王一婧，索艷榮，曾文赟，闞伯紅，姜希娟，范英昌（.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津30093；.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津30093）

心復(fù)康協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞上調(diào)心臟干細(xì)胞GATA4和Cx43 mRNA的表達(dá)

王一婧1，索艷榮1，曾文赟1，闞伯紅2，姜希娟1，范英昌1
（1.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津300193；2.天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津300193）

［目的］觀察心復(fù)康協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）對(duì)心臟干細(xì)胞（CSC）GATA4和Cx43 mRNA表達(dá)的調(diào)節(jié)。［方法］采用全骨髓貼壁法獲得BMSC，并對(duì)其進(jìn)行流式細(xì)胞鑒定。制備心復(fù)康含藥血清，高效液相色譜分析其成分，并作用于細(xì)胞共培養(yǎng)體系，采用實(shí)時(shí)定量PCR法檢測(cè)各組CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表達(dá)。［結(jié)果］相較于其他兩組，心復(fù)康組CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。［結(jié)論］心復(fù)康協(xié)同BMSC能夠上調(diào)CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表達(dá)。

心復(fù)康；骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞；心臟干細(xì)胞；GATA結(jié)合蛋白4；縫隙連接蛋白43

傳統(tǒng)觀念認(rèn)為，人體出生后心肌細(xì)胞已永久性地退出細(xì)胞分裂周期［1］，當(dāng)心肌缺血損傷后，心肌細(xì)胞僅能發(fā)生肥大。但近年來研究發(fā)現(xiàn)，成體心臟中存在提交心肌譜系的多能干細(xì)胞，即心臟干細(xì)胞［2］（CSC）。生理?xiàng)l件下，CSC長期處于靜止?fàn)顟B(tài)，一旦發(fā)生缺血性心臟病，CSC分裂功能可被激活［3］，并增生分化為心肌細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞等。由于CSC向心肌細(xì)胞分化能力弱，使其難以發(fā)揮代償作用。因此，如何促進(jìn)CSC向心肌細(xì)胞分化成為研究熱點(diǎn)。

由于具有取材便易、擴(kuò)增能力強(qiáng)且免疫原性低的優(yōu)勢(shì)［4］，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（BMSC）被認(rèn)為是治療心肌細(xì)胞丟失的重要種子細(xì)胞［5］。移植BMSC可通過促進(jìn)心臟微血管和心肌細(xì)胞生成，從而改善心功能［6］。然而，近期研究發(fā)現(xiàn)，直接通過自身的轉(zhuǎn)分化作用并非BMSC發(fā)揮修復(fù)作用的主要機(jī)制。BMSC在激活內(nèi)源性干細(xì)胞的自我更新和分化潛能中發(fā)揮更為重要的作用，而在心肌組織其可干預(yù)的重要內(nèi)源性干細(xì)胞即為CSC。盡管BMSC可協(xié)同CSC向心肌細(xì)胞分化，心肌缺血微環(huán)境卻明顯抑制了兩者的作用效果。

臨床觀察和前期研究顯示，益氣養(yǎng)陰、活血化瘀中藥復(fù)方心復(fù)康對(duì)改善心肌缺血微環(huán)境和提高缺血心肌心功能效果顯著［7］。因此假定心復(fù)康可協(xié)同BMSC促進(jìn)CSC向心肌樣細(xì)胞分化，并從觀察心復(fù)康含藥血清能否協(xié)助BMSC上調(diào)CSC向心肌樣細(xì)胞分化的基因GATA4和Cx43的mRNA表達(dá)入手，體外驗(yàn)證上述假說。

1　材料

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物8周齡C57小鼠10只，體質(zhì)量（20±1）g，雄性。5月齡家兔4只，體質(zhì)量（2.5±0.1）kg，雄性。均由北京華阜康生物科技公司提供。

1.2實(shí)驗(yàn)細(xì)胞C57小鼠CSC，由美國西北大學(xué)醫(yī)學(xué)院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈(zèng)。

1.3主要試劑DMEM（Gibco），DMEM/F12（Gibco），胎牛血清（Hyclone），PE標(biāo)記的抗CD34抗體及同型對(duì)照抗體（Santa Cruz Biotech），PE標(biāo)記的抗CD45抗體及同型對(duì)照抗體（Biolegend），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD90及同型對(duì)照抗體（Ebioscience），F(xiàn)ITC標(biāo)記的抗CD29及同型對(duì)照抗體（Ebioscience），F(xiàn)asline Cell cDNA Kit（天根），q-PCR試劑盒（北京康為世紀(jì)），PCR引物系列（北京華大科技）。

