楊　璇，王　妍，王寶華，史新元，魯　冰，邵　露，李　萍，楊貝貝（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京100102）

甘草酸對(duì)葛根素增溶作用的實(shí)驗(yàn)研究*

楊璇，王妍，王寶華，史新元，魯冰，邵露，李萍，楊貝貝
（北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院北京100102）

［目的］通過(guò)測(cè)定葛根、甘草單煎液和其不同配伍比例的合煎液中葛根素和甘草酸的含量及表面張力，計(jì)算甘草酸的臨界膠束濃度，探討甘草酸對(duì)葛根素增溶作用的機(jī)制。［方法］采用HPLC測(cè)定葛根素和甘草酸的含量，采用Wilhelmy吊片法測(cè)定溶液的表面張力。［結(jié)果］當(dāng)葛根和甘草的比例為5∶3時(shí)，葛根素的溶出度最大，此時(shí)甘草酸的臨界膠束濃度是0.18 g/L，臨界膠束濃度與加入藥物的結(jié)構(gòu)和溶液的pH值有關(guān)。［結(jié)論］甘草酸具有表面活性，達(dá)到臨界膠束濃度可以增加葛根素的溶解度。

甘草酸；葛根素；增溶；高效液相色譜法；表面張力；pH值

中藥有效成分的溶解度問(wèn)題是影響藥材能否有效吸收的關(guān)鍵，中藥材中有些藥理活性很強(qiáng)的成分因溶解性較差而限制了其在制劑和臨床上的使用，因此提高難溶性藥物的溶解度在制劑工藝中有著重要意義［1］。中藥復(fù)方配伍增溶緊密結(jié)合中醫(yī)藥理論，利用中藥自身所含成分具有的增溶作用，使與之配伍的中藥中的難溶性成分的溶解度增加［2-3］。葛根素是葛根的主要有效成分，屬于黃酮類，在水中的溶解性較差。甘草中的甘草酸為三萜皂苷，具有表面活性劑的性質(zhì)［4］。筆者通過(guò)調(diào)整甘草與葛根不同比例配伍，采用HPLC方法測(cè)定甘草酸和葛根素的含量，采用Wilhelmy吊片法測(cè)定不同樣品溶液的表面張力，分析了甘草酸的臨界膠束濃度和表面張力，從而探討了甘草酸對(duì)葛根素增溶作用的影響［5］。

1　儀器與試藥

LC-20AT高效液相色譜儀（日本島津公司），JK99B型全自動(dòng)界面張力儀（上海中晨數(shù)字技術(shù)設(shè)備有限公司）。

葛根素對(duì)照品（批號(hào)110752-200912），甘草酸銨對(duì)照品（批號(hào)110731-201116），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。藥材飲片葛根、炙甘草，購(gòu)自北京同仁堂藥店。乙腈、甲醇為色譜純，水為娃哈哈純凈水，其他試劑均為分析純。

2　方法與結(jié)果

2.1色譜條件色譜柱：大連依利特Hypersil BDS C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）。葛根素：流動(dòng)相：甲醇-0.05%磷酸（20:80），流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：250 nm。甘草酸：流動(dòng)相：乙腈（A）-0.05%磷酸溶液（B），梯度洗脫條件：19%A（0～8 min），19%A→50%A（8～35 min），50%A→100%（35～36 min），100%→19%A［0（］36～50 min），流速：1.0 mL/min，柱溫：25℃，檢測(cè)波長(zhǎng)240 nm。

2.2對(duì)照品溶液制備精密稱取葛根素對(duì)照品2 mg、甘草酸銨對(duì)照品7.44 mg，分別置10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容，搖勻，作為對(duì)照品溶液。

2.3線性關(guān)系考察將葛根素對(duì)照品溶液用甲醇稀釋制備成以下濃度：2、1.5、1、0.5、0.2、0.1、0.02 g/L，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得到葛根素的回歸方程為= 4 504 063X+203，線性相關(guān)系數(shù)r=1.000 0。結(jié)果表明，葛根素在0.2～20μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

