董文志 馬加慶 劉志恒 莫小華

摘要：目的探討三七總皂苷是否降低胰腺炎大鼠胰腺組織中鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ一γ（CaMKⅡ-γ）mRNA表達(dá)，降低細(xì)胞鈣超載的程度，減輕急性重癥胰腺炎時胰腺組織的損傷。方法15只SD大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組（so組）、急性重癥胰腺炎組（SAP組）及三七總皂苷組（PNS組）。采用經(jīng)腸壁逆行胰膽管注射法建立急性重癥胰腺炎大鼠模型，假手術(shù)組開腹后僅翻動十二指腸。三七總皂苷組（PNS組）建模前1h使用腹腔注射三七總皂苷（50mg/mL血塞通注射液（0.1 mL/l00g）.所有實(shí)驗(yàn)分組在建模24h后處死大鼠留取胰腺組織。使用流式細(xì)胞儀檢測、分析腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度（使用熒光強(qiáng)度表示鈣離子濃度），采用逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)檢測胰腺組織CAMKⅡ- γmRNA表達(dá)的變化，并比較各組大鼠胰腺組織病理變化。結(jié)果SAP組和PNS組胰腺組織中CAMK II -γmRNA表達(dá)顯著增高（P<0.05），PNS組較SAP組CAMKⅡ- γmRNA表達(dá)量顯著下降（P<0.05）。通過流式細(xì)胞儀檢測鈣離子濃度提示：SO組、SAP組、PNS組三組胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2的熒光強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，SAP組和PNS組較so組大鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2+的熒光強(qiáng)度均有顯著升高（P<0.05）。與SAP組相比，PNS組大鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2的熒光強(qiáng)度均有顯著降低（P<0.05）。病理學(xué)評分：與s0組相比，PNS和SAP2組大鼠胰腺組織水平均顯著增高（P<0.05）。PNS組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分顯著低于SAP組（P<0.05）。結(jié)論 SAP發(fā)生時，細(xì)胞鈣超載程度越高，SAP的病情越重。CAMKⅡ一γ的表達(dá)量與胰腺炎病情輕重有關(guān)，三七總皂苷（PNS）干預(yù)可抑制胰腺細(xì)胞內(nèi)CAMKⅡ-γ的表達(dá)，從而緩解胰腺細(xì)胞內(nèi)鈣超載，可以減輕胰腺組織病理學(xué)改變。

關(guān)鍵詞：三七總皂苷；急性重癥胰腺炎；鈣超載；鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ型

中圖分類號：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號：1007 - 2349（ 2015） 02 - 0055 - 04急性重癥胰腺炎（ severe acute pancreatitis，SAP）屬于急性胰腺炎的特殊類型，其病情險(xiǎn)惡、并發(fā)癥多、病死率較高一直是臨床上棘手的問題。其常在早期合并全身炎癥反應(yīng)綜合征（ Systemic Inflammatory Response Syndrome，SIRS）和多器官功能衰竭（ Multiple Organ Disfunction Syndrome，MODS），其病死率高達(dá)20%-30%。目前在SAP的診治方面雖然取得了不少進(jìn)展，并發(fā)癥發(fā)生率有明顯下[1]，但其病死率卻居高不下，而且針對其發(fā)病機(jī)制的了解還不十分明確2。近年來針對胰腺細(xì)胞鈣超載的研究越來越受到關(guān)注。鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ一γ（CAMKⅡ-γ）是一類由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通過結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)作用。三七總皂苷（ PNS）在治療胰腺炎方面有著較為長遠(yuǎn)的歷史，目前在臨床中也廣為使用，其療效也受到廣泛認(rèn)可本文通過建立大鼠急性重癥胰腺炎模型，并給予三七總皂苷進(jìn)行干預(yù)，了解三七總皂苷對胰腺細(xì)胞鈣超載的調(diào)節(jié)及其作用機(jī)制。1 材料與方法1.1 建模及分組清潔級雄性SD大鼠15只（第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心提供）體重200～ 220 g，分成假手術(shù)組（n=5），急性重癥胰腺炎（ SAP）組（n=5），三七總皂甙預(yù)處理組（PNS組）組（n=5）。造模前禁食24h，自由飲水。SO組僅打開腹腔，翻動腸管。其余2組采用許永春等[3]使用的改良逆行膽胰管注射法逆行注射5%牛黃膽酸鈉溶液（Sigma公司），其中PNS組術(shù)前30 min腹腔注射三七總皂苷（血塞通注射液昆明興中制藥有限責(zé)任公司）。分別于術(shù)后24h分批處死大鼠，留取胰腺組織備用。1.2胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的檢測 取胰腺組織后立即使用膠原酶獲得胰腺腺泡細(xì)胞懸液。取部分細(xì)胞懸液將Fluo -3 - AM（5 μmol/L。）試劑在37℃下避光孵育細(xì)胞30 min，后洗凈細(xì)胞外熒光。在熒光顯微鏡下觀察胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)鈣離子的顯影（圖1）。使用流式細(xì)胞儀（ FCM）中調(diào)整加載后的胰腺細(xì)胞懸液，使其細(xì)胞濃度為5×108個/L。洗凈細(xì)胞外熒光，應(yīng)用FCM（激發(fā)波長488 nm）隨機(jī)測定單個胰腺細(xì)胞的熒光強(qiáng)度值，取1 x104個/L胰腺細(xì)胞內(nèi)鈣離子的熒光強(qiáng)度的平均值。1.3胰腺組織病理學(xué)評分經(jīng)腹腔獲取胰腺組織，取大小約0.5cm×0.5cm×0.5cm胰腺組織用10%甲醛溶液固定、石蠟包埋、4μm切片、HE染色后，光鏡下觀察胰腺組織的病理改變。按照采用改良Grewal等[4]的方法對SAP大鼠胰腺組織損傷進(jìn)行定量評估。1.4實(shí)時定量熒光PCR測定CaMKⅡmRNA表達(dá)水平40～50 mg胰腺組織，采用TRIzol試劑冰上提取胰腺組織總RNA.逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以cDNA為模板，熒光標(biāo)記物、探針及引物由廣州富能科技有限公司提供，內(nèi)參基因?yàn)镃APDH（產(chǎn)物為123bp）、目的基因?yàn)镃aMKⅡ-γ（產(chǎn)物為96bp）。擴(kuò)增體系反應(yīng)條件：95℃ 10 min變性，95℃ 15S、600℃ 30S、72℃ 45S.這樣循環(huán)40次。在7500快速實(shí)時定量PCR系統(tǒng)中進(jìn)行體系擴(kuò)增和結(jié)果分析，得出每一樣品的循環(huán)熒光域值（Ct值）。反應(yīng)完成后再于95℃ [5S、60℃l min、95℃15 S后繪制熔解曲線。使用Schmittgen和Livak設(shè)計(jì)的閾值法來測定目的基因的相對表達(dá)水平。目的基因量=2 -△△Ct，△△Ct=（Ct目的基因- Ct管家基因）實(shí)驗(yàn)組一（Ct目的基岡- Ct管家基因）對照組。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理以SPSS1 1.7軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差表示，進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，根據(jù)樣本的性質(zhì)采用單兇素方差分析、LSD -t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1胰腺細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的熒光強(qiáng)度S0組、SAP組、PNS組3組之間胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2的熒光強(qiáng)度具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。SAP組和PNS組2組大鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2的熒光強(qiáng)度均有顯著升高（P<0.05）。PNS組大鼠胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2的熒光強(qiáng)度較SAP組有顯著降低（P<0.05），見表1、組圖2。2.2胰腺組織病理學(xué)評分SAP組、PNS組2組開腹后肉眼可見胰腺組織均出現(xiàn)了腫脹、滲出、點(diǎn)狀出血、局灶性壞死。SO組、PNS組和SAP組3組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P<0.05）。S0組大鼠胰腺組織病理學(xué)評分較SAP組及PNS組顯著降低（P<0.05），PNS組較SAP組顯著降低（P<0.05）見表1、組圖1。2.3胰腺腺組織CaMKII -γmRNA表達(dá)水平SAP組、PNS組和so組3組胰腺組織在96bp處均能見到有CAMKⅡ一γmRNA的PCR產(chǎn)物的條帶，其陽性內(nèi)參CAPDH mRNA的PCR產(chǎn)物也可以在123bp處可見。通過統(tǒng)計(jì)學(xué)分析可知，SAP組和PNS組2組CAMKⅡ-γmnRNA的表達(dá)水平顯著高于SO組（P<0.05），而PNS組的表達(dá)水平則低于SAP組（P<0.05）。見表l、組圖3。3討論

關(guān)于急性重癥胰腺炎的發(fā)病機(jī)制，同前的研究的學(xué)說眾多。其主要包括：胰酶消化學(xué)說、炎性因子過度激活學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、腸道細(xì)菌感染、微循環(huán)障礙、細(xì)胞調(diào)亡學(xué)說、基因多態(tài)性學(xué)等。近年來針對“鈣超載”學(xué)說的研究愈來受到關(guān)注。曾孝征和范維珂研究發(fā)現(xiàn)存胰管高壓、乙醇、病毒、缺氧以及高鈣血等情況下都會引起胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的濃度升高，從而誘發(fā)胰腺炎的發(fā)生[5-6]。臨床工作中發(fā)現(xiàn)高鈣血癥患者更容易發(fā)生急性胰腺炎，同時大量文獻(xiàn)也提示胰腺炎患者血鈣濃度會降低[7] 正常情況卜，胰腺腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2+穩(wěn)定在150mmol/L，水平左右，而胞內(nèi)游離Ca2+含量很少，但是游離Ca2是重要的第二信使，通過調(diào)控符種信號通路而影響細(xì)胞活動及功能。當(dāng)腺泡細(xì)胞內(nèi)Ca2這種穩(wěn)態(tài)會火衡則會誘發(fā)胰腺炎。在動物胰腺炎模型中發(fā)現(xiàn)在胰腺炎早期胰腺組織內(nèi)Ca2+會異常積聚，并且積聚程度與胰腺炎發(fā)展成正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)中也發(fā)現(xiàn)腺泡胰晦活性有賴于外源性Ca2+的濃度，相反降低這些外源性Ca2+的濃度也可以減少胰酶的激活[8]

鈣一鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶II（CaMKⅡ）足一類由Ca2+/CaM激活的多功能蛋白激酶，通過結(jié)合后發(fā)生自身磷酸化，參與細(xì)胞內(nèi)多種信號通路，完成各種生物功能。CaMKⅡ有α、β、γ、δ4種亞型，而α、β這兩種亞型重要在神經(jīng)細(xì)胞內(nèi)表達(dá)。而在胰腺組織中主要以γ型表達(dá)。純化的在鈣/鈣調(diào)素（ Ca-+/CaM）缺失時幾乎沒有生物活性，有研究發(fā)現(xiàn)CaMKⅡ在與鈣/鈣調(diào)素結(jié)合后其活性最少增加200倍[9]。這種結(jié)合會引起分子構(gòu)象即改變，使分子中抑制結(jié)構(gòu)域發(fā)生自身磷酸化，并依次磷酸化細(xì)胞中的其它靶蛋白，從而表現(xiàn)出鈣/鈣調(diào)素依賴性的生物學(xué)活性。胰腺細(xì)胞內(nèi)Ca2進(jìn)入細(xì)胞主要通過細(xì)胞內(nèi)外的鈣離子通道來實(shí)現(xiàn)，而CaMKⅡ則磷酸化細(xì)胞膜上的L型鈣通道以及相關(guān)的調(diào)節(jié)蛋白，是通道開放大量Ca2進(jìn)入細(xì)胞[10]。同時還可以去除肌質(zhì)網(wǎng)上的抑制蛋白，導(dǎo)致肌質(zhì)網(wǎng)上鈣通道打開，大量Ca2進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，引起細(xì)胞內(nèi)鈣超載。

