譚艷萍，劉寅，高靜，孫根義

PCSK9基因rs11206510多態(tài)性與血脂及冠心病的關系

譚艷萍1，劉寅2△，高靜2，孫根義2

目的探討PCSK9 rs11206510基因多態(tài)性與脂代謝及發(fā)生冠心?。–HD）風險的相關研究。方法選擇在天津市胸科醫(yī)院住院患者778例，分為CHD組502例和對照組276例。入院后檢驗三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）、載脂蛋白（Apo）A1、ApoB并檢測入選人群的基因型TT、TC、CC。結果CHD組TC基因型組LDL-C水平較TT基因型組高（P＜0.05）。CHD組和對照組均以TT基因型為主，2組基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。被檢總人群等位基因頻率分別為T 96.1% （1 495/1 556），C 3.9%（61/1 556）；基因型頻率分別為TT 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/778）。多因素Logistic回歸分析ApoA1、HDL-C是CHD的保護因素。結論CHD組TC基因型與血清LDL-C的升高有相關性，而等位基因C與CHD的發(fā)病無明顯相關性。

冠心?。欢鄳B(tài)現(xiàn)象，遺傳；載脂蛋白類；脂蛋白類；PCSK9

大量研究表明，冠心病（CHD）發(fā)病因素中血脂異常是其主要發(fā)病機制之一。目前，降低血液膽固醇濃度、降低低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C）已成為近些年心血管保護的主要策略，但是LDL-C的有效控制使心血管疾病的患病率僅下降30%，而大部分不能得到有效的保護，這表明了心血管疾病是多因素疾病，需要尋找更為有效的預防措施［1-2］。常染色體顯性高膽固醇血癥（ADH）是家族早發(fā)性動脈粥樣硬化的最主要的危險因素。除了以前公認的低密度脂蛋白受體（LDL-R）基因的突變，LDL-R的配體蛋白-載脂蛋白（Apo）B的功能缺陷，還涉及2003年發(fā)現(xiàn)的第3個基因，前蛋白轉化酶枯草桿菌蛋白酶/西布曲明9a型（Proprotein convertase subtilisin/kexin type9，PCSK9）［3］。PCSK9是一種獨特的前蛋白轉化酶，其蛋白質稱為NARC1（neural apoptosis-regulated con?vertase 1），一種新的前蛋白轉換酶，屬于枯草蛋白酶亞家族。PCSK9可介導LDL-R降解，升高LDL-C水平。PCSK9存在幾種常見的序列變異，這些變異對血漿膽固醇水平有很大影響。近年來PCSK9基礎與臨床研究不斷取得新的進展，PCSK9基因多態(tài)性與臨床疾病的關系越來越受到研究人員和臨床醫(yī)生的關注。本研究旨在分析PCSK9 rs11206510位點多態(tài)性與血脂及冠心病的關系。

1　對象與方法

1.1研究對象選擇2012年1月—2014年1月在天津市胸科醫(yī)院經冠狀動脈造影（CAG）檢查確診為冠心病的患者502例作為CHD組，包括急性冠脈綜合征（ACS）404例和穩(wěn)定型心絞痛（SA）98例。抽取同期天津市胸科醫(yī)院心內科部分住院患者276例，經CAG及心臟超聲檢查排除心臟疾患并且肝腎功能正常者作為對照組。

1.2方法

1.2.1治療方法CHD組患者入院給予阿托伐他汀鈣（美國輝瑞制藥有限公司）20 mg，每晚1次口服。治療12周后，復查血脂水平，包括總膽固醇（CHO）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、LDL-C、極低密度脂蛋白膽固醇（VLDL-C）、ApoA1、ApoB等，以上均由TOSHIBA 120FR全自動生化儀檢測。觀察他汀類藥物對攜帶 PCSK9 rs11206510基因型冠心病患者的血脂調節(jié)作用。記錄2組的性別、年齡、收縮壓（SBP）、舒張壓（DBP）、心率等一般資料，入院時的血常規(guī)，肝、腎功能等實驗室檢查指標，心臟超聲檢查結果，CAG檢查等。

1.2.2基因型檢測方法用Triton低滲緩沖液溶血方法提取基因組DNA。采用PCR-RFLP基因分析方法檢測PCSK9基因rs11206510位點多態(tài)性。查詢文獻和人類基因庫進行檢索，確定目的基因擴增引物序列，并經Gene Runner程序檢測。PCSK9基因rs11206510位點上游引物5′-CCAGCA TTG CCA GCT TCT CTG TCT C-3′，下游引物5′-AGGAAG AGG AGC CAA AGA CGG CCA CCA CAG ACA GC-3′（上海生物工程有限公司合成）。擴增產物目的片段長度138 bp。PCR擴增總體系共25 μL，包括引物1 μL，緩沖液5 μL，dNTP 0.5 μL，TaqE 0.3 μL，H2O 17.2 μL，人DNA 1 μL。PCR反應條件為：95℃5 min，95℃30 s，62℃30 s，72℃60 s，循環(huán)35次，72℃7 min，4℃10 min。酶切反應總體系共18 μL，包括緩沖液1.8 μL，Hin6 I 1 μL（Fermentas公司提供），H2O 3.2 μL，PCR產物12 μL。37℃恒溫水浴過夜，3.5%瓊脂糖凝膠電泳分析，觀察酶切產物。rs11206510多態(tài)性依據(jù)酶切位點是否存在判斷基因型：野生型純合子TT片段長度為138 bp，突變型雜合子TC片段長度為138 bp、102 bp、36 bp，突變型純合子CC片段長度為102 bp和36 bp。