將甘草酸銨對(duì)照品溶液用甲醇制備成以下濃度：0.000 372、0.074、0.223 2、0.372、0.595 2、0.669 6、0.744 g/L，分別精密吸取上述對(duì)照品溶液各10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定。以對(duì)照品進(jìn)樣量X為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，得到甘草酸銨的回歸方程為=579 688X+110，線性相關(guān)系數(shù)r=0.999 9。結(jié)果表明，甘草酸銨在0.004～7.44 μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系。

2.4精密度考察將精密吸取葛根素對(duì)照品溶液10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，測(cè)得峰面積均值為11 019 561，RSD為0.31%。將甘草酸銨對(duì)照品溶液精密吸取10 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)定峰面積，測(cè)得峰面積均值為461 152，RSD為1.05%，結(jié)果表明儀器精密度良好。

2.5重現(xiàn)性考察精密稱取同一批次的葛根塊6份，分別制成供試品溶液，測(cè)定峰面積值，經(jīng)計(jì)算得水提液中葛根素含量。結(jié)果表明，葛根水提液中葛根素的平均含量為1.125%，RSD為0.54%。精密稱取同一批次的炙甘草6份，分別制成供試品溶液，測(cè)定峰面積值，經(jīng)計(jì)算得水提液中甘草酸含量。結(jié)果表明，甘草水提液中甘草酸的平均含量為0.476%，RSD為0.81%，結(jié)果表明該方法重現(xiàn)性良好。

2.6穩(wěn)定性考察精密吸取同一葛根素供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h后進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)定峰面積值，平均峰面積為64 264 916，RSD為0.94%，表明葛根素供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。精密吸取同一甘草酸供試品溶液，分別于制備后0、2、4、6、8、10、12 h后進(jìn)樣，每次10 μL，測(cè)定峰面積值，平均峰面積為4 483 506，RSD為1.66%，表明甘草酸供試品溶液在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7加樣回收率考察取同一批葛根塊粉末共6份，稱定質(zhì)量，分別加入葛根素對(duì)照品，制成供試品溶液，測(cè)定峰面積值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，平均加樣回收率為102.18%，RSD為1.59%，加樣回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。取同一批炙甘草粉末共6份，稱定質(zhì)量，分別加入甘草酸對(duì)照品，分別制成供試品溶液，測(cè)定峰面積值，計(jì)算加樣回收率。結(jié)果表明，平均加樣回收率為101.44%，RSD為1.85%，加樣回收率符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.8葛根、甘草配伍提取液的制備

2.8.1葛根甘草合煎液取5 g葛根塊，分別加入1、2、3、5、8 g炙甘草，加入10倍量的水，加熱回流2次，每次2 h，過(guò)濾，分別測(cè)出葛根甘草一煎液和二煎液的體積。

2.8.2葛根單煎液取5 g葛根塊，加10倍量的水，加熱回流2次，每次2 h，過(guò)濾，分別測(cè)出葛根一煎液和二煎液的體積。

2.8.3甘草單煎液取2 g炙甘草，加10倍量的水，加熱回流2次，每次2 h，過(guò)濾，分別測(cè)出甘草一煎液和二煎液的體積。

2.9葛根素的含量測(cè)定精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

結(jié)果表明，相比二煎而言，一煎的濃度較大，溶液中指標(biāo)性成分的含量較高，從一煎的指標(biāo)性成分的濃度變化來(lái)研究甘草皂苷的臨界膠束濃度更為合理。結(jié)合葛根甘草的各個(gè)配比以及葛根單煎的濃度，發(fā)現(xiàn)當(dāng)葛根甘草的比例為5∶3時(shí)，5 g葛根中一煎提取液葛根素量為59.294 6 mg，說(shuō)明葛根甘草的比例為5:3時(shí)，葛根素的提取率最高。

2.10葛根溶出度和甘草酸濃度之間關(guān)系采用高效液相色譜測(cè)定供試品溶液中甘草酸的濃度，結(jié)果見(jiàn)表2。

表1　不同配比中葛根素的含量Tab.1　The content of puerarin in different proportions

表2　不同配比中甘草酸的濃度Tab.2　The concentrations of glycyrrhizic acid in different proportions

