崔曉博，劉旭，馬守棟，李明春

納米銀凝膠無菌檢查的直接接種法及對抑菌成分的干擾排除效果

崔曉博，劉旭，馬守棟，李明春＊

無菌檢查；納米銀凝膠；直接接種法

納米銀［1，2］由于體積及其微小，表面活性位置多，穿透力強，易于進入多種病原體的內(nèi)部，從而達到破壞病原體，促進傷口愈合的作用。納米銀對細菌、真菌等都具有較強而持久的抑制作用，且不易產(chǎn)生耐藥。納米銀凝膠是筆者所在醫(yī)院開發(fā)研制的新劑型，由硝酸銀和卡波姆組成，主要用于治療燒燙傷，控制創(chuàng)面感染。《中國藥典》2010版二部附錄凝膠藥項下規(guī)定用于燒傷或嚴重創(chuàng)傷的凝膠藥，經(jīng)無菌檢查法［3］檢查，應符合規(guī)定。此凝膠中含有大量賦形劑等高分子物質(zhì)［4］，這些物質(zhì)不易通過過濾膜，因此本品不宜采用薄膜過濾法，其無菌檢查應選用直接接種法，同時去除其抑菌成分對無菌檢查的干擾。

1　材料與方法

1.1儀器電熱恒溫水箱；SW-CJ-1F單人雙面凈化臺；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱；生化培養(yǎng)箱。

1.2培養(yǎng)基硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，改良馬丁培養(yǎng)基，營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，玫瑰紅鈉培養(yǎng)基，無菌蛋白胨水溶液，0.9%無菌氯化鈉溶液。

1.3菌種實驗菌株為白色念珠菌［CMCC（F）98001］，黑曲霉［CMCC（F）98003］，銅綠假單胞菌［CMCC（B）10104］，金黃色葡萄球菌［CMCC（B）26003］，枯草芽孢桿菌［CMCC（B）63501］，生孢梭菌［CMCC（B）64941］，大腸埃希菌［CMCC（B）44102］，均由中國藥品生物制品檢定所提供。

1.4供試品納米銀凝膠（20 g/支，批號：20140310、20140311、20140312）

2　驗證方法

2.1菌液的制備接種金黃色葡萄球菌，銅綠假單胞菌，枯草桿菌的新鮮培養(yǎng)物至營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，接種生孢梭菌的新鮮培養(yǎng)物至硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基中，30～35℃培養(yǎng)18～24 h；接種白色念珠菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)24～48 h，上述培養(yǎng)物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含菌數(shù)＜100 cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基上，23～28℃培養(yǎng)5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫。然后，采用適宜的方法吸出孢子懸液至無菌試管內(nèi)，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1 ml含孢子數(shù)＜100 cfu的孢子懸液［4］。菌數(shù)的計算應用平板法，結果見表1。

表1　菌液培養(yǎng)結果

2.2培養(yǎng)基的靈敏度檢查取9支每管裝量為12 ml的硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌、生孢梭菌各2支，另1支不接種作為空白對照，培養(yǎng)3 d；取每管裝量為9 ml的改良馬丁培養(yǎng)基5支，分別接種＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種作為空白對照，培養(yǎng)5 d。逐日觀察，培養(yǎng)的3～5 d中，空白對照管無菌生長，加入菌液管中細菌生長良好，判定該批硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基的靈敏度檢查符合規(guī)定。

2.3培養(yǎng)基的無菌性檢查取兩種培養(yǎng)基各5瓶，分別放置在各自的培養(yǎng)溫度下空白培養(yǎng)14 d，空白培養(yǎng)管均無菌生長。判該批硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、改良馬丁培養(yǎng)基的無菌性檢查符合規(guī)定。

2.4供試品溶液的制備取納米銀凝膠供試品4支（批號20140310），全部加至400 ml無菌氯化鈉蛋白胨中，攪拌使其完全溶解，作為供試品溶液。

2.5方法驗證試驗

2.5.1驗證方法一取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基8瓶（100 ml/瓶），分別接種＜100 cfu的金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、枯草桿菌、生孢梭菌各2瓶，取改良馬丁培養(yǎng)基4瓶，分別接入＜100 cfu的白色念珠菌、黑曲霉各兩瓶，其中一瓶接入供試品10 ml，另一瓶做對照。結果見表2。

2.5.2驗證方法二硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的用量改為150 ml/瓶，其他操作同方法一，結果見表3。

2.5.3驗證方法三硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的用量改為200 ml/瓶，其他操作同方法一，結果見表4。

3　無菌檢查

取3批樣品，供試品的制備同驗證試驗，每批供試品取硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基4瓶，其中兩瓶接入供試品10 ml，置30～35℃培養(yǎng)；一瓶接入無菌氯化鈉蛋白胨10 ml，置30～35℃培養(yǎng)，作為陰性對照；一瓶接入供試品10 ml和＜100 cfu的金黃色葡萄球菌1 ml［5］，置30～35℃培養(yǎng)，為陽性對照。取改良馬丁培養(yǎng)基3瓶，兩瓶接入供試品10 ml，置30～35℃培養(yǎng)；一瓶接入無菌氯化鈉蛋白胨10 ml，置30～35℃培養(yǎng)，作為陰性對照。

表2　驗證試驗結果（方法一）

表3　驗證試驗結果（方法二）

表4　驗證試驗結果（方法三）

4　結果

方法驗證結果見表2、3、4。三批供試品及陰性對照組培養(yǎng)14 d均未有菌生長，陽性對照組培養(yǎng)3 d，細菌生長良好。

5　討論

薄膜過濾法是檢查含抗菌成分藥物的一般方法，但納米銀凝膠中含大量的卡波姆，不易通過過濾膜，因此采用直接接種法對其進行檢查。但納米銀具有抑菌作用，在驗證方法一中，供試品組中細菌的生長相較于陽性對照組明顯較弱，說明納米銀對細菌的生長有抑制作用；在驗證方法二中，加大培養(yǎng)基的用量，減弱了納米銀凝膠的抑菌作用，但供試品組的細菌生長仍弱于陽性對照組；方法三中，繼續(xù)加大培養(yǎng)基的用量，每天進行密切觀察發(fā)現(xiàn)供試品組的細菌長勢與陽性對照組的細菌長勢基本相同，說明此方法中培養(yǎng)基用量可完全去除納米銀凝膠的抑菌作用。

所以在納米銀凝膠的無菌檢查中，筆者采用直接接種法并加大培養(yǎng)基的用量去除其抑菌作用以達到良好的效果。【參考文獻】

［1］施暢，徐麗明，邵安良.納米銀的毒理學研究現(xiàn)狀［J］.藥物分析雜志，2013，33（12）：2025-2033.

［2］孫倩，李明春，馬守棟.納米銀抗菌活性及生物安全性研究進展［J］.藥學研究，2013，32（2）：103-105.

［3］中華人民共和國藥典［S］.二部.2010版：附錄.

［4］丁有學，劉蘭，畢華，等.堿性成纖維細胞生長因子凝膠的無菌檢查［J］.中國藥事，2013，27（9）：932-934.

［5］江志杰，劉文杰，高春，等.左氧氟沙星注射液無菌檢查方法驗證［J］.中國藥品標準，2008，9（4）：245-247. ［2015-03-08收稿，2015-04-07修回］

［本文編輯：吳蓉］

R318.08

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