目前三七總皂苷對于胰腺炎的治療已經(jīng)十分常見，也得到了臨床實(shí)踐的認(rèn)可。張恒[11]：在對70例臨床胰腺炎患者治療觀察，通過統(tǒng)計(jì)患者血中C反應(yīng)蛋白變化發(fā)現(xiàn)奧曲肽聯(lián)合三七總皂苷在急性胰腺炎的綜合治療中可發(fā)揮協(xié)同作用，療效優(yōu)于單用奧曲肽。在動物實(shí)驗(yàn)中==七總皂苷在治療胰腺炎的機(jī)制方面在炎性因子、氧自由基方面報(bào)道較多[12]，但對于鈣超載報(bào)道較少。在對嚴(yán)重?zé)齻髾C(jī)體免疫系統(tǒng)功能的研究發(fā)現(xiàn)中藥三七皂苷對肌醇脂質(zhì)信號系統(tǒng)巾IP3一CaM途徑具有較好的調(diào)理作用[13]。在對大鼠腦組織缺血再灌注研究發(fā)現(xiàn)三七總皂苷可以減少大鼠海馬及皮層CaMKⅡ-βmRNA及蛋白表達(dá)[14]。在本實(shí)驗(yàn)中，通過對大鼠胰腺炎治療24h各項(xiàng)檢測指標(biāo)發(fā)現(xiàn)：使用三七總皂苷可以減少胰腺的病理損傷，對胰腺組織起到保護(hù)作用。運(yùn)用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞的熒光強(qiáng)度提示三七總皂苷對于胰腺腺泡細(xì)胞鈣超載有所緩解。在使用實(shí)時定量熒光PCR測定CaMKⅡmRNA表達(dá)水平表明，三七總皂苷可以降低由于胰腺炎而升高的組織內(nèi)CaMKⅡmRNA的表達(dá)水平。綜上所述，胰腺炎的發(fā)病機(jī)制中鈣超載起到十分關(guān)鍵的作用，三七總皂苷可以通過減少組織內(nèi)CaMKⅡmRNA的表達(dá)水平從而減低細(xì)胞內(nèi)Ca2的濃度。而對于CaMKⅡ的蛋白水平的影響和臨床中對患者體內(nèi)的變化，仍需要進(jìn)一步研究。參考文獻(xiàn)[1]UhlW， ISENMAN N R，CURTI G， et al. Influence. of etiology on thecourse and outcome of acute pancreatitis. Pancreas， 1996，13（1）：335-343.[2] MCNAMARA D.Pancreatic diseases[J].Aliment Pharmacol Ther，2003 ，18（ Suppl）：60 - 65.[3]許永春，李兆申，屠振興，等.改良逆行膽胰管注射法制備輕重不同兩種大鼠急性胰腺炎模型.第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2004 ，25（11）：1251-1252.[4] GREWAL HP， MOHEY EL DIN A， GABER L，et al.Amelioration ofthe physiologic and biochemical changes of acute pancreatitis using ananti - TNF - alpha polyclonal antibody[J].Am J Surg，1994：167（1）：214 - 218.[5]曾孝征.組織學(xué)與胚胎學(xué)[M].北京：人民衛(wèi)生出版社，2004：219 – 222.[6]范維珂，胰腺的病理生理學(xué)[M].（下冊）.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，1984：419-425[7]李祖銘，急性胰腺炎患者血清白蛋白、葡萄糖、鈣水平的變化及臨床意義[J].內(nèi)科急危重癥雜志，16（3）：149-150.[8] CRIDDLE DN， CERASIMENKO JV， BAUMGARTNER HK， etal. Calcium signaling and pancreatic cell death：apoptosis or[J].CellDeath Differ 2007 ，14：1285 - 1294.[9] HOWARD S. Phosphorylation of microtubule - associated proteins hy acalcium/calmodulin - dependent protein kinase[J] J Cell Biol，1984，99（7）：11 -19.[10] CURRIE S.Cardiac ryanodine receptor phosphorylation by CaM Ki-nase U：keeping the ba lance right， Front Bioscl，2009 ，14（1）：5134-5156.[11]張恒，倪鴻昌.奧曲肽聯(lián)合三七總皂苷在急性胰腺炎綜合治療中的療效觀察[J].安徽醫(yī)藥，15（12）：1581 -1583.[12]葛忠，張東生，胡義利，等.三七皂苷和善寧對大鼠急性重癥胰腺炎治療作用的比較研究[J]，中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，14（12）：17 – 22.[13]羅中華，蔡紹麗，黃文華，等.三七皂苷對燙傷小鼠巨噬細(xì)胞IP3CaM信號途徑的影響[J].第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2001 ，23（8）：925 - 927.[14]牛增強(qiáng)，閆玉仙，馬春玲，等三七總皂苷對嗎啡戒斷大鼠海馬組織aMKⅡ活性及CaMK Ⅱα亞基蛋白表達(dá)的影響[J].中國藥物依賴性雜志，2008 ，17（2）：102-105（收稿日期：2014-11-07）