李學(xué)平 劉萍 李甲亮 吳海楠

摘要：采集草坪根際鹽堿化土壤進(jìn)行菌種篩選，并研究培養(yǎng)條件對(duì)菌株解磷效果的影響。試驗(yàn)結(jié)果表明，真菌菌株FL0908發(fā)酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達(dá)到1.96。菌株FL0908在所供4種碳源條件下均能生長(zhǎng)，不同碳源生長(zhǎng)差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差；對(duì)于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長(zhǎng)過(guò)于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長(zhǎng)，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之；對(duì)于所供4種溫度，真菌均可生長(zhǎng)，最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長(zhǎng)，最適pH值為6。對(duì)于試驗(yàn)中發(fā)酵液條件的優(yōu)化組合，最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉(zhuǎn)速130 r/min。

關(guān)鍵詞：解磷真菌；生物學(xué)特性；鹽堿土；根際

中圖分類(lèi)號(hào)： S182 文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：1002-1302（2015）07-0368-03

磷肥作為作物必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)對(duì)農(nóng)業(yè)效益的提高具有重大作用，但是施入土壤后由于土壤的固定作用，大部分磷與土壤中的Ca2+、Fe3+、Al3+結(jié)合，形成難溶性磷酸鹽[1]，大大降低了肥料的有效性。在土壤性質(zhì)、作物類(lèi)型、磷肥種類(lèi)和用量等一系列因素的影響下，每年施入的磷有75%～90%積累在土壤中成為難溶形態(tài)的磷[2]，當(dāng)季利用率一般為10%～25%[3]；因此，如何提高磷肥利用率一直是研究人員關(guān)注的重要問(wèn)題。解磷微生物是土壤中能將難溶性磷轉(zhuǎn)化為植物能夠吸收利用的可溶性磷的一類(lèi)特殊功能微生物類(lèi)群[4]。土壤中解磷微生物主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌。關(guān)于解磷細(xì)菌的研究較多，也較深入[5-6]。關(guān)于解磷真菌方面的研究相對(duì)較少，但因?yàn)槠渚哂薪饬啄芰?qiáng)的特點(diǎn)，一直也是研究的熱點(diǎn)[7]。對(duì)不同種類(lèi)解磷微生物溶磷效果的研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌、酵母、霉菌接種在不同磷源上時(shí)，表現(xiàn)出的溶磷能力不同[8-12]。解磷真菌在數(shù)量和種類(lèi)上都少于解磷細(xì)菌，但其解磷能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于解磷細(xì)菌，而且遺傳性狀更加穩(wěn)定[13]。因此，研究解磷真菌的解磷特性以及生物學(xué)特性，對(duì)促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育以及解磷真菌在農(nóng)學(xué)上的應(yīng)用有重要作用。本試驗(yàn)采集草坪根際土壤，對(duì)解磷菌進(jìn)行篩選并研究培養(yǎng)條件對(duì)菌株解磷效果的影響，同時(shí)對(duì)發(fā)酵液條件優(yōu)化組合進(jìn)行了研究，探討解磷真菌的最適生長(zhǎng)環(huán)境以及解磷的最適合條件。

1 材料與方法

1.1 供試樣品

采集內(nèi)陸鹽堿地草坪根際土壤，采用抖土法將收集的土樣放入密封袋內(nèi)立刻帶回實(shí)驗(yàn)室冷藏，備用。

1.2 培養(yǎng)基配方

1.2.1 基礎(chǔ)培養(yǎng)基

菌種初篩用的是有機(jī)磷固體培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基。（1）有機(jī)磷固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值7.0～7.5。（2）無(wú)機(jī)磷固體培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.2 保存培養(yǎng)基

菌種保存時(shí)用到的培養(yǎng)基為斜面培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 15 g，NaNO3 1 g，K2HPO4 0.5 g，KCl 025 g，MgSO4·7H2O 0.25 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.005 g，瓊脂 8 g，蒸餾水500 mL，自然pH值。

1.2.3 復(fù)篩培養(yǎng)基 菌種復(fù)培（純化）時(shí)用的培養(yǎng)基為有機(jī)磷液體培養(yǎng)基和無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基。（1）有機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 001 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，蒸餾水 1 000 mL，pH值 7.0～7.5。（2）無(wú)機(jī)磷液體培養(yǎng)基：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca3（PO4）2 5 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～7.5。

1.2.4 活化培養(yǎng)基

經(jīng)過(guò)觀察，獲知純化所得的菌種為真菌，所以活化時(shí)用到的培養(yǎng)基為PDA培養(yǎng)基，其配方為：葡萄糖 20 g，馬鈴薯（去皮）200 g，瓊脂15 g，蒸餾水1 000 mL，pH值自然。配制方法是將馬鈴薯去皮，切成小塊，于鍋中加水 1 000 mL，煮沸30 min，用雙層紗布過(guò)濾，取其濾液，之后加入葡萄糖和瓊脂，小火加熱并用玻璃棒不斷攪拌，至瓊脂完全溶解，并加水補(bǔ)足1 000 mL。

