些異?？赡茉谀[瘤發(fā)生中起作用。

表2 85例非小細(xì)胞肺癌患者總生存期的多因素分析Tab2 Kaplan-Meier multivariate survival analysis in 85 NSCLC patients

表3 47例肺腺癌患者總生存期的多因素分析Tab3 Kaplan-Meier multivariate survival analysis in 47 adenocarcinoma patients

目前尚無文獻(xiàn)報(bào)道SMAD蛋白的表達(dá)與肺癌預(yù)后的關(guān)系。本研究中多因素分析顯示Smad2和Smad4表達(dá)與生存期無關(guān)，而TGF-β1是可切除肺腺癌術(shù)后獨(dú)立預(yù)后因素。Liu等[9]發(fā)現(xiàn)TGF-β1與NSCLC分化差有關(guān)，影響肺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移，可作為NSCLC預(yù)后指標(biāo)之一。Yang等[10]發(fā)現(xiàn)肺腺癌高TGF-β1表達(dá)組（≥289 pg/mL） 比低TGF-β1表達(dá)組（＜289 pg/mL）的總生存期短。Takanami等[11]用免疫組化方法檢測120例肺腺癌組織TGF-β1的表達(dá)，結(jié)果顯示TGF-β1陰性表達(dá)組生存期比陽性表達(dá)組延長，對96例完全切除的肺腺癌病例行Cox回歸分析表明TGF-β1表達(dá)水平和肺癌分期是生存期的獨(dú)立預(yù)后因素。TGF-β1在腫瘤中可誘導(dǎo)表達(dá)VEGF、金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase 2, MMP-2）和MMP-9，負(fù)調(diào)控MMP抑制因子，提供蛋白酶豐富的微環(huán)境，有利于腫瘤細(xì)胞的遷移和浸潤適當(dāng)?shù)难苌掀ぜ?xì)胞[12]。腫瘤細(xì)胞分泌的TGF-β1能幫助瘤細(xì)胞逃避宿主免疫系統(tǒng)的監(jiān)控，易化侵襲和轉(zhuǎn)移過程[13]。TGF-β1是細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積的重要調(diào)節(jié)因子。體外試驗(yàn)[14]發(fā)現(xiàn)TGF-β1通過調(diào)控內(nèi)皮細(xì)胞的基因表達(dá)，通過增加包括膠原蛋白、纖維蛋白在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)的形成和聚集導(dǎo)致了肺腺癌中心纖維化的形成，并且也發(fā)現(xiàn)肺腺癌中心纖維化的形成與肺腺癌的預(yù)后有關(guān)。

TGF-β1/Smads在肺癌中與其他信號系統(tǒng)如BMP/BMPR2和Wnt/β-catenin等存在相互交聯(lián)，我們?nèi)孕栊羞M(jìn)一步基礎(chǔ)研究闡述TGF-β在肺癌中的詳細(xì)作用機(jī)制。本研究是回顧性單純病例研究，只選擇能根治性切除的NSCLC作為研究對象，雖然患者在復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后均接受規(guī)范化放療或靶向治療，但是并非所有患者在病情進(jìn)展的后續(xù)治療仍存在異質(zhì)性；因此本研究存在一定的偏倚。關(guān)于肺癌手術(shù)后復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移后多種治療方式的先后順序存在爭議[16]，是否影響總生存期尚不確定。我們將擴(kuò)大研究病例群體，進(jìn)一步驗(yàn)證本研究的初步結(jié)果。