姚文杰，辛梅華，李明春，方江海

（華僑大學(xué)材料科學(xué)與工程學(xué)院，環(huán)境友好功能材料教育部工程研究中心，福建 廈門 361021）

近年來，可明顯提高藥物體內(nèi)半衰期，增強藥物靶向性及療效的聚乙二醇（PEG）化隱形納米膠束逐漸受到人們的重視[1]。PEG化隱形納米膠束是在PEG化的基礎(chǔ)上降低膠束粒徑至100nm左右，從而進一步降低網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)對其識別和攝取能力，延長在血液循環(huán)滯留時間[2-3]。 Praneet等[4]制備了N-鄰苯二甲?；?3-mPEG-殼聚糖自組裝納米膠束，并以喜樹堿為模型藥物研究了藥物包埋和釋放行為。結(jié)果表明，在pH值為7.4的PBS模擬液中該聚合物具有較高穩(wěn)定性和藥物緩釋性能，膠束平均粒徑為200～267nm。Wang等[5]利用十八烷基季胺化賴氨酸對殼聚糖改性后（OQLS），分別接枝mPEG和FA（葉酸），制得mPEG-OQLS和FA-OQLS。將兩者混合形成了具有主動靶向的隱形納米微囊，其平均粒徑達160nm，但產(chǎn)物僅溶于氯仿不溶于水，無法應(yīng)用于疏水藥物的包載。因此制備能水溶的PEG化雙親性聚合物膠束成為當(dāng)前研究的熱點。

李昆等[6]制備了水溶雙親性N-辛基化-N-mPEG化殼聚糖，并對產(chǎn)物包覆量子點進行研究，發(fā)現(xiàn)聚合物納米粒子為球形，且分布較為均一，粒徑為200nm左右。Jong等[7]制備了PEG化聚天冬酰胺衍生物，在PBS模擬液中pH值為7.4時，膠束穩(wěn)定性高且具有緩釋性能，在pH值為6.5時，出現(xiàn)突釋現(xiàn)象，該研究為實現(xiàn)藥物在人體的主動靶向釋放提供了可能性。作者課題組[8]曾制備高取代度的N,N-雙十二烷基殼聚糖，能溶于氯仿和四氫呋喃。烷基鏈取代度增加，載藥量增加，臨界膠束濃度和膠束粒徑減小[9-10]。但高取代N,N-雙烷基殼聚糖的疏水性強，而mPEG羧基化和鹵化改性在殼聚糖的羥基上接枝率低[6，11]，不易形成水溶性雙親性衍生物。為此，本文提出一種新的方法，將mPEG經(jīng)氯乙酸羧化改性后，通過酰化反應(yīng)接枝到雙烷基殼聚糖的羥基上，制備出高接枝度N,N-雙烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）水溶性衍生物，合成路線見圖1，并以酮洛芬為疏水模型藥物，對產(chǎn)物在水中的自組裝行為進行研究，為其在疏水藥物增溶中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

FD-1B-50型冷凍干燥機（博醫(yī)康實驗儀器公司）；FLS920型全功能穩(wěn)態(tài)/瞬態(tài)熒光光譜儀（Edinburgh Instruments）；Nexusu 470 型傅里葉變換紅外光譜儀（Nicolet）；Bruker Avance III 型（500 MHz）核磁共振波譜儀（Bruker）；Vario MICRO元素分析儀（Elementar）；ZEN3600納米激光粒度及zeta電位分析儀（malvern）。

殼聚糖（CS，Mw=50kDa，DD=90.95%），浙江澳興生物科技有限公司；月桂醛（95%），二氯亞砜（99%），聚乙二醇單甲醚（mPEG，Mn= 1000Da），阿拉丁試劑；十二烷基磺酸鈉（SDS），NaBH4（99%），上海國藥集團；氯乙酸（99%），天津市光復(fù)精細化工研究所；酮洛芬（KP），武穴市迅達藥業(yè)；其他試劑均為市售分析純。

