平康康 路飛 王澤鍵 趙偉 儲(chǔ)炬 莊英萍 王永紅

摘要：對(duì)黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的發(fā)酵過(guò)程進(jìn)行研究，并通過(guò)在線(xiàn)參數(shù)分析，發(fā)現(xiàn)在線(xiàn)生理參數(shù)攝氧率（OUR）和呼吸熵（RQ）可以用來(lái)表征發(fā)酵過(guò)程中底物葡萄糖消耗速率和得率的高低?；诖税l(fā)現(xiàn)，將在線(xiàn)生理參數(shù)攝氧率（OUR）和呼吸熵（RQ）成功用于葡萄糖酸鈉發(fā)酵動(dòng)力學(xué)特性表征和分析，得到了葡萄糖酸鈉發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖消耗率和得率及葡萄糖酸生成的動(dòng)力學(xué)方程，并對(duì)方程參數(shù)進(jìn)行最優(yōu)參數(shù)估計(jì)和非線(xiàn)性擬合。通過(guò)計(jì)算值與試驗(yàn)數(shù)據(jù)的比較，發(fā)現(xiàn)試驗(yàn)值和計(jì)算值可以很好地?cái)M合。該模型可以很好地應(yīng)用于葡萄糖酸鈉發(fā)酵工藝優(yōu)化預(yù)測(cè)及后續(xù)放大過(guò)程。

關(guān)鍵詞：黑曲霉；葡萄糖酸鈉；在線(xiàn)生理參數(shù)；動(dòng)力學(xué)模型

中圖分類(lèi)號(hào)： S188+.4 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0375-04

葡萄糖酸鈉是一種具有咸苦味、無(wú)腐蝕性、無(wú)揮發(fā)性、無(wú)毒、溫和的有機(jī)酸鈉鹽[1]。近年來(lái)，由于其在食品、飼料、醫(yī)藥及建筑等行業(yè)的廣泛應(yīng)用[2-6]，葡萄糖酸鈉越來(lái)越受到人們的關(guān)注。統(tǒng)計(jì)數(shù)字表明，葡萄糖酸鈉的市場(chǎng)需求量在逐年遞增[7-8]。目前工業(yè)上多采用黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉。黑曲霉代謝合成葡萄糖酸鈉的代謝過(guò)程可以簡(jiǎn)化如圖1表示[9]。其反應(yīng)方程式可以簡(jiǎn)化如下：

C6H12O6+12O2→C6H12O7；

C6H12O7+NaOH→C6H12O6Na。

在此發(fā)酵過(guò)程中，氧氣不僅僅用于菌體生長(zhǎng)和維持菌體的基本代謝，還作為生成葡萄糖酸反應(yīng)的基本底物之一。因此發(fā)酵過(guò)程中的攝氧率（OUR）是非常重要的生理參數(shù)之一。用數(shù)學(xué)模型研究發(fā)酵動(dòng)力學(xué)可以很好地揭示發(fā)酵過(guò)程中菌體生長(zhǎng)、底物消耗和產(chǎn)物形成的規(guī)律，在預(yù)測(cè)微生物發(fā)酵過(guò)程和指導(dǎo)工藝優(yōu)化方面起著很重要的作用[10]；但是傳統(tǒng)的葡萄糖酸發(fā)酵動(dòng)力學(xué)在預(yù)測(cè)和進(jìn)行工藝優(yōu)化時(shí)面臨較大的局限性，如產(chǎn)物和菌體量難以較快離線(xiàn)測(cè)定。本研究基于發(fā)酵過(guò)程中過(guò)程質(zhì)譜儀檢測(cè)分析尾氣成分及經(jīng)Biostar軟件采集計(jì)算所得的OUR、CER等生理參數(shù)，對(duì)黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的過(guò)程進(jìn)行在線(xiàn)參數(shù)分析，建立底物消耗動(dòng)力學(xué)、產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué)及得率的動(dòng)力學(xué)方程。該模型可以很好地描述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸的過(guò)程，可為工藝優(yōu)化及自動(dòng)化控制軟件設(shè)計(jì)提供較好的參考。

1 材料與方法

1.1 菌種

黑曲霉（Aspergillus niger），由山東福洋生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 培養(yǎng)基組成

斜面孢子培養(yǎng)基：葡萄糖 60 g/L、尿素 2 g/L、KH2PO4 13 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿 1 g/L、CaCO3 5 g/L、瓊脂 2 g/L，調(diào)pH值至6.5～7.0，在0.1 MPa、121 ℃條件下滅菌30 min?？刂婆囵B(yǎng)溫度和濕度，溫度35 ℃，濕度40%，培養(yǎng)周期36～48 h。