1.3統(tǒng)計學方法根據(jù)公式計算各等位基因頻率，Hardy-Weinberg公式計算各基因型（p+q=1，2pq=雜合型基因頻率）的理論值（野生型:樣本總數(shù)×p2；雜合突變樣本總數(shù)×2pq；純合突變：樣本總數(shù)×q2），χ2檢驗檢測Hardy-Weinberg平衡吻合度。SPSS 18.0進行統(tǒng)計學處理。組間基因型與等位基因頻率比較用χ2檢驗。應用多因素Logistic回歸分析冠心病發(fā)病的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2　結果

2.12組一般資料比較CHD組中男性比例、吸煙、飲酒史、糖尿病患者比例高于對照組，CHD組HDL-C水平低于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05或P＜0.01）；CHD組SBP、LDL-C、ApoA1、ApoB水平高于對照組，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05），見表1。

Tab.1　Comparison of basics between CHD group and the control group表1　CHD組和對照組一般資料比較

2.2基因型檢測結果可見野生型純合子TT（138 bp），突變型雜合子TC（138 bp、102 bp、36 bp），但未出現(xiàn)CC基因型（102 bp、36 bp），見圖1。

Fig.1　Genotype results圖1　基因型檢測結果

2.32組不同基因型與血脂關系的比較CHD組TG、LDL-C水平TC基因型組較TT基因型組高（P＜0.05），CHO、HDL-C、ApoA1、ApoB水平TC基因型組與TT基因型組比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。對照組TT基因型組與TC基因型組比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），見表2。

Tab.2　Correlation of genotype with blood lipid in CHD and control groups表2　CHD組和對照組不同基因型與血脂的關系

2.4被檢人群基因型和等位基因頻率的分布狀況PCSK9 rs11206510基因型在CHD組和對照組均以野生型TT為主，而等位基因均以T為主。CHD組與對照組中，等位基因T頻率均高于等位基因C頻率。2組基因型頻率分布和等位基因頻率分布差異均無統(tǒng)計學意義。被檢總人群等位基因頻率分別為T 96.1%（1 495/1 556），C 3.9%（61/1 556）；基因型頻率分別為 TT 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/ 778），見表3。

Tab.3　Genotype frequencies and allele frequency distribution in CHD and control groups表3　2組基因型頻率及等位基因頻率分布

2.5多因素Logistic回歸分析結果選擇CHD組和對照組單因素分析結果差異有統(tǒng)計學意義的變量，以血清HDL-C、LDL-C、ApoA1、ApoB，性別（0=男性，1=女性），有無糖尿病史、吸煙史、飲酒史（0=無，1=有）作為協(xié)變量，有無冠心?。?=無，1=有）作為因變量，逐步引入多因素非條件Logistic回歸，結果顯示，ApoA1、HDL-C是冠心病的保護因素，見表4。

Tab.4　Multivariate Logistic regression analysis of the effect of CHD表4　影響CHD的多因素Logistic回歸分析

3　討論

冠心病是人類健康的巨大威脅并且已成為中國人口死因構成比例上升最快的疾病，多種危險因素使冠脈受累程度高，且彌漫性血管病變多，致使冠心病病變更加嚴重，對患者的身體健康危害較大。既往研究證實在冠心病的發(fā)病因素中血脂代謝紊亂、高血壓、糖尿病、遺傳等起著重要作用。遺傳因素中，許多研究已經證實PCSK9基因rs11206510位點多態(tài)性是增加冠心病發(fā)病的危險因素［4-6］。GWAS研究確定PCSK9常見等位基因的單核苷酸1p32號染色體上的rs11206510多態(tài)性與LDL-C水平密切相關，可使LDL-C水平升高［6］。LDL-C水平的升高是冠心病發(fā)病的危險因素，因此 PCSK9基因rs11206510多態(tài)性帶有某等位基因的人群，冠心病的發(fā)病會增加。