1.2 mPEG-COOH的合成

[12]方法，將10.0g mPEG溶于40mL 20% NaOH溶液中，攪拌1h，緩慢滴加氯乙酸水溶液（4.7g氯乙酸溶于5mL水中），60℃反應(yīng)6h。用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH值至中性，旋蒸除水，得白色固體。干燥，乙醚洗滌，再將產(chǎn)物溶于少量氯仿中，冰乙醚沉析，抽濾得目標(biāo)產(chǎn)物mPEG-COOH。

圖1 PEDLCS的合成路線

1.3 N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖的合成

首先采用作者課題組方法[8]合成油溶性的N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS）。再參考文獻[13]方法，將7g mPEG-COOH溶于20mL氯仿中，冰浴下攪拌0.5h，回流管上接干燥管，緩慢滴加2mL二氯亞砜1h。再滴加DLCS的氯仿溶液（0.5g DLCS溶于20mL氯仿中），室溫反應(yīng)1h后60℃反應(yīng)7h。旋蒸除氯仿后溶于丙酮，過濾，濾液濃縮后的產(chǎn)物溶于水，用透析袋在蒸餾水中充分透析，冷凍干燥得產(chǎn)物N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）。

1.4 PEDLCS載酮洛芬膠束的制備

參考文獻[10]的方法，準確稱取0.1gN,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖溶解于50mL pH值為7.4的PBS緩沖溶液中，平均分成5份。100mg酮洛芬溶于3mL乙醇中，按一定比例量取酮洛芬（KP）溶液分別加入上述PEDLCS水溶液中，室溫超聲30min，蒸餾水透析12h。12000r/min離心10min，0.45μm濾膜過濾，濾液凍干至恒重得載藥膠束粉末，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 載藥量和包封率測定

取1.4節(jié)制備的載酮洛芬膠束溶于1mL的PBS緩沖溶液中。移取0.2mL膠束溶液于10mL容量瓶中，乙醇定容，12000r/min離心10min，取上清液在260nm測定吸光值A(chǔ)，根據(jù)酮洛芬乙醇溶液的線性方程A=72.902C+0.0205（R2=0.9994），C為酮洛芬膠束濃度，單位mg/mL，線性范圍0～0.025 mg/mL，求得膠束內(nèi)酮洛芬的質(zhì)量。計算包封率和載藥量。

式中，m1為加入的KP總質(zhì)量；m2為膠束內(nèi)KP的質(zhì)量；m為載體的質(zhì)量。

2 結(jié)果與討論

2.1 產(chǎn)物的表征

2.1.1 產(chǎn)物的FTIR分析

圖2 合成產(chǎn)物的FTIR圖

采用KBr壓片法，測得N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS）、聚乙二醇單甲醚（mPEG）、羧化改性聚乙二醇單甲醚（mPEG-COOH）、N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）的紅外光譜如圖2所示。圖中b、c分別為mPEG和mPEG- COOH的FTIR譜圖，2870cm-1附近的吸收峰為聚 乙二醇重復(fù)單元（—CH2—CH2—O—）中C—H的伸縮振動峰，1100cm-1附近為mPEG中醚鍵C—O—C的伸縮振動峰；c與b相比，1723cm-1附近出現(xiàn)了羧基中的C=O伸縮振動峰[15]，說明mPEG已羧化改性。 a、d分別為DLCS和PEDLCS的FTIR譜圖，d與a相比，d在2928cm-1、2860cm-1和721cm-1處出現(xiàn)同樣的特征吸收峰，2928和2860cm-1處為甲基和亞甲基的C—H伸縮振動峰，721cm-1為n≥4的(CH4)n基團的骨架振動峰，說明長鏈烷基已接到殼聚糖上[8]。且b與d相比，d在1636cm-1、1458cm-1、1350cm-1和1100cm-1處出現(xiàn)了mPEG骨架的特征峰[11]，說明mPEG已接枝到DLCS上得到目標(biāo)產(chǎn)物。