1.2.5 發(fā)酵培養(yǎng)基 發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的培養(yǎng)基為無(wú)機(jī)培養(yǎng)基和有機(jī)培養(yǎng)基。（1）有機(jī)培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，CaCO3 5 g，卵磷脂 0.2 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1 000 mL，pH 值7.0～75。（2）無(wú)機(jī)培養(yǎng)基配方：葡萄糖 10 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，MgSO4·7H2O 0.003 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.03 g，MnSO4·4H2O 0.01 g，Ca（PO4）2 5 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水1 000 mL，pH值 7.0～7.5。

以上培養(yǎng)基制作完成之后均在高壓滅菌鍋中，于 121 ℃、0.103 MPa條件下滅菌20 min。

1.2.6 發(fā)酵條件優(yōu)化組合

本試驗(yàn)中發(fā)酵條件優(yōu)化組合采用的是4因子（溫度、pH值、碳氮比、轉(zhuǎn)速）3水平的正交試驗(yàn)（表1），根據(jù)試驗(yàn)結(jié)果，綜合分析確定菌株生長(zhǎng)的最適條件。

1.3 菌株篩選

1.3.1 初篩

按照培養(yǎng)基配方與配量分別稱(chēng)取各藥品，取少于總量的水于燒杯中，將各培養(yǎng)基成分（瓊脂除外）逐一加入水中待溶；將玻璃杯放在石棉網(wǎng)上文火加熱，并不斷攪拌，使各藥品快速溶解，然后補(bǔ)充水分至所需配制培養(yǎng)基的量；用 1 mol/L 的NaOH調(diào)節(jié)pH值至7.0～7.5；將配制好的培養(yǎng)基分裝在錐形瓶?jī)?nèi)，加上棉塞包裝滅菌。高壓滅菌后倒平板，次日，將采集的土壤過(guò)篩磨細(xì)，稱(chēng)取10 g樣品，進(jìn)行梯度稀釋至1×10-7、1×10-8、1×10-9，分別滴加菌液于相應(yīng)編號(hào)的平板表面，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，用涂布器涂布均勻，20～30 min后倒置，并放于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)。每天觀察平板，并記錄菌落出現(xiàn)的日期、菌落解磷能力出現(xiàn)日期、菌落直徑d、解磷圈出現(xiàn)日期及直徑D。培養(yǎng)7 d后，得到解磷能力比較強(qiáng)的菌株進(jìn)行純化培養(yǎng)，將純化培養(yǎng)幾代的菌株進(jìn)行菌種保存。

1.3.2 復(fù)篩

采用液體發(fā)酵培養(yǎng)法，將解磷微生物培養(yǎng)在難溶性磷液體培養(yǎng)基上，按照配方配制液體培養(yǎng)基進(jìn)行高壓滅菌，在超凈工作臺(tái)上，按照無(wú)菌接種法，接種純化后的解磷真菌于發(fā)酵液中，置于搖床中，在30 ℃、120 r/min轉(zhuǎn)速條件下培養(yǎng)7 d，每天觀察發(fā)酵液的變化，并記錄菌絲球的出現(xiàn)日期、菌絲球顏色、目測(cè)其大小。發(fā)酵結(jié)束后，進(jìn)行發(fā)酵液有效磷測(cè)定。

1.3.3 生物學(xué)測(cè)定

本次試驗(yàn)采用察氏培養(yǎng)基進(jìn)行試驗(yàn)，其配方如下：碳源30 g，NaNO3 2 g，K2HPO4 1 g，KCl 0.5 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.01 g，瓊脂18 g，蒸餾水1 000 mL，自然pH值。

2 結(jié)果與分析

2.1 解磷真菌菌株篩選

通過(guò)菌種初篩和復(fù)篩，得到真菌菌株FL0908發(fā)酵液中的有效磷濃度為310.23 mg/L。真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）隨時(shí)間延長(zhǎng)而增大，菌株FL0908在4 d增幅最大，在生長(zhǎng)到5 d時(shí)，解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）趨于穩(wěn)定，菌株FL0908的D/d達(dá)到最大值1.96（表2）。

2.2 發(fā)酵培養(yǎng)性狀

通過(guò)觀察結(jié)果（表3）顯示，菌株FL0908的上清液較為透明，粗略判斷菌株FL0908的解磷能力較強(qiáng)。

2.3 培養(yǎng)條件對(duì)解磷能力的影響

2.3.1 不同碳源對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響 真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營(yíng)養(yǎng)條件下均能生長(zhǎng)，生長(zhǎng)趨勢(shì)基本一致，但是對(duì)葡萄糖的利用最好，對(duì)乳糖的利用最差（圖1）。不同碳源不僅對(duì)真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對(duì)菌絲體及菌落形態(tài)同樣產(chǎn)生較為顯著的影響。在葡萄糖培養(yǎng)基上，菌絲體較為粗壯，菌落濃密，在培養(yǎng)基背面產(chǎn)生較明顯的黑色次生代謝物；在蔗糖和乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出的菌絲比較稀疏，顏色亦較淺。

