闞 娟，張慶慶，萬(wàn) 冰，劉 俊，金昌海（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州　225127）

外源乙烯對(duì)桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中線粒體內(nèi)細(xì)胞色素氧化酶的影響

闞 娟，張慶慶，萬(wàn) 冰，劉 俊，金昌海*
（揚(yáng)州大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225127）

以硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’為試材，研究外源乙烯處理對(duì)桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中呼吸速率、乙烯釋放量、細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）活性以及線粒體編碼的COX 3 種亞基（COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）基因表達(dá)量的影響。結(jié)果表明：外源乙烯處理加速了硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’在采后貯藏過(guò)程中硬度的下降，促進(jìn)了呼吸作用和內(nèi)源乙烯釋放，使呼吸高峰和乙烯釋放高峰提前出現(xiàn)。同時(shí)外源乙烯抑制了COX酶活性，抑制了貯藏后期COXⅠ和COXⅡ亞基基因的表達(dá)，抑制了整個(gè)貯藏過(guò)程中COXⅢ亞基基因的表達(dá)。外源乙烯處理抑制了COX途徑的呼吸，加速了果實(shí)的軟化衰老。

桃；乙烯；線粒體；呼吸速率；細(xì)胞色素氧化酶

線粒體是植物細(xì)胞的主要細(xì)胞器，是細(xì)胞能量代謝和物質(zhì)轉(zhuǎn)換的中樞。線粒體除了能量轉(zhuǎn)換作用，還參與了4 種呼吸酶復(fù)合物的形成，包括NADH-CoQ還原酶、泛醌-細(xì)胞色素C還原酶、細(xì)胞色素氧化酶（cytochrome C oxidase，COX）和ATP合成酶［1］。其中COX存在于線粒體內(nèi)膜上，是線粒體呼吸酶的標(biāo)志酶，也是線粒體呼吸鏈上氧化磷酸化過(guò)程中的關(guān)鍵酶，把呼吸底物的電子經(jīng)過(guò)細(xì)胞色素系統(tǒng)直接傳遞給分子態(tài)氧，是線粒體呼吸控制的主要部位［2］。COX有13 個(gè)亞基，為一多亞基、多形式、多基因組來(lái)源的酶蛋白復(fù)合體，其中最大的3 個(gè)亞基（COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ）由線粒體DNA（mtDNA）編碼，是酶活性不可缺少的部分。目前有研究人員從活性氧代謝的角度，通過(guò)蛋白質(zhì)組學(xué)、蛋白免疫雜交以及其他生理生化分析，證明了線粒體蛋白氧化損傷與果實(shí)成熟衰老的關(guān)系［3］。一系列實(shí)驗(yàn)表明，細(xì)胞衰老時(shí)線粒體功能會(huì)發(fā)生退行性改變［4］。COX是呼吸鏈末端酶，其活性大小可直接影響線粒體功能，反映出生物體的有氧呼吸代謝水平。乙烯是5 大類植物激素之一，參與了植物從種子萌發(fā)到成熟以及衰老的一系列生命過(guò)程的調(diào)節(jié)及逆境條件下植物的脅迫反應(yīng)。有研究證明外源乙烯是通過(guò)乙烯的自我催化而誘導(dǎo)內(nèi)源乙烯生成的，乙烯的生理作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)植物體內(nèi)活性氧水平來(lái)實(shí)現(xiàn)［5］。在對(duì)綠豆黃化幼苗研究中發(fā)現(xiàn)外源乙烯能顯著提高活性氧產(chǎn)生速率，同時(shí)使得線粒體呼吸高峰提前出現(xiàn)，從側(cè)面表明乙烯對(duì)線粒體呼吸的促進(jìn)作用可能是通過(guò)提高線粒體活性氧的產(chǎn)生速率實(shí)現(xiàn)的［6］。當(dāng)細(xì)胞色素氧化酶途徑受阻時(shí)，抗氰呼吸產(chǎn)生或加強(qiáng)，而乙烯與抗氰呼吸上升有平行的關(guān)系，乙烯刺激抗氰呼吸，誘發(fā)呼吸躍變產(chǎn)生［7］。

目前外源乙烯對(duì)果實(shí)線粒體內(nèi)呼吸作用、COX活性及基因表達(dá)影響的研究還鮮見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以外源乙烯處理的硬溶質(zhì)型‘加納巖’桃果實(shí)為試材，通過(guò)對(duì)外源乙烯處理后果實(shí)在貯藏過(guò)程中線粒體內(nèi)呼吸作用、乙烯釋放、COX活性以及COX 3 種亞基的表達(dá)的研究，了解桃果實(shí)在貯藏過(guò)程中外源乙烯對(duì)其呼吸作用及線粒體中關(guān)鍵酶COX的影響，從而為乙烯與COX在桃果實(shí)采后軟化衰老中作用研究提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

供試品種為硬溶質(zhì)型‘加納巖’桃果實(shí)，盛花后95 d，桃果實(shí)褪綠，基本全紅，頂部暗紅，果實(shí)較硬。

焦碳酸二乙酯（diethy pyrocarbonate，DEPC）、十六烷基三甲基溴化銨（hexadecyl trimethyl ammonium bromide，CTAB）、聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone，PVP）、乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraacetic acid，EDTA）、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、β-巰基乙醇、LiCl、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、亞精胺、3-［3-（膽酰胺丙基）二甲氨基］丙磺酸內(nèi)鹽（3-［（3-cholamidopropyl）dimethyl-amino］-1-propanesulfonate，CHAPS）、二硫蘇糖醇（DL-dithiothreitol，DTT）、苯甲基磺酰氟（phenylmethanesulfonyl fluoride，PMSF）、還原型細(xì)胞色素C生工生物工程（上海）股份有限公司；PrimeScriptTM1st Strand cDNA Synthesis Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、TaKaRa TaqTMDNA聚合酶、DL2000 DNA Marker寶生物工程（大連）有限公司；NaCl、HCl、氯仿、異戊醇、蔗糖、氯化鎂均為分析純。

1.2儀器與設(shè)備

GY-1型果實(shí)硬度計(jì)牡丹江市機(jī)械研究所；5804R高速冷凍離心機(jī)、5341梯度聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀德國(guó)Eppendorf公司；7300熒光定量?jī)x美國(guó)ABI公司；GC-14B氣相色譜儀 日本島津公司。

1.3方法

1.3.1材料處理

一部分材料以 7～8 個(gè)為單位，裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，20 ℃（95%以上的相對(duì)濕度）貯藏。實(shí)驗(yàn)處理包括：1）對(duì)照，在20 ℃條件下密閉處理12 h；2）20 ℃條件下用50 μL/L外源乙烯密閉處理12 h。處理后的果實(shí)于20 ℃條件下貯藏 0、2、4、6、8、10 d 后，取部分鮮果測(cè)定硬度、呼吸速率及乙烯釋放量后再取果肉部分切成小塊，用液氮處理后裝在聚乙烯薄膜塑料袋中，并保存在－75 ℃超低溫冰箱中用于分析實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)3 次重復(fù)。1.3.2果實(shí)硬度的測(cè)定

采用GY-1型果實(shí)硬度計(jì)（調(diào)頭直徑3.5 mm），測(cè)定鮮果去除果皮后果肉的硬度。每個(gè)果實(shí)胴部不同部位對(duì)稱均勻選取6 個(gè)點(diǎn)，每次測(cè)量6 個(gè)果實(shí)，均勻取平均值。1.3.3呼吸速率的測(cè)定

采用靜置法［8］。

1.3.4乙烯釋放量的測(cè)定

參照J(rèn)in Changhai等［9］的方法。氣相色譜條件為：氫焰離子化檢測(cè)器，SPB-1毛細(xì)管柱（0.25 mm×30 m）。采用GC-14B氣相色譜儀，載氣為N2，柱溫40 ℃，檢測(cè)器溫度120 ℃，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.5線粒體的提取

參照Bonner［10］、Liang Wusheng［11］等方法。

1.3.6COX活性的測(cè)定

取上述提取的線粒體制備液1 mL，COX活性的測(cè)定參照Errede等［12］的方法。

1.3.7桃果實(shí)總RNA提取

參照Meisel等［13］方法提取。

1.3.8COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ基因的熒光定量PCR （real-time PCR）

根據(jù)NCBI上COXⅠ、COXⅡ、COXⅢ基因序列信息（GenBank登錄號(hào)分別為M16884.1，Z 1 1 9 8 0.1，X 1 5 1 3 1.1），用P r i m e r p r e m i e r 5.0 軟件設(shè)計(jì)引物熒光定量P C R引物C O XⅠ（5'-G A C A C C C G A G C C T A C T T T A C-3'）和（5'-GCTATGATGGCGAATACTGC-3'），COXⅡ（5'-GCTTACAAGACGCCACATCACC-3'）和（5'-CGTAGGGAGGGAAGGGCAAT-3'），COXⅢ（5'-CAGCCTAGTTCCTACCCACGAC-3'）和（5'-CCCGTTGCTATGAAGAATGTTG-3'）用于擴(kuò)增目的基因。Actin（5'-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3'）和（5'-GTACTCCTGCTTGCTGATCC-3'）用于內(nèi)參基因。

1.4數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)用SPSS軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2　　結(jié)果與分析

圖 1　　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中硬度的影響Fig.1　　Effect of exogenous ethylene on peach hardness during postharvest storage

2.1外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中硬度變化的影響如圖1所示，經(jīng)外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實(shí)在貯藏的6 d內(nèi)硬度有明顯的下降，之后硬度下降趨于平緩。桃果實(shí)貯藏到第10天時(shí)，對(duì)照組‘加納巖’桃果實(shí)與外源乙烯處理組的桃果實(shí)硬度相近。外源乙烯處理明顯加快了‘加納巖’桃果實(shí)硬度下降，但對(duì)果實(shí)的最終軟化程度影響不明顯。

2.2外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中呼吸速率的影響

圖 2　　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中呼吸速率的影響Fig.2　　Effect of exogenous ethylene on mitochondrial respiration rate of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖2所示，經(jīng)外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實(shí)在貯藏前期呼吸速率迅速升高，在貯藏到第6天時(shí)達(dá)最大值后有所下降。而對(duì)照組的呼吸速率在整個(gè)貯藏過(guò)程中一直增加。在整個(gè)貯藏過(guò)程中兩者呼吸速率都存在顯著性差異。外源乙烯加快了‘加納巖’桃果實(shí)呼吸高峰的到來(lái)。2.3外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中乙烯釋放量的影響

圖 3　　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中乙烯釋放量的影響Fig.3　　Effect of exogenous ethylene on ethylene production of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖3所示，經(jīng)外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實(shí)在貯藏過(guò)程中乙烯釋放量要明顯高于對(duì)照組。且在貯藏到第8天時(shí)，外源乙烯處理的桃果實(shí)乙烯釋放量達(dá)到峰值，之后乙烯釋放量下降。外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實(shí)和對(duì)照組在同貯藏時(shí)期乙烯釋放量存在極顯著差異（P＜0.01）。外源乙烯誘導(dǎo)了硬溶質(zhì)型桃果實(shí)中內(nèi)源乙烯的釋放。

2.4外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中線粒體內(nèi)COX活性的影響

圖 4　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中線粒體內(nèi)COX活性的影響Fig.4　Effect of exogenous ethylene on mitochondrial COX activity of ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖4所示，經(jīng)外源乙烯處理的‘加納巖’桃果實(shí)在貯藏過(guò)程中COX活性整體比對(duì)照組低，桃果實(shí)COX活性在貯藏前4 d不斷升高，之后不斷下降。兩者在同一貯藏時(shí)期COX活性都存在顯著性差異（P＜0.05）。外源乙烯處理抑制了桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中COX活性，但對(duì)COX

活性變化趨勢(shì)無(wú)顯著影響。

2.5外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中

COXⅠ亞基基因表達(dá)水平的影響

圖 5　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中CCOOXXI基因表達(dá)的影響Fig.5　Effect of exogenous ethylene on the expression of CCOOXXI in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖5所示，對(duì)照和外源乙烯處理組桃果實(shí)貯藏過(guò)程中COXⅠ均有表達(dá)，且變化趨勢(shì)相似，COXⅠ的相對(duì)表達(dá)量在貯藏前4 d相近。說(shuō)明外源乙烯處理硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’桃果實(shí)后，對(duì)于其在貯藏前期COXⅠ基因表達(dá)無(wú)顯著影響。但到貯藏后期（6～10 d）外源乙烯處理顯著抑制了COXⅠ基因表達(dá)（P＜0.05）。

圖 6　　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中COXCOXⅡ基因表達(dá)的影響Fig.6　　Effect of exogenous ethylene on the expression of COXCOXⅡ in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

2.6外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中COXⅡ亞基基因表達(dá)水平的影響如圖6所示，硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏時(shí)COXⅡ基因相對(duì)表達(dá)量在貯藏前期（0～4 d）都明顯低于外源乙烯處理組，而到貯藏后期（6～10 d）外源乙烯處理的COXⅡ基因相對(duì)表達(dá)量比對(duì)照組低，外源乙烯抑制了‘加納巖’桃果實(shí)貯藏后期COXⅡ基因的相對(duì)表達(dá)量。外源乙烯處理組與對(duì)照組在貯藏過(guò)程中COXⅡ基因相對(duì)表達(dá)量變化趨勢(shì)一致，都是隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小。

2.7外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中COXⅢ亞基基因表達(dá)水平的影響

圖 7　外源乙烯處理對(duì)‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中CCOOXXⅢ基因表達(dá)的影響Fig.7　Effect of exogenous ethylene on the expression of CCOOXXⅢ in ‘Jianayan' peach during postharvest storage

如圖7所示，外源乙烯抑制了硬溶質(zhì)桃果實(shí)貯藏過(guò)程中COXⅢ基因的表達(dá)。對(duì)照組COXⅢ基因相對(duì)表達(dá)量隨貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)先增加后減小，而外源乙烯處理組COXⅢ在貯藏到第2天時(shí)，其基因相對(duì)表達(dá)量達(dá)到最大，之后快速下降，到第6天時(shí)趨于平緩。

3　　討 論

有研究［14-15］認(rèn)為乙烯對(duì)果實(shí)采后貯藏過(guò)程中成熟衰老起著重要的調(diào)節(jié)作用，影響著機(jī)體的酶活性、激素水平和呼吸速率等。經(jīng)外源乙烯處理的硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’在貯藏過(guò)程中軟化進(jìn)程加快，但貯藏到后期桃果實(shí)仍然和對(duì)照組有相近的硬度（圖1），對(duì)果實(shí)最終的軟化程度無(wú)明顯影響。

在果蔬中，線粒體電子傳遞鏈主要有細(xì)胞色素主路和抗氰交替支路兩條途徑［16］，其中抗氰呼吸途徑是以交替氧化酶為末端氧化酶的氰不敏感電子傳遞鏈途徑，從線粒體內(nèi)膜電子傳遞鏈的主呼吸途徑的泛醌處分支，電子不進(jìn)行跨膜運(yùn)輸直接傳遞到末端氧化酶，并催化分子氧還原成水，不產(chǎn)生質(zhì)子電化學(xué)勢(shì)能，不能驅(qū)動(dòng)ATP的合成，只能產(chǎn)生少量的能量［17］。在果實(shí)呼吸躍變時(shí)，以抗氰呼吸為主，呼吸躍變后主要以細(xì)胞色素途徑為主，果實(shí)采后貯藏過(guò)程中的成熟衰老時(shí)伴隨著總呼吸的加強(qiáng)［18］。已有研究［19］證明，乙烯處理可以誘導(dǎo)多種植物組織抗氰呼吸能力的發(fā)生。本研究中經(jīng)外源乙烯處理的桃果實(shí)在貯藏前期呼吸速率與對(duì)照組呈現(xiàn)迅速上升的趨勢(shì)，到貯藏的中后期經(jīng)外源乙烯處理的桃果實(shí)呼吸作用又迅速下降，而對(duì)照組呼吸速率在貯藏過(guò)程中一直呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，且在貯藏后期呼吸速率高于乙烯處理組，乙烯處理顯著促進(jìn)了‘加納巖’貯藏前期和中期的呼吸速率，使呼吸高峰提前出現(xiàn)（圖2）。在貯藏過(guò)程中外源乙烯處理的桃果實(shí)乙烯釋放速率顯著高于貯藏同時(shí)期的對(duì)照組（圖3），外源乙烯處理顯著誘導(dǎo)了‘加納巖’桃果實(shí)采后貯藏中內(nèi)源乙烯的釋放。

COX在線粒體呼吸鏈電子傳遞中發(fā)揮著極其重要的作用［20-21］。其中COXⅠ、COXⅡ及COXⅢ 3 種亞基基因共同構(gòu)成了COX的核心結(jié)構(gòu)，共同影響著COX的活性，而COX活性直接影響到線粒體功能狀態(tài)，一旦線粒體功能受損，就會(huì)促使呼吸鏈產(chǎn)生大量的活性氧，導(dǎo)致機(jī)體受損［22］。本研究中，在桃果實(shí)采后貯藏過(guò)程中，經(jīng)外源乙烯處理的硬溶質(zhì)型桃果實(shí)‘加納巖’COX活性要比對(duì)照組低（圖4）。外源乙烯抑制了COX活性，抑制了細(xì)胞色素氧化酶途徑的呼吸。植物中雖然存在多條電子傳遞途徑，但是 細(xì)胞色素氧化酶途徑和抗氰呼吸途徑為兩條主要途徑，植物對(duì)這兩條途徑有協(xié)調(diào)控制現(xiàn)象，即當(dāng)細(xì)胞色素氧化酶途徑受阻時(shí)，抗氰呼吸產(chǎn)生或加強(qiáng)，乙烯生成增加，加速了果實(shí)的成熟衰老。本研究中外源乙烯可能通過(guò)抑制桃果實(shí)在貯藏過(guò)程中COX活性，從而使果實(shí)呼吸代謝從細(xì)胞色素途徑轉(zhuǎn)向抗氰呼吸途徑，最終促進(jìn)果實(shí)衰老。

COX的蛋白表達(dá)受mtDNA和COX亞基基因的影響，COX最大的3 個(gè)亞基（COXