李國樹，崔國全，羅順聰，徐成東

（1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物資源開發(fā)與利用研究所，云南 楚雄 675000）

大花蕙蘭叢生芽的高頻誘導因素研究*

李國樹1、2，崔國全1，羅順聰1，徐成東1、2

（1.楚雄師范學院化學與生命科學學院，云南 楚雄 675000；2.滇中高原生物資源開發(fā)與利用研究所，云南 楚雄 675000）

摘要：為研究影響大花蕙蘭叢生芽的高頻誘導因素，以大花蕙蘭無菌原球莖進行叢生芽苗的誘導、再生及生根因素正交試驗研究。結(jié)果表明：在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10g/L的培養(yǎng)中，誘導率高達75.1%，叢生芽苗生長健壯；在1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培養(yǎng)基中誘導的叢生芽數(shù)量最多，達5.13倍；6-BA、NAA對大花蕙蘭叢生芽的誘導及增殖作用顯著；原球莖是誘導大花蕙蘭叢生芽的有效方式。

關(guān)鍵詞：大花蕙蘭原球莖；叢生芽苗；正交試驗；誘導率

大花蕙蘭 （Cymbidium hybridum）屬蘭科植物，因其植株強健、葉片舒展、花大、花色多樣、花期長等特點，深受人們喜愛。但由于大花蕙蘭很難進行種子繁殖［1］和分株繁殖［2-3］，現(xiàn)在多以組培繁殖為主。章鵬程等［4］研究6-BA與NAA濃度梯度配比對大花蕙蘭外植體的誘導、增殖及分化研究；李杰等［5］應(yīng)用不同濃度的2，4-D、萘乙酸 （NAA）和激動素 （KT）對大花蕙蘭莖段愈傷誘導研究；趙穎等［6］對花蕙蘭幼根和根兜誘導原球莖，研究表明根兜比嫩根分化率高。以上研究利用大花蕙蘭的莖尖、莖段和根系進行研究［4-6］，對大花蕙蘭的類原球莖誘導叢生芽苗高頻快繁因素未見報道，因此，本課題用大花蕙蘭無菌的類原球莖為材料，研究6-BA、NAA、蔗糖和瓊脂對大花蕙蘭叢生芽的高頻快繁體系，為實現(xiàn)大花蕙蘭由類原球莖分化為叢生芽的快速繁殖體系提供參考。

1.　材料與方法

1.1材料與培養(yǎng)條件

1.1.1材料：供試材料為化生學院組培室保存的大花蕙蘭 （品種：HERO）無菌原球莖，生長期均為4周齡，見圖1。

圖1　大花蕙蘭的原球莖

圖2　原球莖誘導叢生芽苗比較圖

1.1.2培養(yǎng)條件：培養(yǎng)基30ml/瓶。接種后黑暗培養(yǎng)7d，再置于光照強度2500Lx，光照時間12h/d，培養(yǎng)溫度25±2℃的培養(yǎng)室內(nèi)培養(yǎng)。

1.2方法

1.2.1原球莖選擇與處理

接種時從原球莖團上切取單個大小一致的類原球莖，每瓶接種3點，每組5瓶，每組重復三次實驗。

1.2.2原球莖誘導叢生芽的因素篩選

以原球莖上誘導出的叢生芽數(shù)量為標準，將大小一致的單個原球莖接種于1/2 MS+瓊脂8g/ L+活性炭1.0g/L的基本培養(yǎng)基中，以NAA、6-BA及蔗糖用量為變量進行正交設(shè)計篩選。正交設(shè)計與接種培養(yǎng)結(jié)果見表1。

1.2.3誘導叢生芽苗的高頻增殖因素篩選

以叢生芽的增殖倍數(shù)為指標，將誘導出來的叢生芽接種于以1/2 MS+活性炭1.0g/L為基本培養(yǎng)基，以NAA、6-BA、蔗糖、瓊脂為研究因素進行大花蕙蘭叢生芽苗的高頻增殖誘導實驗設(shè)計篩選。正交設(shè)計與接種培養(yǎng)結(jié)果見表2。

1.2.4誘根培養(yǎng)

為研究各增殖因素對叢生芽苗誘導根系的影響，待各處理組分化產(chǎn)生的叢生芽苗長至株高2～3cm時，接種于MS+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L的基本培養(yǎng)基中，用不同濃度的NAA和培養(yǎng)溫度作對照，培養(yǎng)50d后統(tǒng)計叢生芽苗的生根效果。

1.3數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法

接種培養(yǎng)后50d統(tǒng)計結(jié)果：

叢生芽苗誘導率 （%）=（形成叢生芽的外植體個數(shù)/外植體總數(shù)）×100%；

叢生芽苗的增殖率=產(chǎn)生叢生芽的原球莖數(shù)量/接種原球莖的數(shù)量；

試驗數(shù)據(jù)利用SPSS軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計及分析。

2.　結(jié)果與分析

2.1誘導叢生芽的因素篩選結(jié)果

將大小一致的單個原球莖接種于原球莖誘導叢生芽的因素篩選培養(yǎng)基中，每隔5d進行培養(yǎng)管理，50d統(tǒng)計形成叢生芽的數(shù)量，統(tǒng)計結(jié)果如表1，大花蕙蘭叢生芽苗生長情況見圖2。

表1　原球莖誘導叢生芽苗試驗因素與結(jié)果統(tǒng)計表

由表1可見：各組處理誘導的叢生芽苗的數(shù)量有一定差異，最少為52株、最多的達77株。即：處理組8（各因素的組合式A3B2C1即：1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L）誘發(fā)的叢生芽數(shù)量最多，達5.13倍 （77/15），經(jīng)極差分析：RA＞RC＞RB，影響大花蕙蘭原球莖誘導叢生芽的主次順序依次為：6-BA＞蔗糖＞NAA，碳水化合物過多過少均不利于叢生芽的誘導。

從叢生芽的出現(xiàn)時間來看：通過觀察，處理組8（各因素的組合式A3B2C1）接種9d后即有少量叢生芽苗出現(xiàn)，50d得到的叢生芽苗生長翠綠、大小勻稱。

2.2叢生芽苗增殖培養(yǎng)因素的篩選結(jié)果

將誘導出來的叢生芽接種于不同取量的6-BA、NAA、蔗糖的培養(yǎng)基上，接種50d后統(tǒng)計叢生芽的數(shù)量與褐變率，結(jié)果如表2。

表2　叢生芽苗的增殖篩選因素設(shè)計與結(jié)果統(tǒng)計表

由表2可知：最適合大花蕙蘭叢生芽苗增殖的配方是組合3，即A2B2C2D2組合 （1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10g/L）。經(jīng)極差分析可知：RA＞RB＞RC＞RD，說明在叢生芽苗增殖過程中生長素NAA起主要影響作用，其次是細胞分裂素6-BA和蔗糖，影響因素最小的是瓊脂。并且在試驗中大花蕙蘭叢生芽苗的增殖褐化率與激素用量有關(guān)，激素用量越大，褐化率越高。

2.3試管苗生根培養(yǎng)基篩選結(jié)果

待各處理組叢生芽苗長到2～3㎝高時，接種于誘導根系的培養(yǎng)基中，以不同濃度的NAA和培養(yǎng)溫度作對照，培養(yǎng)50d后統(tǒng)計，結(jié)果見表3。

表3　不同激素和培養(yǎng)溫度對叢生芽苗生根的統(tǒng)計結(jié)果

注：根的生長狀況以——優(yōu) （根粗壯、有根毛）、良 （根中粗、有根毛）、中 （根細小）、差（根纖弱）進行分級，并量化 （優(yōu)：4；良：3；中：2；差：1）；k1，k2，為各因素水平1，水平2的均值；R為極值。

通過觀察，各處理組的叢生芽苗在誘根培養(yǎng)基中植株生長正常，并均能生根，但是在平均生根條數(shù)、根系長度、粗度等方面有差異；從表3中也可以發(fā)現(xiàn)：對各組誘導的叢生芽苗在組合為A2B2中 （即MS+NAA 1.0 mg/L+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培養(yǎng)），叢生芽苗的生根效果最好，其生根數(shù)平均為2.1條、平均根系長度為1.23cm、根的質(zhì)量也達到了優(yōu)，綜合評分是最高。從極差分析結(jié)果表明，影響大花蕙蘭試管苗生根最主要的因素是生長素NAA，其次為培養(yǎng)溫度。

3.　結(jié)論與討論

3.1結(jié)論

3.1.1利用原球莖來誘導叢生芽苗是實現(xiàn)大花蕙蘭高頻快繁的有效途徑

大花蕙蘭的莖尖、莖段和根系均可實現(xiàn)繁殖再生，但是，本研究利用大花蕙蘭原球莖來誘導叢生芽苗，不僅操作簡單、繁殖速度快，再生頻率高，而且能夠?qū)崿F(xiàn)大花蕙蘭的高頻快速繁殖。本次試驗：將單個的原球莖接種于1/2 MS+瓊脂8g/L+活性炭1.0g/L+6-BA 2.5 mg/L+ NAA 0.5 mg/L+蔗糖18g/L的培養(yǎng)基上大花蕙蘭增殖的叢生芽的數(shù)量最多，達5.13倍；在1/2 MS+活性炭1.0g/L+NAA 0.4mg/L+6-BA 0.5mg/L+蔗糖25mg/L+瓊脂10 g/L的培養(yǎng)基誘導叢生芽的效果最好，誘導率高達75.1%，同時叢生芽苗生長翠綠、大小勻稱，生長健壯，叢生芽苗也能快速長根，快速形成根、莖、葉完整的大花蕙蘭組培苗。

3.1.2不同激素對大花蕙蘭叢生芽的誘導效果不同

經(jīng)研究結(jié)果可知：影響大花蕙蘭原球莖誘導叢生芽的主要因素是激素配比和蔗糖含量，表現(xiàn)為：6-BA＞蔗糖＞NAA＞瓊脂；在叢生芽苗的高頻增殖倍數(shù)中：NAA起主導作用，其次是6-BA，瓊脂對大花蕙蘭的叢生芽的增殖影響最?。辉趨采可^程中，MS+NAA 1.0 mg/L+瓊脂10g/L+蔗糖10g/L+活性炭2g/L+香蕉泥100g/L，28℃下培養(yǎng)，叢生芽的生根效果最好。大花蕙蘭試管苗生根最主要的因素是生長素NAA。

3.2討論

國內(nèi)對大花蕙蘭叢生芽苗的高頻快繁體系研究少，谷祝平等用掃描電鏡觀察大花蕙蘭莖尖培養(yǎng)原球莖的形成表明：大花蕙蘭原球莖是由外植體的體細胞發(fā)育而來，通過培養(yǎng)后才逐步長出子葉、真葉、假根，形成完整植株［8］。在本次試驗研究中也發(fā)現(xiàn)：6-BA、NAA、蔗糖等是大花蕙蘭叢生芽苗的高頻快繁中所必需的，NAA在叢生芽苗增殖時起主要影響作用，其次是6-BA，并且增殖褐化與激素用量有關(guān)，激素用量越大，褐化率越高。這一研究結(jié)果表明：6-BA、NAA、蔗糖的合理配比有利于大花蕙蘭叢生芽苗的誘導與生長。

參考文獻：

［1］謝為龍，譚群英，王愛萍.影響大花蕙蘭試管苗培育因素的研究［J］.四川農(nóng)業(yè)大學學報，1994，12（02）：231—234.

［2］龍雨躍，李國樹，徐成東，等.大花蕙蘭原球莖誘導與增殖研究［J］.楚雄師范學院學報，2013，28（03）：64—69.

［3］劉陽，陳小強，孫寧，等.大花蕙蘭轉(zhuǎn)基因研究進展 ［J］.北方園藝，2010（13）：229—231.

［4］章鵬程，陳瑜，鄧衍福，等.6-BA與NAA不同濃度配比對大花蕙蘭原球莖誘導的影響［J］.杭州師范大學學報，2012，11（04）：332—336.

［5］李杰，黃敏仁，王明庥，等.植物外源激素對大花蕙蘭體胚發(fā)生影響的研究［J］.北京林業(yè)大學學報，2005，27（04）：65—68.

［6］趙穎，劉平生，張南.大花蕙蘭的嫩根與根兜組織快繁技術(shù)研究［J］.內(nèi)蒙古林業(yè)科技，2010，36（03）：48—50.

［7］張晨晨，余家平，蔣琳.大花蕙蘭高頻再生體系的研究 ［J］.植物生理學通訊，2007，43（06）：1101—1104.

［8］谷祝平，高金城，李柏年，等.大花蕙蘭莖尖培養(yǎng)的掃描電鏡觀察研究［J］.西北植物學報，1990，10（2）：128—131.

（責任編輯徐成東）

中圖分類號：Q949.718.430.5

文章標識碼：A

文章編號：1671-7406（2015）03-0043-05

*基金項目：由云南省大學生創(chuàng)新性實驗國家自然科學基金 （31260095）；云南省高校科技創(chuàng)新團隊支持計劃項目 （IRTSTYN）；生物學省級重點學科和楚雄師院校級重點學科（05YJJSXK03）項目資助。

收稿日期：2015-01-10

作者簡介：李國樹 （1969—），男，彝族，高級實驗師，從事植物學實驗及植物資源開發(fā)與利用研究。

Research on High-regeneration Factors on Multiple-buds of Cymbidium hybridum

LI Guoshu，CUI Guoquan，LUO Shuncong&XU Chengdong
（School of Chemistry&Life Sciences，Chuxiong Normal University，Chuxiong，675000，Yunnan Province；Institute for Bio-resources Research and Development of Central Yunnan Plateau，Chuxiong，675000，Yunnan Province）

Abstract：For the study of influencing high frequency on multiple factors of Cymbidium hybridum，by asepsis protocorm used of protocorm for growing seedlings of induction，regeneration and rooting breeding research.Results show that in 1/2 MS+AC 1.0 g/L+NAA 0.4 mg/L+6-BA 0.5 mg/L+sucrose 25 mg/L+agar cultivation of 10 g/L，the induction rate is as high as 75.1%，cluster bud seedling growth；In 1/2 MS+agar 8 g/L+1.0 g/L+6-BA 2.5 mg/L+NAA 0.5 mg/L+sucrose 18 g/ L of medium induced the most number of multiple shoot clumps，up to 5.13 times；6-BA and NAA on induction of proliferation was significant；The bulb is an effective way to induce large fourth multiple shoot clumps investigate.

Key words：Protocorm Cymbidium hybridum；multiple-buds；orthogonal test；induction rate