1.4主要儀器流式細(xì)胞分選儀（BD，美國），高效液相色譜儀（島津，日本），LightCycle 480實(shí)時(shí)熒光PCR系統(tǒng)（Roch，瑞士），AG22331梯度PCR儀（Eppendorf，德國）。

2　方法

2.1BMSC培養(yǎng)麻醉后處死C57小鼠，消毒，取股、脛骨，暴露髓腔。用DMEM反復(fù)沖洗髓腔，以100目篩網(wǎng)過濾沖洗液，800 r/min離心5 min，收集細(xì)胞。以含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，鏡下計(jì)數(shù)，以密度1×105個(gè)/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶。48 h后首次換液，此后每3 d換液1次，待細(xì)胞融合度為80%時(shí)傳代，選用第3～4代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2流式細(xì)胞鑒定對(duì)所獲的BMSC以抗CD29、CD90、CD34和CD45抗體進(jìn)行表面標(biāo)記，其中CD29和CD90為BMSCs特征表面標(biāo)記物，CD34和CD45為造血細(xì)胞標(biāo)記物，流式細(xì)胞儀測(cè)定。

2.3心復(fù)康含藥血清制備、鑒定

2.3.1心復(fù)康成分西洋參15 g，白術(shù)15 g，枸杞子15 g，女貞子10 g，鹿銜草10 g，昆布10 g，降香10 g。

2.3.2心復(fù)康含藥血清制備根據(jù)人與兔體表面積折算等效劑量，制備心復(fù)康中藥水煎劑，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮，每只每天灌胃1次，對(duì)照組給予等量生理鹽水。連續(xù)灌胃7 d，于末次灌胃2 h后，采用心臟直接取血法，制備無菌兔血清，于-20℃保存。

2.3.3心復(fù)康含藥血清鑒定心復(fù)康君藥為西洋參，以人參皂苷Re為代表，對(duì)所得空白血清和含藥血清進(jìn)行高效液相色譜分析。

2.4實(shí)驗(yàn)分組包括單細(xì)胞組、共培養(yǎng)組及心復(fù)康組。各組均接種CSC于transwell小室內(nèi)，密度為1×105/mL，以含10%FBS的DF12全培培養(yǎng)。單細(xì)胞組下室僅加BMSC全培，共培養(yǎng)組與心復(fù)康組下室均接種BMSC（密度為1×105/mL）。24 h后換液，在各組細(xì)胞的全培基礎(chǔ)上，單細(xì)胞組與共培養(yǎng)組的小室上下各加5%對(duì)照血清，心復(fù)康組的小室上下各加5%含藥血清，培養(yǎng)72 h后進(jìn)行檢測(cè)。

2.5GATA4和Cx43 mRNA表達(dá)的測(cè)定按照試劑說明書步驟制備細(xì)胞cDNA，用于后續(xù)熒光定量PCR檢測(cè)。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內(nèi)參基因各自的Ct值，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各樣品中目的基因相對(duì)表達(dá)量，見表1。

表1　基因引物序列及目標(biāo)產(chǎn)物大小Tab.1　Gene primer sequences

2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，統(tǒng)計(jì)作圖采用Origin 8.0軟件。

3　結(jié)果

3.1BMSC培養(yǎng)結(jié)果接種24 h后可見細(xì)胞貼壁生長，大部分呈梭形、紡錘形，少數(shù)呈三角形。原代培養(yǎng)3 d后，細(xì)胞集落樣生長，增殖加快，約14 d后細(xì)胞可鋪滿瓶底。首次傳代需嚴(yán)格控制消化時(shí)間，按1:2比例接種，傳代后細(xì)胞形態(tài)表現(xiàn)更為一致，見圖1。

圖1　BMSCs原代及傳代后生長情況Fig.1　The growth condition of BMSCs after primary and passage culture

3.2BMSC流式鑒定結(jié)果流式細(xì)胞儀分析顯示：BMSC特征表面標(biāo)記物表達(dá)比率高，分別為CD29（95.75%±1.32%）、CD90（92.29%±0.76%）；造血細(xì)胞標(biāo)記物表達(dá)比率低，分別為CD34（3.9%±0.31%）、CD45（5.24%±0.42%）。表明此培養(yǎng)方法所得BMSC純度較高，能夠滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求。

3.3心復(fù)康含藥血清鑒定結(jié)果含藥血清組在24.142 min時(shí)出現(xiàn)的峰值與人參皂苷Re對(duì)照峰相符，而空白血清在此時(shí)間段無峰值出現(xiàn)。表明所制含藥血清已含有中藥代謝成分，符合后續(xù)實(shí)驗(yàn)要求，見圖2。