種子培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g/L、（NH4）2HPO4 1 g/L、KH2PO4 1 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿30 g/L。

發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖 300 g/L、（NH4）2HPO4 2 g/L、KH2PO4 2 g/L、MgSO4·7H2O 0.02 g/L、玉米漿 20 g/L。

1.3 分析檢測(cè)方法

菌濃度的測(cè)定：取50 mL發(fā)酵液，微孔濾膜（0.8 μm，上海迪清過(guò)濾技術(shù)有限公司）過(guò)濾，去離子水沖洗菌絲體5次，80 ℃ 烘干至質(zhì)量恒定，電子天平稱(chēng)質(zhì)量。

葡萄糖的檢測(cè)：取發(fā)酵液過(guò)濾所得清液，稀釋到適當(dāng)濃度，用菲林法[11]滴定。

葡萄糖酸鈉的檢測(cè)：取發(fā)酵液所得清液，稀釋適當(dāng)倍數(shù)，HPLC（HP1100，安捷倫）測(cè)定，流動(dòng)相為3 mol/L甲醇-0.25 mol/L 磷酸溶液（1 ∶1），流速1 mL/min，柱溫28 ℃，每次進(jìn)樣20 μL。

pH值與溶氧（DO）的測(cè)定：pH值、DO均用梅特勒電極測(cè)定。

發(fā)酵過(guò)程尾氣的采集：采用Extrel過(guò)程質(zhì)譜MAX300-LG對(duì)發(fā)酵過(guò)程中的進(jìn)氣和尾氣進(jìn)行實(shí)時(shí)在線(xiàn)采集分析，該質(zhì)譜儀能夠精確測(cè)定發(fā)酵過(guò)程尾氣中的氬氣、氮?dú)狻⒍趸己脱鯕獾认鄬?duì)分子質(zhì)量在300以?xún)?nèi)的可揮發(fā)性氣體。在使用之前用標(biāo)準(zhǔn)氣體對(duì)儀器的響應(yīng)度進(jìn)行標(biāo)定[12-13]。

攝氧率（OUR）和二氧化碳的生成速率（CER）測(cè)定[14]：OUR和CER通過(guò)對(duì)發(fā)酵尾氣的分析數(shù)據(jù)計(jì)算得到。以進(jìn)氣和尾氣中惰性氣體N2維持恒定建立平衡方程，求得OUR和CER的計(jì)算公式如下：

OUR=FinV[CO2，in-Cinertin×CO2，in1-（CO2，out+CCO2，out]×273273+Tin×11+h×Pin×1×10-5；

CER=FinV[Cinertin×CCO2，in1-（CO2，out+CCO2，out）-CCO2，in]×273273+Tin×11+h×Pin×1×10-5；

RQ=CEROUR。

式中：Fin為通氣速率；V是發(fā)酵液體積；Cinertin、CO2，in、CCO2，in分別是進(jìn)氣中惰性氣體、氧氣及二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)；CO2，out、CCO2，out分別是出氣中氧氣及二氧化碳的體積分?jǐn)?shù)；Pin為進(jìn)氣的絕對(duì)壓強(qiáng)；Tin 是進(jìn)氣溫度；h為進(jìn)氣的相對(duì)濕度；RQ為呼吸熵。

1.4 培養(yǎng)方法

種子的培養(yǎng)：在無(wú)菌條件下，將孢子培養(yǎng)基斜面上的孢子用去離子水洗下，接入5 L發(fā)酵罐（裝液量3 L）的種子生長(zhǎng)培養(yǎng)基中，在37 ℃、通風(fēng)量300 L/h、pH值用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)維持在5.8的條件下培養(yǎng)18～20小時(shí)。

分批發(fā)酵培養(yǎng)：將制備好的種子培養(yǎng)液在無(wú)菌條件下按接種量10%轉(zhuǎn)入5 L發(fā)酵罐（裝液量3 L）中，溫度維持在 37 ℃，通風(fēng)量300 L/h并保持一定攪拌轉(zhuǎn)速，pH值用10 mol/L氫氧化鈉調(diào)節(jié)維持在5.8的條件下培養(yǎng)至殘?zhí)墙抵?0 g/L以下時(shí)，發(fā)酵結(jié)束。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑曲霉發(fā)酵過(guò)程在線(xiàn)參數(shù)分析