目前關于PCSK9基因rs11206510多態(tài)性在中國人群中報道不多。Xu等［7］的研究發(fā)現(xiàn)中國漢族人群等位基因C與LDL-C水平升高有關，而全基因組研究發(fā)現(xiàn)大部分是T與LDL-C水平升高有關。Guella等［8］研究發(fā)現(xiàn)等位基因C在意大利人口中與低濃度的LDL-C水平有關，而Teslovich等［9］發(fā)現(xiàn)T 與LDL-C水平升高有關。本研究表明CHD組TC基因型血清LDL-C水平比TT基因型顯著增高，而對照組LDL-C水平TT基因型較TC基因型高但差異無統(tǒng)計學意義。本研究未見CC基因型出現(xiàn)，可能與樣本數(shù)量不夠大及存在地區(qū)、人群差異有關。關于等位基因頻率分布，Zhang等［10］的研究發(fā)現(xiàn)PC?SK9基因rs11206510等位基因C頻率是6.5%，等位基因T頻率是93.2%，Xu等［7］研究發(fā)現(xiàn)等位基因C頻率在白種人是19%，而在本研究中等位基因C頻率是3.9%，明顯低于其他研究，存在較大的地區(qū)差異、人群種族差異。GWAS研究發(fā)現(xiàn)rs11206510與冠心病的發(fā)生有關。Zhang等［10］的薈萃分析發(fā)現(xiàn)rs11206510與歐洲人群冠心病的發(fā)生有關，但在亞洲人群中卻未發(fā)現(xiàn)。Teslovich等［9］發(fā)現(xiàn)等位基因T與冠心病的發(fā)生有關，Xu等［7］的研究發(fā)現(xiàn)等位基因T在中國漢族人群中與早發(fā)冠心病有關。而在本研究中被檢人群基因型及等位基因CHD組和對照組相比差異均無統(tǒng)計學意義，因此 PCSK9基因rs11206510位點等位基因C可能不是中國天津地區(qū)冠心病發(fā)病的易感基因。

本研究單個指標男性、吸煙、飲酒、糖尿病、LDL-C、HDL-C、ApoA1等CHD組和對照組相比差異有統(tǒng)計學意義。將具有統(tǒng)計學意義的單個指標進行冠心病影響因素的多因素Logistic回歸分析顯示，HDL-C、ApoA1是冠心病發(fā)病的保護因素。ApoA1是高密度脂蛋白中的主要蛋白，是細胞膜上的HDL-C受體結合的載體，同時具有維護HDL-C結構的作用。HDL-C是逆向轉運的內源性膽固醇酯，在降低血液中膽固醇酯、抗炎、抗氧化方面具有重要作用。因此認為提高HDL-C可有效地改善血脂，降低冠心病的發(fā)病率［11］。

綜上所述，關于PCSK9基因rs11206510位點的研究需要進一步擴大樣本數(shù)量，對其更加深入的研究有助于研究者進一步理解動脈粥樣硬化的病理病程和發(fā)展新的藥物。

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（2014-07-03收稿2014-09-22修回）

（本文編輯魏杰）

Relationship between PCSK9 gene polymorphorism rs11206510 with blood lipid level and coronary heart disease

TAN Yanping1，LIU Yin2△，GAO Jing2，SUN Genyi2
1 Tianjin Medical University，Tianjin 300070，China；2 Department of Cardiology，Tianjin Chest Hospital
△Corresponding AuthorE-mail：liuyin2088@163.com

ObjectiveTo investigate the relationship between PCSK9 gene polymorphism with lipid metabolism and CHD risk among population within Tianjin，China.MethodsPatients from Tianjin Chest Hospital were selected（n=778）and divided into coronary heart disease（CHD）group（n=502）and control group（n=276）.Immediately after admission，tri?glyceride（TG），high density lipoprotein（HDL-C），low density lipoprotein（LDL-C），apolipoprotein A（ApoA1）and apolipo?protein B（ApoB）were tested and genotype TT，TC and CC were determined.ResultsIn CHD group，LDL-C level is higher in TC genotype individuals than that in TT genotype individuals with statistical significance（P＜0.05）.CHD group and the control group were dominated by TT genotype with no statistical difference between their allele frequency distribution nor genotype frequency distribution（P＞0.05）.The total population allele frequencies were T 96.1%（1 495/1 556），C 3.9%（61/ 1 556）；genotype frequencies were TT 92.2%（717/778），TC 7.8%（61/778）.Multivariate Logistic regression analysis revealed that ApoA1 and HDL-C were inversely associated with coronary heart disease，therefore are protective factors for coronary heart disease.ConclusionThe study found that TC genotype is correlated with serum LDL-C increase in group CHD，and the incidence of allele C showed no obvious connection with CHD.

coronary disease；polymorphism，genetic；apolipoproteins；lipoproteins；PCSK9

R541.4

ADOI：10.11958/j.issn.0253-9896.2015.02.017

1天津醫(yī)科大學研究生院（郵編300070）；2天津市胸科醫(yī)院心內科

譚艷萍（1990），女，碩士在讀，主要從事心血管內科研究

△E-mail：liuyin2088@163.com