3.4心復(fù)康協(xié)同BMSC對(duì)CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表達(dá)的影響熒光定量PCR結(jié)果顯示：相較于單細(xì)胞組（CSC組）與共培養(yǎng)組（CSC+ BMSC），心復(fù)康組（CSC+BMSC+XFK）中CSC的GATA4和Cx43 mRNA表達(dá)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖3。

4　討論

GATA結(jié)合蛋白4（GATA binding protein 4，GATA4）是心肌細(xì)胞內(nèi)含量豐富的組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，其在心臟早期發(fā)育過程中起著至關(guān)重要的作用，尤其對(duì)于調(diào)控編碼心肌特異性蛋白的諸多基因［8］。研究表明GATA4可誘導(dǎo)干細(xì)胞分化為心肌細(xì)胞，且GATA4是心肌祖細(xì)胞的最早期信號(hào)［9］，在心臟發(fā)育早期的中胚層就有所表達(dá)［10］。典型的心肌轉(zhuǎn)錄因子GATA4，在心肌細(xì)胞的發(fā)育成熟期，對(duì)于調(diào)節(jié)細(xì)胞系分化的核轉(zhuǎn)錄過程發(fā)揮重要作用［11］。

在各類動(dòng)物組織中，相鄰細(xì)胞的接觸區(qū)域存在廣泛的間隙連接，其由多個(gè)蛋白組成，它們共同構(gòu)成細(xì)胞間隙連接通訊通道。在胚胎發(fā)育過程中，通過間隙連接的組織間信號(hào)傳播有助于細(xì)胞的遷移和分化［12］，間隙連接在建立心肌細(xì)胞間電化學(xué)通訊中起到至關(guān)重要的作用［13］，在心臟發(fā)育過程中，3種主要的心臟間隙連接Cx（connexin）基因Cx40、Cx43或Cx45的不足易導(dǎo)致嚴(yán)重的心臟畸形［14，15］。Cx43在心肌細(xì)胞分化過程中是作為工作心肌的主要間隙連接蛋白，直接牽涉到心肌細(xì)胞信號(hào)的轉(zhuǎn)移［16］。

某些中藥復(fù)方制劑能有效誘導(dǎo)干細(xì)胞增殖、分化，并具有毒副作用小的優(yōu)勢(shì)［17］。心復(fù)康源于中醫(yī)名家阮士怡之手，是基于中醫(yī)理論所設(shè)。心肌梗死分屬于中醫(yī)學(xué)“胸痹”、“真心痛”等范疇。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為該病病位在心，與脾（胃）、腎、肝（膽）等多臟腑相關(guān)，呈現(xiàn)本虛標(biāo)實(shí)的病理特征［18］。本虛又以氣虛為主，標(biāo)實(shí)以血瘀最為突出，因此益氣活血法成為治療心梗的重要治法［19］。西洋參和白術(shù)具有益氣的功效，枸杞子和女貞子具有補(bǔ)益肝腎的功效，鹿銜草和降香具有活血止血之功效，昆布有軟堅(jiān)散結(jié)、消痰和利水的功效。該復(fù)方在臨床應(yīng)用普遍，對(duì)于氣滯血瘀型胸痹效果較好，尤其在改善患者胸悶憋氣癥狀，提高心功能方面有獨(dú)到療效。

圖2　高效液相色譜圖Fig.2　The figure of high performance liquid chromatography

圖3　各組CSC的GATA4與Cx43 mRNA相對(duì)表達(dá)量Fig.3　The GATA4 and Cx43 mRNA expression of CSC in each group

本研究顯示心復(fù)康協(xié)同骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞可以上調(diào)心臟干細(xì)胞的GATA4和Cx43 mRNA的表達(dá)，提示兩者具有促進(jìn)心臟干細(xì)胞向心肌樣細(xì)胞分化的潛能，為臨床通過藥物干預(yù)，提高干細(xì)胞移植效果提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］Soonpaa MH，F(xiàn)ield LJ.Survey of studies examining mammalian cardiomyocyte DNA synthesis［J］.Circulation Research，1998，83（1）: 15-26.

［2］Beltrami AP，Barlucchi L，Torella D，et al.Adult cardiac stem cells are multipotent and support myocardial regeneration［J］.Cell，2003，114（6）:763-776.

［3］Anversa P，Kajstura J，Leri A，et al.Life and death of cardiac stem cells:a paradigm shift in cardiac biology［J］.Circulation，2006，113（11）:1451-1463.

［4］孫連勝，徐秀梅，郭茂娟，等.丹酚酸B體外干預(yù)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化過程中cTnT的表達(dá)［J］.天津中醫(yī)藥，2007，24（4）:318-320.