為了了解黑曲霉發(fā)酵葡萄糖酸鈉過(guò)程中，在線(xiàn)生理參數(shù)OUR、CER伴隨殘?zhí)菨舛?、葡萄糖酸濃度變化而波?dòng)的規(guī)律，進(jìn)行了不同攪拌轉(zhuǎn)速條件下的3組分批發(fā)酵試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2、圖3和圖4。試驗(yàn)組1：維持恒定轉(zhuǎn)速250 r/min；試驗(yàn)組2：維持恒定轉(zhuǎn)速350 r/min；試驗(yàn)組3：維持恒定轉(zhuǎn)速450 r/min。

在通氣量、溫度、壓力都一定的情況下，可以通過(guò)提高轉(zhuǎn)速改善供氧，了解發(fā)酵過(guò)程中底物葡萄糖濃度、產(chǎn)物葡萄糖酸鈉濃度和在線(xiàn)生理參數(shù)OUR、CER及RQ在發(fā)酵過(guò)程中的變化規(guī)律。從圖2可以看出，黑曲霉經(jīng)過(guò)短暫延滯期后進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉生成速率都逐漸加快并達(dá)到較穩(wěn)定值。隨著發(fā)酵的進(jìn)行，OUR逐漸增大并在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束的時(shí)候逐漸達(dá)到一個(gè)穩(wěn)定值，CER在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期結(jié)束時(shí)達(dá)到最大值，然后緩慢降低。從圖2可以看出，隨著發(fā)酵攪拌轉(zhuǎn)速提高，供氧能力增強(qiáng)[15]，底物葡萄糖消耗速率和產(chǎn)物葡萄糖酸鈉生成速率明顯增大。而從圖3和圖4可以看出，250 r/min 試驗(yàn)組OUR和CER最高分別在28.5 mmol/（h·L）和 3.1 mmol/（h·L） 左右，350 r/min試驗(yàn)組OUR和CER最高分別在37.6 mmol/（h·L）和3.6 mmol/（h·L）左右，450 r/min試驗(yàn)組OUR和CER最高分別在 45.2 mmol/（h·L） 和4.2 mmol/（h·L）左右，同時(shí)第3組試驗(yàn)OUR和CER增長(zhǎng)速率明顯快于前2組試驗(yàn)。供氧能力提升導(dǎo)致耗糖速率和產(chǎn)酸速率的升高與OUR的增長(zhǎng)有一致性。與此同時(shí)，供氧的改變并未導(dǎo)致3組試驗(yàn)發(fā)酵末期CER有太大的差異，這主要是因?yàn)镃ER受菌濃度和菌體自身代謝所影響，發(fā)酵末期菌體增長(zhǎng)基本停止，CER僅僅受菌體維持代謝強(qiáng)度影響。而3組試驗(yàn)最高菌濃度分別為4.78、4.96、4.82 g/L，差別非常小。從試驗(yàn)穩(wěn)定期計(jì)算所得的RQ看，第1組試驗(yàn)穩(wěn)定期RQ為0.1左右，第2組試驗(yàn)穩(wěn)定期RQ為0.08左右，第3組試驗(yàn)穩(wěn)定期RQ為0.06左右。3組試驗(yàn)穩(wěn)定期間的產(chǎn)物得率分別為78.9%、843%和88.6%。即RQ降低的同時(shí)伴隨著底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的得率在升高。同時(shí)OUR和RQ的變化是在一定范圍內(nèi)的，黑曲霉發(fā)酵法生產(chǎn)葡萄糖酸鈉的實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，OUR一般為0～80 mmol/（h·L），RQ一般為0.04～0.2。

2.2 基于在線(xiàn)參數(shù)的宏觀(guān)動(dòng)力學(xué)的建立

2.2.1 底物消耗動(dòng)力學(xué) 發(fā)酵過(guò)程中，底物消耗主要用于以下3個(gè)方面：一是菌體的生長(zhǎng)消耗，二是用于產(chǎn)物的合成，三是用于菌體基本生命活動(dòng)的維持。因此傳統(tǒng)的底物消耗動(dòng)力學(xué)模型可以用如下方程來(lái)表示[16]：

