羅琦，尹潔，李楊，黃珊，王璽，何景華△

人臍帶血造血干細(xì)胞體外分化為NK細(xì)胞的效率及功能檢測

羅琦1，尹潔2，李楊2，黃珊2，王璽2，何景華1△

目的檢測人臍帶血造血干細(xì)胞（HSCs）體外分化為自然殺傷（NK）細(xì)胞的效率及功能。方法從人臍帶血中分離CD34+HSCs，接種于含20 μg/L FMS樣酪氨酸激酶3配體（Flt3L）、干細(xì)胞生長因子（SCF）、白細(xì)胞介素（IL）-7、IL-15及IL-21的SCGM培養(yǎng)基中，定向誘導(dǎo)CD34+HSCs分化為NK細(xì)胞。觀察細(xì)胞生長狀態(tài)，在分化的第7、14、21及28天，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測各階段CD56、NKG2D、NKp46、CD3、CD19及CD34等細(xì)胞免疫表型的表達(dá)變化；分化的第21、28天，以分化得到細(xì)胞為效應(yīng)細(xì)胞，K562細(xì)胞作為靶細(xì)胞，設(shè)置8∶1、4∶1、2∶1和1∶1 4組效靶細(xì)胞比，分別采用乳酸脫氫酶（LDH）細(xì)胞毒性檢測法和7AAD/CFSE標(biāo)記法，檢測分化得到的細(xì)胞殺傷功能。結(jié)果臍帶血來源的CD34+HSCs在體外適宜的條件下可大量增殖；整個分化進(jìn)程的不同階段中，CD3和CD19表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義，CD56、NKG2D及NKp46的表達(dá)量逐漸增加，最高達(dá)（72.57±1.60）%、（32.83±1.29）%和（29.53± 2.40）%，CD34的表達(dá)量逐漸降低，最低為（12.13±2.01）%。LDH毒性檢測法和7AAD/CFSE標(biāo)記法測得最大殺傷效率可達(dá)（49.91±2.76）%和（40.87±1.12）%，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細(xì)胞殺傷能力均依次降低（P＜0.05），誘導(dǎo)分化28 d的NK細(xì)胞殺傷能力與21 d差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論人臍帶血HSCs在體外適宜的培養(yǎng)條件下，可定向分化為NK細(xì)胞，誘導(dǎo)分化得到的NK細(xì)胞具有殺傷功能。

胎血；造血干細(xì)胞；殺傷細(xì)胞，天然；免疫表型分型；細(xì)胞毒性試驗，免疫；CD34+HSCs；體外分化；細(xì)胞殺傷

臍帶血（UCB）中富含造血干細(xì)胞（HSCs），是除骨髓和外周血之外的第3種HSCs的重要來源［1］。在適宜的條件下，HSCs可以在體內(nèi)和體外分化為自然殺傷（NK）細(xì)胞［2］。隨著細(xì)胞免疫治療的興起，NK細(xì)胞越來越為人們所重視。由于人體自身NK細(xì)胞數(shù)量有限，而且在NK細(xì)胞不同發(fā)育階段，甚至同一發(fā)育階段的不同組織中，NK細(xì)胞的表型和功能都存在很大的差異，這些都嚴(yán)重限制了NK細(xì)胞在臨床上大規(guī)模運用［3-4］。本研究利用從臍帶血中富集到的CD34+HSCs進(jìn)行體外培養(yǎng)，加入相應(yīng)細(xì)胞因子誘導(dǎo)其分化為NK細(xì)胞，并對誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞免疫表型及殺傷功能進(jìn)行檢測，為研究不同發(fā)育階段的NK細(xì)胞的相應(yīng)功能及其臨床應(yīng)用提供實驗參考。

