劉勝洪 周玲艷 楊妙賢 劉文 趙鋼

摘要：為了探究60Co-γ射線對紫花苜蓿誘變產(chǎn)生的微衛(wèi)星變異及其輻射敏感性，用2 000 Gy劑量的 60Co-γ 射線輻射處理紫花苜蓿WL525HQ的種子。紫花苜蓿WL525HQ在人工溫室栽培后，比較了輻照組和對照組之間各20個不同單株的簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）的多態(tài)性變化。結(jié)果表明：7對引物均可擴增出紫花苜蓿WL525HQ的多態(tài)性位點，其中有5對引物的多態(tài)性位點百分比達到100%。經(jīng)過計算該品種的多態(tài)性位點百分率（percentage of polymorphic band，PPB）值和多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）值發(fā)現(xiàn)，輻射組的PPB平均值達97.73%，略低于對照組的98.94%；而輻射組的PIC平均值為0.853 0，略高于對照組的0.849 2。說明 60Co-γ 射線使紫花苜蓿不同單株之間的SSR位點多態(tài)性產(chǎn)生了一定程度的變異，但也體現(xiàn)出WL525HQ品種對60Co-γ 射線具有較高的耐受力。

關(guān)鍵詞：紫花苜蓿；輻射；SSR；多態(tài)性；WL525HQ

中圖分類號： S335.2+1 文獻標志碼： A 文章編號：1002-1302（2015）07-0238-03

紫花苜蓿（Medicago sativa L.）屬多年生優(yōu)良豆科牧草，是世界上種植最多、應用較為廣泛、生產(chǎn)潛力大的重要牧草。由于紫花苜蓿具有適應性強、品質(zhì)好、產(chǎn)量高等優(yōu)點，素有“牧草之王”的美譽，在現(xiàn)代草業(yè)和畜牧業(yè)的可持續(xù)發(fā)展中占有重要地位[1]。

研究表明，通過空間誘變、零磁空間誘變、輻射誘變均可引起苜蓿DNA水平上的變異[2-3]，其中，60Co-γ輻射誘變是苜蓿育種的重要手段之一。60Co-γ射線具有能量高、穿透力強的特點，可造成DNA分子堿基變化、脫氧核糖變化、單鏈斷裂、雙鏈斷裂以及DNA交聯(lián)等，致使染色體發(fā)生變異，從而對苜蓿的某些性狀進行改良[4]。目前，苜蓿的誘變育種工作已經(jīng)在國內(nèi)外廣泛展開，苜蓿的輻射敏感性、育種的適宜劑量及其輻射誘變規(guī)律等工作成為各國學者普遍關(guān)注和研究的課題[5]。

與其他DNA分子標記相比，簡單重復序列（simple sequence repeat，SSR）標記具有數(shù)量豐富、信息含量高、重復性好等特點，并且SSR標記覆蓋整個基因組，呈現(xiàn)多基因特點，表現(xiàn)為共顯性遺傳[6-7]。因此本研究利用SSR分子標記技術(shù)可以在基因組范圍內(nèi)較廣泛地觀察紫花苜蓿的變異情況，對于苜蓿育種研究具有一定的指導意義。

1 材料與方法

1.1 輻照處理與種植

本試驗所用的材料為WL525HQ紫花苜蓿，在華大生物科技有限公司輻照中心進行60Co-γ輻射處理，輻射劑量為 2 000 Gy，對照組為未經(jīng)輻射處理。紫花苜蓿種子用0.1% HgCl2消毒5 min，然后用去離子水沖洗3次后播種于仲愷農(nóng)業(yè)工程學院鐘村教學農(nóng)場大棚內(nèi)。分別取20張輻照處理組、對照組植株的幼嫩葉片進行后續(xù)試驗。

1.2 DNA的提取及PCR擴增產(chǎn)物檢測

分別取輻照處理組、對照組苜蓿葉片0.1 g，放入研缽，加入約1 g石英砂、1.6 mL提取液[2%十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、15%聚乙烯吡咯烷酮-40、0.9% NaCl、 6.2% NaAc·3H2O、5% HAc]，提取方法采用十二烷基硫酸鈉法[8]，并通過1.2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA質(zhì)量。

采用9對穩(wěn)定性好、多態(tài)性高的 SSR 引物[9-11]（表1）進行擴增。擴增反應體系為：0.5 μL DNA樣品（30 ng），2 μL 10×buffer，1.2 μL MgCl2（25 mmol/L），0.5 μL dNTPs（10 mmol/L），04 μL上游引物（10 μmol/L），0.4 μL下游引物（10 μmol/L），1 μL Taq 酶（0.5 U/μL），15.6 μL雙蒸水。擴增程序為：95 ℃預變性 5 min；94 ℃變性 50 s，55～57 ℃退火 45 s，72 ℃延伸 50 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸 10 min。擴增產(chǎn)物采用含7 mol/L尿素的 6%變性聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，銀染檢測。

1.3 數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計

根據(jù)條帶的有無，在Excel表格上構(gòu)建0，1矩陣圖，多態(tài)性位點百分率（percentage of polymorphic band，PPB）按照以下公式計算：

多態(tài)性百分率=多態(tài)性位點數(shù)量/總位點數(shù)量×100%。

等位位點頻率的計算方法參考等位基因的頻率計算方法[12]：等位位點頻率p=位點數(shù)量/總位點數(shù)量。計算出等位位點頻率后，用Picalc軟件計算位點的多態(tài)性信息量（polymorphism information content，PIC）。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA的提取