-dSdt=1YX/S×dXdt+1YP/S×dPdt+mX。（3）

式中：S為葡萄糖質(zhì)量濃度（g/L）；t為時(shí)間（h）；YX/S為葡萄糖用于菌體生長(zhǎng)的得率常數(shù)；X為菌體濃度（g/L）；YP/S為葡萄糖用于產(chǎn)物積累的得率常數(shù)；P為葡萄糖酸鈉濃度（g/L）；m為維持常數(shù)。該方程雖然可以較好地描述葡萄糖酸鈉的發(fā)酵過(guò)程，但在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，由于產(chǎn)物得率和菌體維持所用底物消耗并不為常數(shù)，得率和維持系數(shù)會(huì)隨著發(fā)酵條件的改變而改變。而且該方程用到的物理量如菌濃度X難以快速檢測(cè)，因此該方程在指導(dǎo)工藝優(yōu)化的過(guò)程中作用十分有限。經(jīng)過(guò)上述分析我們知道底物消耗和攝氧率（OUR）有密切的關(guān)系，我們提出如下經(jīng)驗(yàn)公式來(lái)描述黑曲霉發(fā)酵生產(chǎn)葡萄糖酸鈉過(guò)程中底物的消耗：

-dSdt=kOUR+h（8≤OUR≤80）。

即OUR在8～80范圍內(nèi)，耗糖速率和OUR接近于線(xiàn)性關(guān)系，實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中，OUR也在這個(gè)范圍內(nèi)，為了進(jìn)一步縮小方程造成的計(jì)算誤差，用如下二次項(xiàng)方程代替線(xiàn)性方程，可以取得更精確的計(jì)算值。

-dSdt=αOUR2+βOUR+λ。（4）

式中：S為葡萄糖濃度（mmol/L），OUR為攝氧率（mmol/L），α、β、λ均為為常數(shù)。

2.2.2 RQ與得率的相關(guān)性分析 如上所述，底物葡萄糖一部分用于產(chǎn)物葡萄糖酸鈉的合成，一部分用于菌體的生成，一部分用于菌體維持，葡萄糖生成葡萄糖酸是一個(gè)不生成CO2的過(guò)程，也就是說(shuō)是一個(gè)RQ為0的反應(yīng)過(guò)程。菌體量的增加和菌體的維持伴隨著CO2的釋放，葡萄糖酸鈉發(fā)酵過(guò)程中的RQ是葡萄糖3個(gè)代謝去向的共同結(jié)果，呼吸熵RQ就可以在一定程度上表征得率的高低。可以用如下方程來(lái)描述發(fā)酵過(guò)程中RQ和得率的關(guān)系：

Yield=δRQ2+γRQ+（0.05≤RQ≤0.18）。（5）

式中，δ、γ、φ均為常數(shù)。

2.2.3 產(chǎn)物生成動(dòng)力學(xué) 傳統(tǒng)發(fā)酵動(dòng)力學(xué)認(rèn)為，黑曲霉生產(chǎn)葡萄糖酸鈉是一個(gè)生長(zhǎng)偶聯(lián)型，用如下方程來(lái)描述[17]：

dPdt=αdXdt+βX。（6）

式中：P為葡萄糖酸鈉濃度（g/L）；α、β為動(dòng)力學(xué)參數(shù)；αdXdt為與菌體生長(zhǎng)率相關(guān)的產(chǎn)物形成率；βX為非伴隨菌體生長(zhǎng)的產(chǎn)物形成率。該模型與傳統(tǒng)底物消耗動(dòng)力學(xué)模型類(lèi)似，在實(shí)際過(guò)程中也存在α、β為變量，菌濃度難以快速測(cè)定導(dǎo)致無(wú)法快速了解發(fā)酵過(guò)程產(chǎn)物生成的情況。因此根據(jù)式（6）又可進(jìn)行如下描述：

dPdt=Yield×dSdt。（7）

將式（4）、式（5）帶入式（7）得，發(fā)酵過(guò)程中葡萄糖酸鈉生成動(dòng)力學(xué)方程如下：

dPdt=（αOUR2+βOUR+γ）（δRQ2+γRQ+）。（8）

式中，P為葡萄糖酸鈉濃度（mmol/L）。

2.2.4 模型參數(shù)的求解 根據(jù)實(shí)際測(cè)得的數(shù)據(jù)，應(yīng)用Origin軟件，采用通用全局優(yōu)化算法，根據(jù)不同批次分批發(fā)酵的OUR和分別對(duì)應(yīng)底物消耗速率曲線(xiàn)和得率與RQ相關(guān)性曲線(xiàn)進(jìn)行非線(xiàn)性曲線(xiàn)擬合，得到擬合曲線(xiàn)，并得到參數(shù)最優(yōu)估計(jì)值（表1）。

根據(jù)表1數(shù)據(jù)，得到黑曲霉發(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸鈉過(guò)程中動(dòng)力學(xué)模型分別為：底物消耗動(dòng)力學(xué)模型： -dSdt=-0.099 4OUR2+2.830 9OUR-10.893 5；發(fā)酵過(guò)程中得率模型：Yield=-6.093 2RQ2-1.603 3RQ+1.0161（0.04≤RQ≤0.2）；產(chǎn)物合成動(dòng)力學(xué)模型：dPdt=（-0.009 4OUR2+2.830 9OUR-10.893 5）（-6.093 2RQ2-1.603 3RQ+1.016 1）。

表1 葡萄糖酸鈉發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型參數(shù)估計(jì)

參數(shù)αβλδγφ

估計(jì)值-0.009 42.830 9-10.893 5-6.093 2-1.603 31.016 1

圖5為不同OUR下的分批發(fā)酵過(guò)程中底物消耗曲線(xiàn)，圖6為不同RQ下得率變化曲線(xiàn)，其相關(guān)系數(shù)分別為0.994 8、0990 8?？梢?jiàn)這2個(gè)模型能很好地描述葡萄糖酸鈉發(fā)酵過(guò)程中的底物消耗、產(chǎn)物生成得率情況。

2.2.5 發(fā)酵動(dòng)力學(xué)模型誤差檢驗(yàn) 為了驗(yàn)證模型的準(zhǔn)確性，在相同的培養(yǎng)基條件下進(jìn)行分批發(fā)酵的重復(fù)試驗(yàn)，轉(zhuǎn)速設(shè)為450 r/min，通氣量為300 L/h，對(duì)分批發(fā)酵試驗(yàn)過(guò)程中底物消耗速率和產(chǎn)物生成速率的實(shí)際測(cè)量值和模型計(jì)算值進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表2。

從表2可以看出，0 h種子剛接入發(fā)酵培養(yǎng)基內(nèi)， 由于處

在延滯期的初始階段，OUR和CER值都很低，此時(shí)葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉產(chǎn)物生成速率都非常低，難以有效測(cè)出，同時(shí)經(jīng)過(guò)模型計(jì)算所得耗糖速率和產(chǎn)物生成速率為負(fù)值。這主要是因?yàn)榇藭r(shí)的OUR已經(jīng)不在模型的適用范圍之內(nèi)所致，但這并不妨礙該模型的實(shí)用性，因?yàn)樵谟煤谇拱l(fā)酵產(chǎn)葡萄糖酸鈉的實(shí)際過(guò)程中，除了延滯期的初始階段會(huì)有較低水平的OUR外，其他階段的OUR水平都在該模型使用范圍之內(nèi)。除了0 h的數(shù)據(jù)誤差較大外，發(fā)酵周期內(nèi)的其他時(shí)間葡萄糖消耗速率和葡萄糖酸鈉合成速率的實(shí)際測(cè)量值與模型計(jì)算值誤差都保持在10%以?xún)?nèi)。

3 結(jié)論與討論

微生物發(fā)酵是一個(gè)非常復(fù)雜的過(guò)程，菌體的生長(zhǎng)，底物的消耗和產(chǎn)物的生成往往受多種因素的影響。通過(guò)將黑曲霉分批發(fā)酵葡萄糖酸鈉過(guò)程尾氣分析所得的OUR、CER及RQ等在線(xiàn)參數(shù)與發(fā)酵過(guò)程相關(guān)聯(lián)，本研究認(rèn)為OUR越高，其發(fā)酵過(guò)程耗糖速率就越高，發(fā)酵周期相應(yīng)越短；RQ越低，發(fā)酵過(guò)程得率就會(huì)越高。并根據(jù)此種關(guān)聯(lián)，提出了底物消耗速率、得率及產(chǎn)物生成速率與在線(xiàn)參數(shù)RQ、OUR相關(guān)的數(shù)學(xué)模型。相比于傳統(tǒng)的底物消耗模型和產(chǎn)物生成模型，該模型在實(shí)際發(fā)酵過(guò)程中可以很好地描述底物的消耗、發(fā)酵過(guò)程中得率的高低及產(chǎn)物生成速率而不用去考慮菌體量的多少。該模型優(yōu)點(diǎn)在于方程變量可以通過(guò)計(jì)算機(jī)迅速得到，從而為發(fā)酵過(guò)程中工藝的優(yōu)化提供有實(shí)際意義的指導(dǎo)。

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