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        心復康協(xié)同骨髓間充質干細胞上調心臟干細胞GATA4和Cx43 mRNA的表達

        2015-08-26 09:22:22王一婧索艷榮曾文赟闞伯紅姜希娟范英昌天津中醫(yī)藥大學天津30093天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院天津30093
        天津中醫(yī)藥 2015年5期
        關鍵詞:含藥充質骨髓

        王一婧,索艷榮,曾文赟,闞伯紅,姜希娟,范英昌(.天津中醫(yī)藥大學,天津30093;.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津30093)

        心復康協(xié)同骨髓間充質干細胞上調心臟干細胞GATA4和Cx43 mRNA的表達

        王一婧1,索艷榮1,曾文赟1,闞伯紅2,姜希娟1,范英昌1
        (1.天津中醫(yī)藥大學,天津300193;2.天津中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,天津300193)

        [目的]觀察心復康協(xié)同骨髓間充質干細胞(BMSC)對心臟干細胞(CSC)GATA4和Cx43 mRNA表達的調節(jié)。[方法]采用全骨髓貼壁法獲得BMSC,并對其進行流式細胞鑒定。制備心復康含藥血清,高效液相色譜分析其成分,并作用于細胞共培養(yǎng)體系,采用實時定量PCR法檢測各組CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表達。[結果]相較于其他兩組,心復康組CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。[結論]心復康協(xié)同BMSC能夠上調CSC中GATA4和Cx43 mRNA的表達。

        心復康;骨髓間充質干細胞;心臟干細胞;GATA結合蛋白4;縫隙連接蛋白43

        傳統(tǒng)觀念認為,人體出生后心肌細胞已永久性地退出細胞分裂周期[1],當心肌缺血損傷后,心肌細胞僅能發(fā)生肥大。但近年來研究發(fā)現(xiàn),成體心臟中存在提交心肌譜系的多能干細胞,即心臟干細胞[2](CSC)。生理條件下,CSC長期處于靜止狀態(tài),一旦發(fā)生缺血性心臟病,CSC分裂功能可被激活[3],并增生分化為心肌細胞、內皮細胞等。由于CSC向心肌細胞分化能力弱,使其難以發(fā)揮代償作用。因此,如何促進CSC向心肌細胞分化成為研究熱點。

        由于具有取材便易、擴增能力強且免疫原性低的優(yōu)勢[4],骨髓間充質干細胞(BMSC)被認為是治療心肌細胞丟失的重要種子細胞[5]。移植BMSC可通過促進心臟微血管和心肌細胞生成,從而改善心功能[6]。然而,近期研究發(fā)現(xiàn),直接通過自身的轉分化作用并非BMSC發(fā)揮修復作用的主要機制。BMSC在激活內源性干細胞的自我更新和分化潛能中發(fā)揮更為重要的作用,而在心肌組織其可干預的重要內源性干細胞即為CSC。盡管BMSC可協(xié)同CSC向心肌細胞分化,心肌缺血微環(huán)境卻明顯抑制了兩者的作用效果。

        臨床觀察和前期研究顯示,益氣養(yǎng)陰、活血化瘀中藥復方心復康對改善心肌缺血微環(huán)境和提高缺血心肌心功能效果顯著[7]。因此假定心復康可協(xié)同BMSC促進CSC向心肌樣細胞分化,并從觀察心復康含藥血清能否協(xié)助BMSC上調CSC向心肌樣細胞分化的基因GATA4和Cx43的mRNA表達入手,體外驗證上述假說。

        1 材料

        1.1實驗動物8周齡C57小鼠10只,體質量(20±1)g,雄性。5月齡家兔4只,體質量(2.5±0.1)kg,雄性。均由北京華阜康生物科技公司提供。

        1.2實驗細胞C57小鼠CSC,由美國西北大學醫(yī)學院芬伯格心血管研究所覃剛健教授惠贈。

        1.3主要試劑DMEM(Gibco),DMEM/F12(Gibco),胎牛血清(Hyclone),PE標記的抗CD34抗體及同型對照抗體(Santa Cruz Biotech),PE標記的抗CD45抗體及同型對照抗體(Biolegend),F(xiàn)ITC標記的抗CD90及同型對照抗體(Ebioscience),F(xiàn)ITC標記的抗CD29及同型對照抗體(Ebioscience),F(xiàn)asline Cell cDNA Kit(天根),q-PCR試劑盒(北京康為世紀),PCR引物系列(北京華大科技)。