本研究采用高鹽低pH值的SDS核酸提取法[8]。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果表明，點樣孔清晰無雜質(zhì)，基因組DNA條帶清晰完整（圖1）。紫外分光光度結(jié)果分析表明，樣品D320 nm值接近 0，D260 nm/D280 nm值在 1.85～1.98之間，說明提取的DNA 純度較高，符合 PCR擴增的要求。

2.2 PCR擴增產(chǎn)物的電泳檢測

用7對SSR引物對紫花苜蓿處理組、對照組的DNA進行PCR擴增。結(jié)果表明， 7對引物的主要擴增位點位于 100～200 bp之間，處理組和對照間的SSR位點發(fā)生了不同程度的變化，僅有少量片段未發(fā)生變化，如W6019引物擴增的位點在110 bp 處變化不明顯（圖2中的D1、D2）。從圖2中的A1、A2、B1、B2來看，引物Afca1、Afca11在輻射處理后SSR擴增帶數(shù)量未發(fā)生變化；從圖2中的D1、D2、F1、F2看，引物W6019、Alf2在輻射處理后SSR擴增帶數(shù)量出現(xiàn)增加，條帶位置有所改變；其余的3對引物在輻射處理后SSR擴增條帶數(shù)量均減少（圖2中的C1、C2、E1、E2、G1、G2）。

2.3 輻射處理苜蓿的多態(tài)性分析

通過PCR擴增結(jié)果進一步統(tǒng)計各個SSR位點的多態(tài)性，結(jié)果如表1所示。可見所使用的7對引物均可擴增出多態(tài)性位點，引物Afca1、Afca11在苜蓿輻射處理后的SSR擴增總位點數(shù)未發(fā)生變化；引物W6019、Alf2在苜蓿輻射處理后SSR擴增總位點數(shù)出現(xiàn)增加的現(xiàn)象，條帶位置有所改變；其余的3對引物在輻射處理后SSR擴增總位點數(shù)均減少。7對引物中有5對引物的多態(tài)性位點百分率達到100%。經(jīng)過計算苜蓿的PPB值、PIC值后發(fā)現(xiàn)，對照組的PPB平均值略高于輻射處理組，而對照組的PIC平均值略低于輻射處理組。說明 2 000 Gy 劑量的60Co-γ輻射對紫花苜蓿WL525HQ品種有一定的誘變作用，同時紫花WL525HQ對60Co-γ射線具有較高的耐受力。

3 結(jié)論與討論

紫花苜蓿是多年生豆科植物，其葉、莖均含有較多的蛋白質(zhì)、酚類、單寧等次生代謝物。因此，在提取苜?；蚪MDNA的時候，應該選取含有次生代謝產(chǎn)物較少的幼嫩葉片，比較有利于DNA的提取。高質(zhì)量DNA的提取是植物基因組研究的基礎(chǔ)[13]。本研究使用的高鹽低pH值的核酸提取方法能抑制或避免細胞內(nèi)各種物質(zhì)與核酸發(fā)生反應，有效去除核蛋白，抑制各種酶活性，適用多種植物中提取DNA和RNA[14]。本研究提取的DNA樣品中雖然存在少量RNA，但依然取得了較好的PCR擴增效果。

苜蓿是異花授粉植物，品種內(nèi)個體間基因型雜合，在種子繁育時通常采用開放式授粉，品種內(nèi)個體間相互傳粉造成個體間基因型不同[9]，有學者利用PL34HQ（南澳品系） 品種自交系進行SSR研究，發(fā)現(xiàn)苜蓿品種內(nèi)不同單株間存在多態(tài)性差異[15]。另外，各地農(nóng)業(yè)品種主管部門在苜蓿品種的選育過程中亦未將分子標記作為選育依據(jù)。因此，本研究對照組的不同單株間存在多態(tài)性差異。

目前，植物誘變育種主要利用化學誘變、紫外線誘變、輻射誘變、太空誘變等手段，對植物的種子、枝條、愈傷組織（離體培養(yǎng)）等進行誘變，均已證明可以引起植物微衛(wèi)星DNA發(fā)生變異[16]。利用誘發(fā)突變技術(shù)能夠誘發(fā)各種有用的基因突變，產(chǎn)生自然界稀有的或用常規(guī)方法較難獲得的新類型、新性狀、新基因。輻射誘變技術(shù)已成為我國科學工作者開創(chuàng)農(nóng)作物誘變遺傳改良的一種有效途徑[17]。

但是，不同作物或同種作物不同品種對誘變存在生理或遺傳的敏感差異。不同品種的一品紅的生理指標因輻射敏感性不同而隨輻射呈現(xiàn)完全不同的變化趨勢[18]；葉開玉等對4個獼猴桃品種輻照后的嫁接成活率、植株生長量的調(diào)查發(fā)現(xiàn)，隨輻射劑量的變化，獼猴桃的嫁接成活率及生長量在品種間差異較大[19]；章鐵等發(fā)現(xiàn)，蘭花在輻射后，突變體與對照品種之間有穩(wěn)定的分子多態(tài)性差異[20]；在對茄子[21]、甘藍型油菜[22]、大豆[23]、苜蓿[24]、茶樹[25]和芝麻[26]的誘變研究中發(fā)現(xiàn)，作物對誘變的敏感性可分為極敏感型、敏感型、中間型、遲鈍型4個類型[27]。通過本研究發(fā)現(xiàn)，紫花苜蓿WL525HQ品種在60Co-γ射線照射后，其微衛(wèi)星位點發(fā)生了一定程度的變異，但其具有較高的60Co-γ射線耐受力，屬輻照遲鈍型[24，27]。因此，在實際輻照育種過程中可選擇適當?shù)妮椪談┝?，以提高作物品種的成活率和變異率。

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