2.1.2 產(chǎn)物的1H NMR分析

圖3 PEDLCS的1H NMR圖

以D2O為溶劑測得PEDLCS的1H NMR圖如圖3，其中δ3.44～3.89為殼聚糖骨架上H3、H4、 H5、H6的質(zhì)子峰。δ2.32為十二烷基與氨基相連的亞甲基的質(zhì)子峰，δ1.2附近為十二烷基上亞甲基的質(zhì)子峰，δ0.81為十二烷基的甲基質(zhì)子峰，說明長鏈烷基已經(jīng)接到殼聚糖的氨基上[5]。δ3.29為—O—CH3(d)中H(d)的質(zhì)子峰，δ3.62為—CH2—CH2(e)—O—CH2—中H(e)的 質(zhì) 子 峰，δ4.28為CH3O(CH2CH2O)z+1CH2(f)CO—中H(f)的質(zhì)子峰，說明mPEG已經(jīng)接枝到雙烷基殼聚糖上[15]。由1H NMR譜圖進一步說明已合成了目標(biāo)產(chǎn)物PEDLCS。

2.1.3 產(chǎn)物的取代度測定

產(chǎn)物的元素分析及由C/N 摩爾比計算取代度[9]結(jié)果見表1。殼聚糖的脫乙酰度為90.95%，十二烷基取代度為1.89，烷基鏈取代度是已報道[9-10]的兩親性烷基殼聚糖衍生物的近2倍 ，疏水鏈取代度高有利于形成粒徑較小的聚合物膠束[10]。mPEG接枝率為1.63，與文獻報道的16.5%[4]和29%[11]mPEG相比，接枝度有較大的提高，mPEG的接枝率高可以增加產(chǎn)物的親水能力使產(chǎn)物溶于水，并且大量mPEG的存在保障了所形成載藥膠束的長循環(huán)功 能[1]。

2.1.4 產(chǎn)物的溶解性試驗

稱取0.1g產(chǎn)物于100mL溶劑中，觀察溶解情況，結(jié)果見表2。殼聚糖（CS）只有在弱酸性條件下可以溶解，這是由于殼聚糖分子內(nèi)和分子間的氫鍵作用。N,N-雙十二烷基殼聚糖（DLCS） 只溶于四氫呋喃和氯仿而不溶于水，N,N-雙十二烷 基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）不僅能溶于酸性、中性和堿性水溶液中，而且能溶于除乙醚之外 的大部分有機溶劑，可見mPEG鏈的高接枝率拓寬了目標(biāo)產(chǎn)物PEDLCS的溶解性能，是一種少有的兩親性聚合物。

表1 產(chǎn)物的元素分析結(jié)果及取代度

表2 原料及產(chǎn)物的溶解性

2.2 產(chǎn)物的載藥性能以及載藥膠束的pH值響應(yīng)性

2.2.1 臨界膠束濃度

以芘為熒光探針，采用穩(wěn)態(tài)熒光法測定N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）的臨界膠束濃度（CMC）[14]。配制一系列含不同濃度芘的PEDLCS水溶液，選擇激發(fā)波長335nm，掃描范圍350～450nm，狹縫寬度0.6nm測其穩(wěn)態(tài)熒光光譜，進一步計算并繪制lgC～I372/I383關(guān)系曲線如圖4所示。分段做曲線的切線，切線的交點對應(yīng)的濃度即為PEDLCS的CMC值0.1170 mg/mL，比文獻[4]報道的mPEG化殼聚糖基藥物載體材料的CMC值28μg/L小，CMC值小有利于在體內(nèi)循環(huán)被稀釋時膠束的穩(wěn)定存在。

