孫春亮 趙敬慧 劉月 蔡錦順
摘要:為了在臨床上快速、有效區(qū)分高低致病性PRRSV,參考GenBank發(fā)表的代表性毒株,根據(jù)高致病性毒株Nsp2基因上有30個(gè)氨基酸不連續(xù)缺失的特點(diǎn),設(shè)計(jì)并合成1對引物,擴(kuò)增高低致病性PRRSV Nsp2基因的目的條帶長度分別為644、734 bp,從而將二者區(qū)分開來。用本方法對長春及其周邊地區(qū)送檢60份病料進(jìn)行盲檢,檢出10份高致病性PRRSV。并與N蛋白基因引物RT-PCR診斷方法進(jìn)行比較,結(jié)果均一致,表明該方法準(zhǔn)確性高。本研究所建立的RT-PCR方法為PRRSV在臨床上的快速診斷和實(shí)驗(yàn)室流行病學(xué)調(diào)查提供了簡捷的技術(shù)手段。
關(guān)鍵詞:PRRSV;Nsp2基因;RT-PCR診斷;流行病學(xué)調(diào)查
中圖分類號: S858.28 文獻(xiàn)標(biāo)志碼: A 文章編號:1002-1302(2015)07-0226-02
2006年以來,中國南方部分地區(qū)豬場暴發(fā)高熱為特征的傳染性疾病,并逐漸蔓延擴(kuò)散到北方各地區(qū),給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。這種傳染性疾病后來被命名為豬繁殖與呼吸綜合征(PRRS),該病具有傳播速度快、發(fā)病率高、病死率高的特征,并且繼發(fā)感染鏈球菌等,與偽狂犬等病毒混合感染增加了臨床診斷的難度。因此,建立一種能夠快速,有效、準(zhǔn)確的檢測方法在 PRRS 的防控上具有重要意義。經(jīng)病原分離及分子流行病學(xué)分析,國內(nèi)流行的高致病性毒株主要是由1種帶有Nsp2基因部分缺失以及多個(gè)位點(diǎn)發(fā)生突變對豬呈高致病性的豬繁殖與呼吸綜合征病毒(PRRSV)。
PRRSV基因組毒株間具有較高的遺傳變異性,M蛋白在各毒株間比較保守,同型毒株間M蛋白序列同源性大于96%,歐洲、美洲型毒株間序列同源性在78%~81%之間[1];其次N蛋白保守性較高,歐洲、美洲型毒株間的同源性在59%~63%之間,同基因型毒株之間的同源性可達(dá) 96%~100%[2]。GP5、GP3、NSP2是容易發(fā)生變異的3個(gè)蛋白,其中GP5變異程度最大,歐洲、美洲型毒株間GP5同源性僅為52%~55%[3]其次為GP3,同一毒株間同源性為 86%~98%,2個(gè)基因型毒株間GP3氨基酸同源性為54%~ 60%,GP3多數(shù)變異發(fā)生在N末端,2個(gè)基因型GP3 N末端35個(gè)氨基酸殘基的一致性不到30%[4]。
在PRRSV基因組中非結(jié)構(gòu)蛋白NSP2變異程度最顯著,美洲型同型毒株間同源性約為80%,美洲型、歐洲型毒株間同源性僅為 40% 左右,NSP2 的中心區(qū)易變異,并且變異不僅表現(xiàn)為個(gè)別堿基的置換,還表現(xiàn)在缺失和插入上。 Gao等對PRRSV分離株HB-2 (sh)/2002的全基因序列測定分析表明,NSP2蛋白存在編碼12個(gè)氨基酸的連續(xù)36個(gè)核苷酸的缺失,這是國內(nèi)首次發(fā)現(xiàn)的NSP2蛋白存在缺失變異現(xiàn)象[5]。
本研究根據(jù) Nsp2基因序列設(shè)計(jì)引物,該引物包含 Nsp2基因缺失序列,分別對高致病和經(jīng)典毒株的基因片段進(jìn)行特異性擴(kuò)增,通過 RT-PCR 擴(kuò)增目的基因片段長度的不同可將二者區(qū)分開來。試驗(yàn)結(jié)果表明,新建立的RT- PCR 鑒別方法可以達(dá)到快速、簡捷、有效區(qū)分高致病性變異 PRRSV與經(jīng)典型PRRSV的目的。
1 材料與方法
參考GenBank上多株P(guān)RRSV毒株序列,利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)并合成1對引物,所設(shè)計(jì)這對引物覆蓋Nsp2基因整個(gè)缺失區(qū)域。由于高致病性PRRSV變異株與低致病株相比發(fā)生90個(gè)核苷酸的缺失,所以高致病性株和經(jīng)典株的預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物長度分別約644、734 bp。
上游引物:5′-CGAGCTTAAAGACCAGATGGAGGAG- 3′;下游引物:5′-CTTGAGCTGAGTATTTTGGGCGTGT- 3′。
按照Simply P 總RNA提取試劑盒說明書,分別對PRRSV CC-13分離株RNA基因組進(jìn)行提取,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。
臨床送檢樣品來源長春及周邊地區(qū)豬場疑似PRRS病死豬的組織病料(肺臟、脾臟、腎臟、子宮和淋巴結(jié)等),組織剪碎,在冰浴中勻漿,4 ℃靜置一段時(shí)間(0.5~1.0 h),10 000 r/min 離心10 min取上清,提取RNA。取病料上清液100 μL到滅菌1.5mL離心管中,按照RNA提取試劑盒說明書提取病料RNA,進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,制備cDNA,進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
將PRRSV (CC-13株)、PCV2、CSFV、PRV病毒用合成的F/R引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
用Marc-145細(xì)胞對PRRSV(CC-13株)進(jìn)行病毒效價(jià)滴定,計(jì)算病毒TCID50,經(jīng)測定病毒效價(jià)為105 TCID50/0.1 mL。然后依次稀釋成10 000、1 000、100、10、1、0.1、0.01 TCID50,提取病毒RNA并制備cDNA,用建立的RT-PCR方法進(jìn)行檢測。