        1.4主要儀器流式細胞分選儀(BD,美國),高效液相色譜儀(島津,日本),LightCycle 480實時熒光PCR系統(tǒng)(Roch,瑞士),AG22331梯度PCR儀(Eppendorf,德國)。

        2 方法

        2.1BMSC培養(yǎng)麻醉后處死C57小鼠,消毒,取股、脛骨,暴露髓腔。用DMEM反復沖洗髓腔,以100目篩網過濾沖洗液,800 r/min離心5 min,收集細胞。以含10%FBS的DMEM完全培養(yǎng)基重懸細胞,鏡下計數(shù),以密度1×105個/mL接種于25 cm2培養(yǎng)瓶。48 h后首次換液,此后每3 d換液1次,待細胞融合度為80%時傳代,選用第3~4代細胞進行后續(xù)實驗。

        2.2流式細胞鑒定對所獲的BMSC以抗CD29、CD90、CD34和CD45抗體進行表面標記,其中CD29和CD90為BMSCs特征表面標記物,CD34和CD45為造血細胞標記物,流式細胞儀測定。

        2.3心復康含藥血清制備、鑒定

        2.3.1心復康成分西洋參15 g,白術15 g,枸杞子15 g,女貞子10 g,鹿銜草10 g,昆布10 g,降香10 g。

        2.3.2心復康含藥血清制備根據(jù)人與兔體表面積折算等效劑量,制備心復康中藥水煎劑,采用旋轉蒸發(fā)儀濃縮,每只每天灌胃1次,對照組給予等量生理鹽水。連續(xù)灌胃7 d,于末次灌胃2 h后,采用心臟直接取血法,制備無菌兔血清,于-20℃保存。

        2.3.3心復康含藥血清鑒定心復康君藥為西洋參,以人參皂苷Re為代表,對所得空白血清和含藥血清進行高效液相色譜分析。

        2.4實驗分組包括單細胞組、共培養(yǎng)組及心復康組。各組均接種CSC于transwell小室內,密度為1×105/mL,以含10%FBS的DF12全培培養(yǎng)。單細胞組下室僅加BMSC全培,共培養(yǎng)組與心復康組下室均接種BMSC(密度為1×105/mL)。24 h后換液,在各組細胞的全培基礎上,單細胞組與共培養(yǎng)組的小室上下各加5%對照血清,心復康組的小室上下各加5%含藥血清,培養(yǎng)72 h后進行檢測。

        2.5GATA4和Cx43 mRNA表達的測定按照試劑說明書步驟制備細胞cDNA,用于后續(xù)熒光定量PCR檢測。實驗數(shù)據(jù)根據(jù)目的基因和內參基因各自的Ct值,采用2-ΔΔCt法計算各樣品中目的基因相對表達量,見表1。

        表1 基因引物序列及目標產物大小Tab.1 Gene primer sequences

        2.6數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析采用SPSS 19.0統(tǒng)計學軟件處理數(shù)據(jù),計量資料以均數(shù)±標準差(±s)表示,兩組間比較采用t檢驗。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義,統(tǒng)計作圖采用Origin 8.0軟件。

        3 結果

        3.1BMSC培養(yǎng)結果接種24 h后可見細胞貼壁生長,大部分呈梭形、紡錘形,少數(shù)呈三角形。原代培養(yǎng)3 d后,細胞集落樣生長,增殖加快,約14 d后細胞可鋪滿瓶底。首次傳代需嚴格控制消化時間,按1:2比例接種,傳代后細胞形態(tài)表現(xiàn)更為一致,見圖1。

        圖1 BMSCs原代及傳代后生長情況Fig.1 The growth condition of BMSCs after primary and passage culture

        3.2BMSC流式鑒定結果流式細胞儀分析顯示:BMSC特征表面標記物表達比率高,分別為CD29(95.75%±1.32%)、CD90(92.29%±0.76%);造血細胞標記物表達比率低,分別為CD34(3.9%±0.31%)、CD45(5.24%±0.42%)。表明此培養(yǎng)方法所得BMSC純度較高,能夠滿足后續(xù)實驗要求。

        3.3心復康含藥血清鑒定結果含藥血清組在24.142 min時出現(xiàn)的峰值與人參皂苷Re對照峰相符,而空白血清在此時間段無峰值出現(xiàn)。表明所制含藥血清已含有中藥代謝成分,符合后續(xù)實驗要求,見圖2。

        3.4心復康協(xié)同BMSC對CSC中的GATA4和Cx43 mRNA表達的影響熒光定量PCR結果顯示:相較于單細胞組(CSC組)與共培養(yǎng)組(CSC+ BMSC),心復康組(CSC+BMSC+XFK)中CSC的GATA4和Cx43 mRNA表達明顯增加,差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05),見圖3。