2.2.2 載藥膠束粒徑、Zeta電位及包封率和載藥量的測定

按照實驗部分1.4節(jié)操作，制備N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖自組裝載酮洛芬膠束。測得不同KP/PEDLCS投料比的PEDLCS載藥膠束的載藥量、包封率、粒徑和Zeta電位見表3，可見隨著KP/PEDLCS投料比從0.6∶1增大到1.4∶1，包封率從79.85%下降到45.88%，載藥量從32.39%增大到39.11%。載藥膠束的粒徑隨著載藥量增大呈現(xiàn)先減小再增大的趨勢，Zeta電位的絕對值都在30 mV左右，說明載藥膠束都具有良好的穩(wěn)定性。粒徑較小有利于實現(xiàn)膠束在體內(nèi)的隱形性，達到長循環(huán)，因此選擇最佳KP/PEDLCS投料比0.8∶1制備載藥膠束，平均粒徑為155.1nm，此時包封率為65.78%，載藥量為34.48%；與文獻報道的200～267nm[4]、220.2nm[15]和167.5nm[5]相比具有較小的 粒徑。可見，引入mPEG親水基團不僅使產(chǎn)物可以形成穩(wěn)定膠束，對KP有較高的包封率和載藥量，而且形成的聚合物膠束粒徑較小，有望成為殼聚糖基隱形納米膠束。

圖4 芘的熒光發(fā)射強度比（I372/I383）與 PEDLCS濃度關(guān)系曲線

表3 PEDLCS載酮洛芬聚合物膠束的性能參數(shù)

2.2.3 載藥膠束在不同pH值條件下的響應(yīng)性

采用KP/PEDLCS質(zhì)量比為0.8∶1，按照1.3節(jié)制得的載藥膠束具有良好的pH值響應(yīng)性。在pH值5.5時膠束呈絮凝狀，緩慢滴加PBS緩沖溶液，隨著pH值的逐漸增大，在6.0左右凝聚物快速消失，繼續(xù)增大pH值膠束呈現(xiàn)透明狀；再次調(diào)節(jié)pH＜6.0時，凝聚物又迅速出現(xiàn)，可見PEDLCS載藥膠束呈現(xiàn)出較優(yōu)越的pH值敏感性。這可能是由于產(chǎn)物中氮雙烷基的存在，在pH值7.4～5.5反復(fù)調(diào)節(jié)時，聚合物膠束質(zhì)子化和去質(zhì)子化作用的結(jié) 果[7]。

把KP/PEDLCS=0.8∶1制得的載藥和空白膠束復(fù)溶于不同pH值的PBS溶液中，用納米激光粒度及Zeta電位分析儀測定粒徑和Zeta電位，結(jié)果見表4?？梢?，隨著pH值從7.4降低到6.5，空白膠束粒徑變大，粒徑分散指數(shù)從0.155增大到0.359，Zeta電位的絕對值降低；載藥膠束的粒徑由158.4nm增大到345.8nm，粒徑分布由單峰變成雙峰（圖5），粒徑隨pH值降低而增大，并且Zeta電位的絕對值由31.5降低到7.95。以上實驗說明隨著pH值的降低，載藥膠束和空白膠束的穩(wěn)定性降低，粒徑有增大的趨勢，PEDLCS具有pH值響應(yīng)性，其響應(yīng)范圍符合癌細胞微環(huán)境（pH值7.2～6.0）[16]。

表4 不同pH值條件下空白膠束和載藥膠束的性能參數(shù)

圖5 載藥膠束在pH值為7.4(a)和6.5(b)的粒徑分布

3 結(jié) 論

mPEG先用氯乙酸羧化改性，再通過?；磻?yīng)接枝到雙烷基殼聚糖上，制得高取代度的N,N-雙十二烷基-3,6-O-mPEG-殼聚糖（PEDLCS）衍生物，其中烷基取代度為1.89，mPEG接枝度為1.63。PEDLCS溶于水和除乙醚外的大部分有機溶劑，在水溶液中能自組裝形成粒徑較小的穩(wěn)定膠束，較小的粒徑和較高的mPEG接枝度有利于實現(xiàn)膠束在人體的長循環(huán)，從而達到隱形性。pH值響應(yīng)范圍符合癌細胞微環(huán)境（pH值7.2～6.0），有望成為具有pH值響應(yīng)主動靶向的隱形納米膠束。

參 考 文 獻

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