以一煎中甘草酸的濃度為橫坐標(biāo)，葛根素的溶出量為縱坐標(biāo)，找出葛根素溶出量和甘草酸濃度之間的關(guān)系，見(jiàn)圖1。

結(jié)果表明，甘草酸的濃度在0.18 g/L之前，隨著甘草酸濃度的增大，葛根素的溶出量逐漸增大，當(dāng)甘草酸的濃度達(dá)到0.18 g/L后，葛根素的溶出量不再增加。

2.11甘草和葛根配伍表面張力的測(cè)定采用Wilhelmy吊片法測(cè)定各供試品溶液的表面張力，以一煎中甘草酸濃度為橫坐標(biāo)，表面張力為縱坐標(biāo)，繪制表面張力-甘草酸濃度曲線，見(jiàn)圖2，計(jì)算臨界膠束濃度及相關(guān)參數(shù)值。

圖1　葛根素溶出量和甘草酸濃度關(guān)系Fig.1　The relation of dissolution quantity of puerarin and the concentration of glycyrrhizic acid

圖2　不同配比中甘草酸的濃度和表面張力Fig.2　The concentration and surface tension of glycyrrhizic acid in different proportions

結(jié)果表明，當(dāng)甘草和葛根配伍時(shí)，隨著甘草酸濃度的增加，溶液的表面張力逐漸下降并出現(xiàn)一個(gè)拐點(diǎn)后保持不變，對(duì)拐點(diǎn)處做兩條切線，相交切線的交點(diǎn)對(duì)應(yīng)的甘草酸濃度就是此體系中甘草酸的臨界膠束濃度，切線的交點(diǎn)在0.18 g/L左右，說(shuō)明此濃度是甘草和葛根配伍體系中甘草酸的臨界膠束濃度，此結(jié)果與2.1的結(jié)果相呼應(yīng)。甘草中的甘草酸具有表面活性劑的作用，當(dāng)甘草酸達(dá)到最佳臨界膠束濃度時(shí)形成膠束，使難溶性的葛根素在水溶液中的溶解度達(dá)到最大，所以0.18 g/L是甘草和葛根配伍中甘草酸最佳的臨界膠束濃度。課題組其他人員通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬出的甘草酸臨界膠束濃度為0.2 g/L，可以看出因?yàn)楦鸶氐拇嬖谑垢什菟岬呐R界膠束濃度發(fā)生了偏移，但是差距不大，所以甘草酸臨界膠束濃度與加入的藥物結(jié)構(gòu)有關(guān)。

2.12pH對(duì)甘草和葛根最佳配伍增溶的影響

2.12.1供試品溶液的制備取5 g葛根塊、3 g炙甘草，分別加入10倍量的pH為2、3、4、6、7、8的磷酸氫二鈉緩沖鹽溶液，加熱回流2 h，過(guò)濾，即得。

2.12.2樣品中甘草酸濃度和葛根素含量測(cè)定精密吸取各供試品溶液10 μL，注入高效液相色譜儀測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3。

表3　不同pH下測(cè)得的甘草酸濃度和葛根素含量Tab.3　The concentration of glycyrrhizic acid and the contents of puerarin in different pH

以pH為橫坐標(biāo)，葛根素溶出量為縱坐標(biāo)，繪制pH-葛根素溶出量曲線，見(jiàn)圖3。

圖3　不同pH下葛根素的溶出量Fig.3　The dissolution quantity of puerarin in different pH

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，隨著pH的增加測(cè)得的甘草酸的濃度逐漸增大。隨著pH的增加甘草酸以鹽的形式存在的趨勢(shì)增加，通過(guò)HPLC測(cè)定的甘草酸的量包括兩個(gè)部分，一部分是甘草酸，另外一部分是甘草酸的鹽，當(dāng)pH＞5時(shí)，雖然測(cè)得的甘草酸的濃度在增加，但是葛根素的溶出度下降，說(shuō)明甘草酸形成了鹽類，降低了它形成膠束的能力。當(dāng)pH=3時(shí)，葛根素的溶出度最大，說(shuō)明此時(shí)甘草酸通過(guò)產(chǎn)生膠束，將葛根素包裹于膠束內(nèi)，增加了葛根素的溶出度。當(dāng)pH＜3時(shí)，甘草酸的濃度較低，形成膠束的能力降低，故增溶能力弱。

3　討論

甘草性味甘平，通行十二經(jīng)，和中益氣、緩急、通利血脈，在中藥復(fù)方中應(yīng)用廣泛［6］，所含的皂苷類成分具有顯著地增溶作用［7-8］。有研究證明，甘草酸對(duì)板藍(lán)根沖劑、青黛、茯苓酸有增溶作用［9-11］。葛根，味辛甘性涼，解肌退熱、升陽(yáng)止瀉、發(fā)表透疹、生津止渴［12］。葛根素為葛根的主要有效成分，常用于治療糖尿病、高脂血癥、心腦血管疾病等［13-14］。葛根素水溶性和脂溶性都很差，直接影響其體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程和生物利用度。有報(bào)道顯示，石膏配伍葛根有利于葛根素的煎出，一定濃度的Labrasol可顯著提高葛根素的角膜透過(guò)率，且對(duì)角膜無(wú)刺激性［15-16］。

實(shí)驗(yàn)對(duì)葛根甘草不同配比及單煎溶液中指標(biāo)性成分含量及表面張力的測(cè)定，結(jié)果顯示0.18 g/L是甘草和葛根配伍中甘草酸最佳的臨界膠束濃度，此時(shí)甘草皂苷形成膠束，使難溶性的葛根素溶解度達(dá)到最大，同時(shí)也印證了課題組其他人員計(jì)算機(jī)模擬所得結(jié)果。

葛根素的存在使甘草酸的臨界膠束濃度發(fā)生了偏移，但是差距不大，所以甘草酸臨界膠濃度與加入的藥物結(jié)構(gòu)有關(guān)。溶液pH對(duì)甘草酸臨界膠束濃度也有一定的影響：當(dāng)pH=3時(shí)，葛根素的溶出度最大，說(shuō)明此時(shí)甘草酸通過(guò)產(chǎn)生膠束將葛根素包裹于膠束內(nèi)，增加了葛根素的溶出度。pH的升高使甘草酸以鹽的形式存在的趨勢(shì)增加，當(dāng)pH＞5時(shí)，雖然HPLC測(cè)得的甘草酸的濃度在增加，但是葛根素的溶出度下降，說(shuō)明甘草酸形成了鹽類，降低了它形成膠束的能力。

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（本文編輯：高杉，張震之）

Research of the solubilization of glycyrrhizic acid to puerarin

YANG Xuan，WANG Yan，WANG Bao-hua，SHI Xin-yuan，LU Bing，SHAO Lu，LI Ping，YANG Bei-bei
（School of Chinese Pharmacy，Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100102，China）

［Objective］To calculate the critical micelle concentration of glycyrrhizic acid and explore the solubilizing mechanism of glycyrrhizic acid to puerarin，by measuring the amount of puerarin and glycyrrhizic acid and the surface tension of solution in single decoction of pueraria and glycyrrhiza and their mixed decoction of different proportions.［Methods］The HPLC procedure was performed for measuring the amount of puerarin and glycyrrhizic acid，and the surface tension of solution was measured by Wilhelmy plate method.［Results］When the ratio of pueraria and glycyrrhiza was 5:3，the dissolution of puerarin reached maximum，and the critical micelle concentration of glycyrrhizic acid was 0.18 g/L，which was affected by the structure of drug and the pH value of solution.［Conclusion］Glycyrrhizic acid has surface activity，and it can increase the solubility of puerarin when its concentration reaches the critical micelle concentration.

glycyrrhizic acid；puerarin；solubilization；HPLC；surface tension；pH value

R284.1

A

1672-1519（2015）05-0304-04

10.11656/j.issn.1672-1519.2015.05.13

國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81073058）；北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥復(fù)方制藥研究創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目。

楊璇（1985-），女，碩士，主要從事中藥制藥學(xué)研究。

王寶華，E-mail：wbaohua1@163.com。

（2014-11-21）