對上述的敏感性和特異性試驗(yàn)重復(fù)3次,以檢驗(yàn)該方法的重復(fù)性情況。用建立的RT-PCR方法檢測臨床送檢樣品,鑒定結(jié)果與N蛋白基因引物RT-PCR鑒定結(jié)果進(jìn)行對比。
2 結(jié)果與分析
對PRRSV CC-13株、PCV2、CSFV、PRV進(jìn)行擴(kuò)增,結(jié)果只有PRRSV CC-13株出現(xiàn)預(yù)期結(jié)果擴(kuò)增出644 bp的目的片段,說明本方法特異性較好。根據(jù)擴(kuò)增片段大小判斷可知PRRSV CC-13株為高致病性PRRSV變異株,結(jié)果見圖1。自1996年首次確定PRRSV在中國存在以來,針對PRRSV建立了很多種檢測方法,主要包括普通RT-PCR、熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)RT-LAMP、ELISA、膠體金、免疫熒光試驗(yàn)等。其中就有高靈敏度的檢測方法如熒光定量RT-PCR、環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)等,但這些檢測方法價(jià)格高,操作技術(shù)要求嚴(yán),不適合用于普通臨床檢測。ELISA、膠體金等檢測方法操作容易,但檢測靈敏度與重復(fù)性又受到質(zhì)疑。簡單、快速、準(zhǔn)確的RT-PCR檢測方法成為目前診斷的主要方法。
經(jīng)1% 瓊脂糖凝膠電泳觀察,在0.01 TCID50處仍可看到特異性條帶,結(jié)果表明,本方法敏感度可達(dá)0.1 TCID50(圖2)。本方法具有很好的特異性,可以實(shí)現(xiàn)PRRSV的特異性擴(kuò)增;敏感性試驗(yàn)表明,該方法檢測的敏感度可達(dá) 0.1 TCID50,表明本方法的敏感性較高,可以較敏感地檢測到樣品中的PRRSV。重復(fù)性試驗(yàn)表明,重復(fù)3次檢測結(jié)果基本一致,說明本方法的重復(fù)性較好。
對上述的敏感性和特異性試驗(yàn)重復(fù)3次,陽性情況以及擴(kuò)增條帶大小情況與上述結(jié)果一致。
用本試驗(yàn)建立的RT-PCR方法,對長春及周邊送檢的60份病料進(jìn)行盲檢,結(jié)果有10份病料為陽性,與研究中用針對N蛋白基因的引物進(jìn)行RT-PCR檢測結(jié)果相一致。從圖3可看出,上述部分樣品中分別位于5、9、11的3個(gè)樣品的擴(kuò)增片段約為644 bp片段,與圖4中N蛋白基因引物鑒定結(jié)果基本一致,并且可以判斷出這3個(gè)陽性樣品為高致病性PRRSV毒株。本試驗(yàn)所建立的RT-PCR鑒別診斷方法,它不僅能夠?yàn)榱餍胁W(xué)研究提供輔助手段和方法,而且還能夠?yàn)榱餍胁W(xué)研究指引方向,在辨明毒株的類型前提下,可以有的放矢地開展相關(guān)研究。
3 結(jié)論
建立一種快速、準(zhǔn)確區(qū)分高致病性PRRSV與低致病性PRRSV的RT-PCR方法,通過驗(yàn)證該方法可以應(yīng)用于臨床診斷,快速鑒別出高低致病性PRRSV毒株。
參考文獻(xiàn):
[1]Meng X J,Paul P S,Halbur P G,et al. Phylogenetic analyses of the putative M (ORF 6) and N (ORF 7) genes of porcine reproductive and respiratorysyndromevirus(PRRSV):implicationfortheexistence of two genotypes of PRRSV in the U.S.A. and Europe[J]. Archives of Virology,1995,140(4):745-755.
[2]Magar R,Larochelle R,Dea S,et al. Antigenic comparison of Canadian and US isolates of porcine reproductive and respiratory syndrome virus using monoclonal antibodies to the nucleocapsid protein[J]. Canadian Journal of Veterinary Research-Revue Canadienne de Recherche Veterinaire,1995,59(3):232-234.
[3]Suárez P,Zardoya R,Martín M J,et al. Phylogenetic relationships of European strains of porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) inferred from DNA sequences of putative ORF-5 and ORF-7 genes[J]. Virus Research,1996,42(1/2):159-165.
[4]Murtaugh M P,Elam M R,Kakach L T. Comparison of the structural protein coding sequences of the VR-2332 and Lelystad virus strains of the PRRS virus[J]. Archives of Virology,1995,140(8):1451-1460.
[5]Gao Z Q,Guo X,Yang H C. Genomic characterization of two Chinese isolates of porcine respiratory and reproductive syndrome virus[J]. Archives of Virology,2004,149(7):1341-1351.