1　材料與方法

1.1材料新鮮人臍帶血取自天津市中心婦產(chǎn)科醫(yī)院；人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562為天津市血液學(xué)研究所饋贈；羥乙基淀粉（HES）、人淋巴細(xì)胞分離液（Ficoll）均購自天津市灝洋生物制品科技有限責(zé)任公司；EDTA購自美國Amresco公司；Human CD34 Microbead Kit購自德國美天旎公司；細(xì)胞因子Human FMS樣酪氨酸激酶3配體（Flt-3L）、Human干細(xì)胞生長因子（SCF）、Human白細(xì)胞介素（IL）-7、Human IL-15 及Human IL-21均購自于美國Pepro Tech公司；Cell Gro?GMP SCGM培養(yǎng)基購自德國Cell Genix公司；RPMI-1640培養(yǎng)基、DMEM培養(yǎng)基、青霉素-鏈霉素溶液（PS）及HEPES溶液均購自美國Hyclone公司；胎牛血清（FBS）、非必需氨基酸（MEM NEAA）、丙酮酸鈉（Sodium pyrovate）、β-巰基乙醇（2-Mercaptoethanol）及慶大霉素（Gentamicin）均購自美國Gibco公司；乳酸脫氫酶（LDH）Cytotoxicity Assay Kit購自美國Promega公司；7-AAD/CFSE Cell-Mediated CytotoxicityAssay Kit購自美國Abcam公司；熒光標(biāo)記抗體FITC-CD56、FITCNKp46、PE-NKG2D、Percp-Cy5.5-CD3、Percp-Cy5.5-CD19、APC-CD34均購自美國BioLegend公司；PBS緩沖液（pH 7.4，137 mmol/L NaCl，2.7 mmol/L KCl，10 mmol/L Na2HPO4，2 mmol/L KH2PO4）；CO2恒溫培養(yǎng)箱、Multiskan GO酶標(biāo)儀（美國Thermo公司）；Accuri C6流式細(xì)胞儀（美國BD公司）。

1.2方法

1.2.1K562細(xì)胞培養(yǎng)將人慢性骨髓性白血病細(xì)胞K562置于RPMI-1640培養(yǎng)基中（含有10%FBS及1%PS溶液），置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每隔2～3 d進(jìn)行換液。

1.2.2CD34+HSCs分離將新鮮人臍帶血80 mL置于無菌血漿瓶中，按臍帶血∶HES=5∶1的比例加入HES，充分混勻，室溫靜置40 min以沉降紅細(xì)胞；離心管中預(yù)置15 mL Ficoll，緩慢加入2倍體積沉降紅細(xì)胞后的臍帶血，20℃，2 000 r/ min，離心20 min（升5降3）；移液管輕輕吸取單個核細(xì)胞層，置于PBS緩沖液（含2 mmol/L EDTA）中，洗滌細(xì)胞2次；計數(shù)后，按Miltenyi Human CD34 Microbead Kit說明書，從單個核細(xì)胞中富集CD34+HSCs。

1.2.3體外定向誘導(dǎo)CD34+HSCs分化為NK細(xì)胞從臍帶血中富集到CD34+HSCs共計4.0×105，接種于含SCGM（含有20%FBS、1%MEM NEAA、1 mmol/L Sodium Pyrovate、10 mmol/ L HEPES，1%Mercaptoethanol、25 mg/L Gentamicin及1%PS）培養(yǎng)基的24孔板中，同時加入濃度均為20 μg/L的Flt3L、SCF、IL-7、IL-15及IL-21等細(xì)胞因子，定向誘導(dǎo)CD34+HSCs進(jìn)行體外分化，置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。在細(xì)胞培養(yǎng)的1～7 d，每隔3 d對細(xì)胞進(jìn)行半換液；7 d后，將所有細(xì)胞接種于6孔板中，每隔3 d對細(xì)胞進(jìn)行換液。

1.2.4誘導(dǎo)分化細(xì)胞形態(tài)學(xué)和細(xì)胞生長曲線誘導(dǎo)分化的第7、14、21及28天，分別于倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)；同時進(jìn)行計數(shù)，計算均值，繪制生長曲線。