        4 討論

        GATA結合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)是心肌細胞內含量豐富的組織特異性轉錄因子,其在心臟早期發(fā)育過程中起著至關重要的作用,尤其對于調控編碼心肌特異性蛋白的諸多基因[8]。研究表明GATA4可誘導干細胞分化為心肌細胞,且GATA4是心肌祖細胞的最早期信號[9],在心臟發(fā)育早期的中胚層就有所表達[10]。典型的心肌轉錄因子GATA4,在心肌細胞的發(fā)育成熟期,對于調節(jié)細胞系分化的核轉錄過程發(fā)揮重要作用[11]。

        在各類動物組織中,相鄰細胞的接觸區(qū)域存在廣泛的間隙連接,其由多個蛋白組成,它們共同構成細胞間隙連接通訊通道。在胚胎發(fā)育過程中,通過間隙連接的組織間信號傳播有助于細胞的遷移和分化[12],間隙連接在建立心肌細胞間電化學通訊中起到至關重要的作用[13],在心臟發(fā)育過程中,3種主要的心臟間隙連接Cx(connexin)基因Cx40、Cx43或Cx45的不足易導致嚴重的心臟畸形[14,15]。Cx43在心肌細胞分化過程中是作為工作心肌的主要間隙連接蛋白,直接牽涉到心肌細胞信號的轉移[16]。

        某些中藥復方制劑能有效誘導干細胞增殖、分化,并具有毒副作用小的優(yōu)勢[17]。心復康源于中醫(yī)名家阮士怡之手,是基于中醫(yī)理論所設。心肌梗死分屬于中醫(yī)學“胸痹”、“真心痛”等范疇。中醫(yī)學認為該病病位在心,與脾(胃)、腎、肝(膽)等多臟腑相關,呈現(xiàn)本虛標實的病理特征[18]。本虛又以氣虛為主,標實以血瘀最為突出,因此益氣活血法成為治療心梗的重要治法[19]。西洋參和白術具有益氣的功效,枸杞子和女貞子具有補益肝腎的功效,鹿銜草和降香具有活血止血之功效,昆布有軟堅散結、消痰和利水的功效。該復方在臨床應用普遍,對于氣滯血瘀型胸痹效果較好,尤其在改善患者胸悶憋氣癥狀,提高心功能方面有獨到療效。

        圖2 高效液相色譜圖Fig.2 The figure of high performance liquid chromatography

        圖3 各組CSC的GATA4與Cx43 mRNA相對表達量Fig.3 The GATA4 and Cx43 mRNA expression of CSC in each group

        本研究顯示心復康協(xié)同骨髓間充質干細胞可以上調心臟干細胞的GATA4和Cx43 mRNA的表達,提示兩者具有促進心臟干細胞向心肌樣細胞分化的潛能,為臨床通過藥物干預,提高干細胞移植效果提供了實驗依據(jù)。

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        (本文編輯:馬英,張震之)

        The synergy between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells increases the expression of GATA4 and Cx43 in cardiac stem cells

        WANG Yi-jing1,SUO Yan-rong1,ZENG Wen-yun1,KAN Bo-hong2,JIANG Xi-juan1,F(xiàn)AN Ying-chang1
        (1.Tianjin University of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China;2.The First Affiliated Hospital of Traditional Chinese Medicine,Tianjin 300193,China)

        [Objective]To observe the synergy effects between Xinfukang and Bone marrow mesenchymal stem cells(BMSC)in the expression of GATA4 and Cx43 in Cardiac stem cells(CSC).[Methods]BMSC were obtaining by the whole bone marrow adherent method,and the purity was evaluated by flow cytometry.Xinfukang convalescent serum were analyzed through high performance liquid chromatography(HPLC),and then used for cell co-culture system.Real-time quantitative PCR were used to detect the expression of GATA4 and Cx43 in groups of CSC.[Results]GATA4 and Cx43 in the Xinfukang group were increased significantly(P<0.05).[Conclusion]Xinfukang collaborative with BMSC can increase the expression of GATA4 and Cx43in CSC.

        Xinfukang;bone marrow mesenchymal stem cell;cardiac stem cell;GATA4;Cx43

        R285.5

        A

        1672-1519(2015)05-0291-04

        10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.10

        國家自然科學基金項目(81173413)。

        王一婧(1986-),女,博士研究生,主要從事中醫(yī)藥干預心腦血管疾病的研究。

        范英昌,E-mail:fych@tjutcm.edu.cn。

        (2014-12-18)

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