［5］崔潔，范英昌，薛亮.大鼠MSCs的體外分離、培養(yǎng)及鑒定的實(shí)驗(yàn)研究［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29（5）:463-464.

［6］華聲瑜，趙桂峰，李慶雯，等.丹酚酸B預(yù)處理EPCs對(duì)AMI大鼠移植骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞后心肌微環(huán)境的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2012，29（2）:117-120.

［7］范英昌，華聲瑜，李廣斌，等.中藥干預(yù)骨髓基質(zhì)細(xì)胞移植心肌再生的研究［J］.天津中醫(yī)藥，2008，25（1）:65.

［8］Ghatpande S，Brand T，Zile M，Evans T.Bmp2 and Gata4 function additively to rescue heart tube development in the absence of retinoids［J］.Developmental Dynamics，2006，235（8）:2030-2039.

［9］Snyder M，Huang XY and Zhang JJ.Stat3 directly controls the expression of Tbx5，Nkx2.5，and GATA4 and is essential for cardiomyocyte differentiation of P19CL6 cells［J］.Biological Chemistry，2010，285（31）:23639-23646.

［10］Gao XY，Tan YZ，Wang HJ.Overexpression of Csx/Nkx2.5 and GATA-4 Enhances the Efficacy of Mesenchymal Stem Cell Transplantation After Myocardial Infarction［J］.Circulation，2011，75（11）:2683-2691.

［11］Fujiura J，Yamato E，Yonemura S.Differentiation of embryonic stem cells is induced by GATA factors［J］.Genes and Development，2002，16（7）:784-789.

［12］Levin M.Gap junctional communication in morphogenesis［J］. Progress in Biophysics and Molecular Biology，2007，94（1）:186-206.

［13］Maeda S，Tsukihara T.Structure of the gap junction channel and its implications for its biological functions［J］.Cellular and Molecular Life Sciences，2011，68（7）:1115-1129.

［14］Kumai M，Nishii K，Nakamura K，et al.Loss of connexin45 causes a cushion defect in early cardiogenesis［J］.Development，2000，127（16）: 3501-3512.

［15］Kirchhoff S，Kim JS，Hagendorff A，et al.Abnormal cardiac conduction and morphogenesis in connexin40 and connexin43 double-deficient mice［J］.Circulation Research，2000，87（5）:399-405.

［16］Ramkisoensing AA，Pijnappels DA，Swildens J，et al.Gap Junctional Coupling with Cardiomyocytes Is Necessary but Not Sufficient for Cardiomyogenic Differentiation of Cocultured Human Mesenchymal Stem Cells［J］.Stem Cells，2012，30（6）:1236-1245.

［17］李廣斌，蘇金玲，姜希娟，等.心復(fù)康聯(lián)合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植對(duì)瀕死心肌的保護(hù)作用［J］.天津中醫(yī)藥，2010，27（2）:147-149.

［18］高宇，張軍平，阮士怡.阮士怡教授治療冠心病臨證經(jīng)驗(yàn)［J］.天津中醫(yī)藥，2011，28（1）:5-6.

［19］馬文禮，郭茂娟，華聲瑜.心復(fù)康對(duì)心肌梗死大鼠心室重塑促血管生成的影響［J］.天津中醫(yī)藥，2007，26（3）:137-139.

（本文編輯：馬英，張震之）

The synergy between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells increases the expression of GATA4 and Cx43 in cardiac stem cells

WANG Yi-jing1，SUO Yan-rong1，ZENG Wen-yun1，KAN Bo-hong2，JIANG Xi-juan1，F(xiàn)AN Ying-chang1
（1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China；2.The First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine，Tianjin 300193，China）

［Objective］To observe the synergy effects between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells（BMSC）in the expression of GATA4 and Cx43 in Cardiac stem cells（CSC）.［Methods］BMSC were obtaining by the whole bone marrow adherent method，and the purity was evaluated by flow cytometry.Xinfukang convalescent serum were analyzed through high performance liquid chromatography（HPLC），and then used for cell co-culture system.Real-time quantitative PCR were used to detect the expression of GATA4 and Cx43 in groups of CSC.［Results］GATA4 and Cx43 in the Xinfukang group were increased significantly（P＜0.05）.［Conclusion］Xinfukang collaborative with BMSC can increase the expression of GATA4 and Cx43in CSC.

Xinfukang；bone marrow mesenchymal stem cell；cardiac stem cell；GATA4；Cx43

R285.5

A

1672-1519（2015）05-0291-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.10

國家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（81173413）。

王一婧（1986-），女，博士研究生，主要從事中醫(yī)藥干預(yù)心腦血管疾病的研究。

范英昌，E-mail：fych@tjutcm.edu.cn。

（2014-12-18）