1.2.5誘導(dǎo)分化細(xì)胞免疫表型檢測誘導(dǎo)分化的第7、14、21 及28天，分別對細(xì)胞進(jìn)行免疫表型檢測。細(xì)胞吹勻計數(shù)后，取1.0×106個細(xì)胞于含有500 μL DMEM培養(yǎng)基的流式管中，加入適量Fc受體阻斷劑，混勻后，4℃避光，封閉30 min；后加入適量待檢測的熒光標(biāo)記的細(xì)胞表面分子特異性抗體，或熒光標(biāo)記的同型對照抗體，4℃避光，染色30 min；加入1 mL DMEM培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1遍，再加入500 μL DMEM培養(yǎng)基重懸；用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CFlow Plus軟件獲取數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析，表達(dá)率≥20%為陽性。

1.2.6LDH細(xì)胞毒性檢測法檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞的殺傷功能誘導(dǎo)分化的第21天和第28天，對得到的NK細(xì)胞進(jìn)行殺傷功能檢測。以K562作為靶細(xì)胞，濃度調(diào)整為2.0×105/ mL，按50 μL/孔接種于96孔板；以NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，濃度調(diào)整為3.2×106/mL，取1.6×105/50 μL細(xì)胞懸液進(jìn)行倍比稀釋，每組效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目為0.8×105/50 μL、0.4×105/50 μL、0.2×105/50 μL和0.1×105/50 μL，按50 μL/孔接種于96孔板，最終效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為8∶1、4∶1、2∶1和1∶1。將該96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；250×g，離心4 min，取50 μL上清液按Promega LDH Cytotoxicity Assay Kit說明書進(jìn)行LDH測定。

1.2.7熒光染料（7AAD/CFSE）標(biāo)記法檢測誘導(dǎo)分化細(xì)胞殺傷功能在體外分化的第21天和第28天，對得到的NK細(xì)胞進(jìn)行殺傷功能檢測。以K562作為靶細(xì)胞，濃度調(diào)整為2.0×106/ mL，按50 μL/孔接種于96孔板，用綠色熒光染料CFSE對靶細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記，4℃避光，染色30 min；加入NK細(xì)胞作為效應(yīng)細(xì)胞，每組效應(yīng)細(xì)胞數(shù)目為0.8×106/50 μL、0.4×106/50 μL、0.2× 106/50 μL和0.1×106/50 μL，最終效應(yīng)細(xì)胞與靶細(xì)胞的比例分別為8∶1、4∶1、2∶1和1∶1，將該96孔板置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h；用紅色熒光染料7AAD標(biāo)記已死的效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞，4℃避光，染色30 min；用BD Accuri C6流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測，CFlow Plus軟件獲取分析數(shù)據(jù)并進(jìn)行分析。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。符合正態(tài)分布的計量數(shù)據(jù)用±s表示，2組間均數(shù)比較用t檢驗，多組間均數(shù)比較采用方差分析，組間多重比較采用SNK-q法，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞形態(tài)學(xué)及生長特點分化第1周，細(xì)胞呈懸浮狀均勻分布于培養(yǎng)基中，胞漿豐富，核仁明顯；分化第2、3周，細(xì)胞迅速增殖，部分細(xì)胞呈抱團(tuán)狀；分化第4周，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞體積增大，細(xì)胞內(nèi)顆粒增加，有少部分細(xì)胞開始呈現(xiàn)貼壁狀，見圖1。整個體外分化進(jìn)程中，起始細(xì)胞數(shù)為4.0×105，分化第1周，細(xì)胞數(shù)增加到7.68×105；分化第2周，細(xì)胞開始大量增殖，細(xì)胞數(shù)明顯增多達(dá)4.48×106；分化第3周，細(xì)胞保持良好的增殖能力，細(xì)胞數(shù)達(dá)8.4×106；分化第4周，細(xì)胞生長緩慢，細(xì)胞數(shù)目維持在穩(wěn)定狀態(tài)，最終細(xì)胞數(shù)為8.96×106，整個進(jìn)程中細(xì)胞倍增時間約為24 h，見圖2、3。