2.3.2 不同氮源對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響

不同氮源對(duì)真菌菌株FL0908生長(zhǎng)的影響較大（圖2）。真菌菌株FL0908在NaNO2上基本不生長(zhǎng)，在其他不同氮源培養(yǎng)基上均能生長(zhǎng)。其中在酵母浸膏上生長(zhǎng)過(guò)于迅速，在KNO3和NaNO3上能正常生長(zhǎng)。從整個(gè)過(guò)程來(lái)看，真菌菌株FL0908在酵母浸膏培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最好，在NaNO2培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差。不同氮源不僅對(duì)真菌菌株FL0908的菌落直徑影響較大，對(duì)其菌絲體及菌落形態(tài)同樣產(chǎn)生較為顯著的影響。真菌菌株FL0908在酵母浸膏和KNO3培養(yǎng)基上生長(zhǎng)出比較濃密的菌絲；在NaNO2培養(yǎng)基上菌落顏色比較淡，菌落外圍形成白色的生長(zhǎng)圈，而且菌絲變?yōu)楹谏钑r(shí)間更長(zhǎng)。

2.3.3 不同溫度對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響

真菌菌株FL0908在供試的4個(gè)不同溫度條件下均能生長(zhǎng)，但在不同溫度條件下的生長(zhǎng)狀況差異較顯著。在培養(yǎng)3 d內(nèi)，真菌菌株FL0908在 35 ℃ 條件下生長(zhǎng)最快，在20 ℃條件下生長(zhǎng)最差，在培養(yǎng)3 d后，35 ℃條件下的菌落生長(zhǎng)速率減慢；生長(zhǎng)到 4 d后，在30 ℃條件下生長(zhǎng)最好，在20 ℃條件下生長(zhǎng)最差（圖3）。不同溫度對(duì)真菌菌株FL0908的菌絲體及菌落形態(tài)影響不顯著，在溫度為25、30、35 ℃條件下菌絲都比較濃密，在20 ℃條件下菌落顏色比較淡。

2.3.4 不同pH值對(duì)真菌生長(zhǎng)的影響

真菌菌株FL0908在供試的4種pH值條件下均能生長(zhǎng)，在培養(yǎng)3 d內(nèi)，在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最快，菌落直徑達(dá)到28 mm；生長(zhǎng)到4 d時(shí)，pH值為5時(shí)菌落生長(zhǎng)速率最快；綜合整個(gè)過(guò)程來(lái)看，在pH值為6時(shí)生長(zhǎng)最好，在pH值為8時(shí)生長(zhǎng)最差（圖4）。pH值為5、6、7這3種酸堿度下真菌菌株FL0908的菌落形態(tài)基本無(wú)顯著差異，菌落濃密；pH值為8時(shí)生長(zhǎng)最差，顏色暗淡，菌落稀疏。

2.4 發(fā)酵條件研究

菌株FL0908不同試驗(yàn)組發(fā)酵液有效磷含量差異較大（表4）。酸堿度的極差最大，是影響發(fā)酵液有效磷含量的關(guān)鍵性因子，碳氮比極差最小，對(duì)發(fā)酵液有效磷含量影響較小。根據(jù)各試驗(yàn)因子的平均數(shù)可以看出：因素A選擇水平3，因素B選擇水平2，因素C選擇水平1，因素D選擇水平2，為最優(yōu)組合，即溫度為35 ℃，pH值為7，碳氮比為35 ∶1，轉(zhuǎn)速為 130 r/min。

3 結(jié)論

篩選獲得1株解磷特性比較好的真菌菌株FL0908，對(duì)其解磷能力進(jìn)行研究，真菌解磷圈直徑與菌落直徑比值（D/d）達(dá)到1.96。

真菌菌株FL0908在供試的4種碳源營(yíng)養(yǎng)條件下均能生長(zhǎng)，不同碳源條件下差異顯著，最適碳源為葡萄糖，而在乳糖培養(yǎng)基上生長(zhǎng)最差；對(duì)于所供4種氮源，在酵母浸膏上生長(zhǎng)過(guò)于迅速，在亞硝酸鈉條件下幾乎不生長(zhǎng)，最適氮源為酵母浸膏，硝酸鉀次之。

對(duì)于所供4種溫度，真菌均可生長(zhǎng)，菌株FL0908的最適溫度為30 ℃；在所供的4種pH值條件下可正常生長(zhǎng)，最適酸堿度為pH值為6。

對(duì)于試驗(yàn)中發(fā)酵液條件的優(yōu)化組合，真菌菌株FL0908最適解磷條件為：溫度35 ℃，pH值7，碳氮比35 ∶1，轉(zhuǎn)速130 r/min。

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