Fig.2　The growth curve of induced differentiation of NK cells圖2 誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞生長曲線

Fig.3　The amplification of induced differentiation of NK cells圖3　誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞擴(kuò)增倍數(shù)

2.2誘導(dǎo)分化NK細(xì)胞免疫表型誘導(dǎo)分化的前2周，大部分細(xì)胞還處于干細(xì)胞狀態(tài)，CD34表達(dá)量相對較高，部分細(xì)胞開始表達(dá)CD56，而NKG2D和NKp46表達(dá)量較低；誘導(dǎo)分化的后2周，CD34表達(dá)量逐漸降低，絕大部分細(xì)胞表達(dá)CD56，NKG2D和NKp46的表達(dá)量也隨之增加，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；整個分化進(jìn)程中，CD3和CD19表達(dá)量無明顯變化（P＞0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of immune phenotypes of NK cells between different differentiation stages表1　誘導(dǎo)分化不同階段的NK細(xì)胞免疫表型比較（n=8，%，±s）

Tab.1　Comparison of immune phenotypes of NK cells between different differentiation stages表1　誘導(dǎo)分化不同階段的NK細(xì)胞免疫表型比較（n=8，%，±s）

＊P＜0.05；a與（1）比較，b與（2）比較，c與（3）比較，P＜0.05；表2、3同

誘導(dǎo)分化時間7 d（1）14 d（2）21 d（3）28 d（4）F誘導(dǎo)分化時間7 d（1）14 d（2）21 d（3）28 d（4）F CD56 23.90±1.81 37.37±1.86a63.13±2.64ab72.57±1.60abc3.74＊CD3 2.67±1.22 2.83±1.45 3.37±1.79 3.47±1.89 0.18 NKG2D 3.17±1.20 10.77±1.20a26.80±1.39ab32.83±1.29abc3.51＊CD19 2.10±1.57 2.33±1.46 2.50±1.32 3.33±1.89 0.34 NKp46 3.67±1.97 11.70±1.13a21.57±2.12ab29.53±2.40abc3.98＊CD34 60.67±2.25 29.43±3.16a20.53±2.28ab12.13±2.01abc3.21＊

2.3LDH細(xì)胞毒性法檢測誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞殺傷能力同一效靶細(xì)胞比例，誘導(dǎo)分化28 d的NK細(xì)胞的殺傷能力與誘導(dǎo)分化21 d差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同一誘導(dǎo)分化時間，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細(xì)胞殺傷能力均依次降低（均P＜0.05），見表2。

Tab.2　Comparison of killing activity of NK cells detected by LDH method between at 21-d group and 28-d group表2　LDH細(xì)胞毒性法檢測誘導(dǎo)分化21 d和28 d的NK細(xì)胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

Tab.2　Comparison of killing activity of NK cells detected by LDH method between at 21-d group and 28-d group表2　LDH細(xì)胞毒性法檢測誘導(dǎo)分化21 d和28 d的NK細(xì)胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

組別8∶1（1）4∶1（2）2∶1（3）1∶1（4）F 21 d 45.17±2.29 23.91±3.33a15.35±3.56ab10.18±3.73abc2.66＊28 d 49.91±2.76 27.99±2.32a19.17±2.82ab13.84±3.43abc3.25＊t2 .291.741.451.25

2.47AAD/CFSE標(biāo)記法誘導(dǎo)分化的NK細(xì)胞殺傷能力同一效靶細(xì)胞比例，誘導(dǎo)分化28 d的NK細(xì)胞的殺傷能力與誘導(dǎo)分化21 d差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。同一誘導(dǎo)分化時間，8∶1、4∶1、2∶1和1∶1組NK細(xì)胞殺傷能力均依次降低（均P＜0.05），見表3。

Tab.3　Comparison of killing activity of NK cells detected by 7AAD/CFSE between 21-d group and 28-d group表3　7AAD/CFSE標(biāo)記法檢測誘導(dǎo)分化21 d和28 d的NK細(xì)胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

Tab.3　Comparison of killing activity of NK cells detected by 7AAD/CFSE between 21-d group and 28-d group表3　7AAD/CFSE標(biāo)記法檢測誘導(dǎo)分化21 d和28 d的NK細(xì)胞殺傷能力比較?。╪=8，%，±s）

組別8∶1（1）4∶1（2）2∶1（3）1∶1（4）F 21 d 31.30±1.11 22.93±1.17a13.97±1.59ab8.53±1.60abc8.76＊28 d 40.87±1.12 28.57±1.46a16.47±0.81ab9.47±0.74abc3.81＊t 1.05 1.73 1.42 2.17

3　討論

臍帶血中富含CD34+HSCs，來源廣泛，操作方便，易在體外培養(yǎng)和擴(kuò)增［5］。Mantri等［6］研究顯示，從臍帶血中富集的CD34+HSCs在添加SCF和Flt3L的培養(yǎng)基中可以大量擴(kuò)增，并維持低分化的狀態(tài)。本研究結(jié)果顯示，從臍帶血富集的CD34+HSCs，體外培養(yǎng)過程中顯示出很強的增殖能力，從生長曲線中可知其倍增時間約為24 h。在相應(yīng)細(xì)胞因子的刺激下，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生變化，由懸浮狀態(tài)變?yōu)橘N壁狀態(tài)。提示本研究所獲取的CD34+HSCs可以在體外大量擴(kuò)增并進(jìn)行分化，為其臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

既往研究發(fā)現(xiàn)CD34+HSCs可以在體內(nèi)和體外分化為NK細(xì)胞［7］。Cany等［8］通過體內(nèi)實驗觀察到，CD34+HSCs可以在淋巴細(xì)胞缺陷的 NOD/SCID/ IL2Rg（null）小鼠體內(nèi)分化為NK細(xì)胞，并具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力。Montaldo等［9］研究顯示，在添加SCF、Flt3L和IL-15等細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中，CD34+HSCs可以分化為NK細(xì)胞，通過體內(nèi)和體外殺傷實驗證明了分化得到的NK細(xì)胞具有殺死腫瘤細(xì)胞的能力。這些研究為NK細(xì)胞應(yīng)用于臨床提供了依據(jù)。

本研究顯示，臍帶血來源的CD34+HSCs在體外可以定向分化為NK細(xì)胞，在含有20 μg/L的Flt3L、SCF、IL-7、IL-15和IL-21細(xì)胞因子的培養(yǎng)基中，細(xì)胞大量增殖，細(xì)胞數(shù)由起始的4.0×105擴(kuò)增到8.96× 106；細(xì)胞增殖的同時進(jìn)行分化，大部分細(xì)胞表達(dá)NK細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD56、NKG2D以及NKp46。分化進(jìn)程中，T細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD3以及B細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD19的表達(dá)量無明顯上升，而NK細(xì)胞表面標(biāo)志性抗原CD56隨著分化進(jìn)程延長，表達(dá)量持續(xù)升高，同擴(kuò)增初期相比，其表達(dá)量增加了3倍。提示本研究所采取的體外分化方法可以使CD34+HSCs只分化為NK細(xì)胞，而不會分化為T或B細(xì)胞。作為與NK殺傷功能需密切相關(guān)的表面抗原NKG2D和NKP46，在分化后期也開始大量表達(dá)，LDH細(xì)胞毒性檢測法和7AAD/CFSE標(biāo)記法結(jié)果均顯示，分化得到的NK細(xì)胞具有殺傷功能，且殺傷能力隨效靶比增加而增加。提示本研究利用CD34+HSCs分化得到的NK細(xì)胞具有殺傷腫瘤細(xì)胞能力。

Vacca等［10］研究發(fā)現(xiàn)CD34+HSCs與基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)可以得到更高比例的NK細(xì)胞，且分化進(jìn)程相對縮短。本研究得到的NK細(xì)胞雖然具有一定的殺傷能力，但殺傷效率偏低。Dungan等［11］研究顯示，內(nèi)源性干擾素（IFN）-γ可提高NK細(xì)胞的殺傷能力。Konievic等［12］通過體外實驗證明，添加外源性IFN-γ后，細(xì)胞增殖和殺傷能力均增加。因此，NK細(xì)胞體外分化的培養(yǎng)環(huán)境和細(xì)胞因子的種類會對其分化進(jìn)程及功能產(chǎn)生重要的影響，具體作用機制尚需進(jìn)一步研究。

（圖1見插頁）

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（2014-10-01收稿2014-10-30修回）

（本文編輯陳麗潔）

The efficiency and function detection of NK cell differentiation from human umbilical cord hematopoietic stem cells in vitro

LUO Qi1，YIN Jie2，LI Yang2，HUANG Shan2，WANG Xi2，HE Jinghua1△
1 Department of Pharmacology，College of Basic Medicine，Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cell Biology，College of Basic Medicine，Tianjin Medical University
△Corresponding AuthorE-mail：hejinghuacn@163.com

ObjectiveTo detect the efficiency and function of NK cell differentiation from human umbilical cord hematopoietic stem cells（HSCs）in vitro.MethodsCD34+hematopoietic stem cells were isolated from human umbilical cord blood，and inoculated into SCGM medium containing 20 μg/L FMS like tyrosine kinase 3 ligand（Flt-3L），stem cell factor（SCF），interleukin（IL）-7，IL-15 and IL-21.And CD34+HSCs were differentiated into NK cells in directional inducing. The growth state of cells was observed.The expressions of CD56，NKG2D，NKp46，CD3，CD19 and CD34 were detected by flow cytometry in the differentiation of 7，14，21 and 28 d.In the differentiation of 21 d and 28 d，the differentiation cells were used as effector cells，and K562 cells as target cells.The ratios of effector cells and target cells were 8∶1，4∶1，2∶1 and 1∶1.The killing activity of the differentiated cells was detected by lactate dehydrogenase（LDH）cell toxicity assay and 7AAD/CFSE labeling method.ResultsCD34+HSCs derived from human umbilical cord blood can proliferate in vitro under appropriate condition.There were no significant differences in the expression of CD3 and CD19 between different differentiation stages（7，14，21 and 28 d，P＞0.05）.The expressions of CD56，NKG2D and NKp46 were significantly different（P＜0.05），and the ultimate expression amount was（72.57±1.60）%，（32.83±1.29）%and（29.53±2.40）%.The expression of CD34 decreased gradually，and the lowest was（12.13±2.01）%.The maximum killing activity detected by LDH cell toxicity assay and 7AAD/CFSE labeling method reached（49.91±2.76）%and（40.87±1.12）%.The killing activity of NK cells was decreased in the order of 8∶1，4∶1，2∶1 and 1∶1 groups（P＜0.05）.There was no significant difference in the killing activity between NK cells of 28 d and 21 d.ConclusionHuman umbilical cord hematopoietic stem cells can differentiate into NK cells un-der appropriate conditions in vitro，and the NK cells induced from differentiation are with killing activity.

fetal blood；hematopoietic stem cells；killer cells，natural；immunophenotyping；cytotoxicity tests，immunologic；CD34+hematopoietic stem cells；in vitro differentiation；cytotoxicity

R392

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.03.001

973國家重大科學(xué)研究計劃資助項目（2014CB910104）；國家自然科學(xué)基金資助項目（81171899）

1天津醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院藥理學(xué)教研室（郵編300070）；2天津醫(yī)科大學(xué)細(xì)胞生物學(xué)系

羅琦（1990），女，碩士在讀，主要從事腫瘤與免疫藥理學(xué)方面研究

△E-mail：hejinghuacn@163.com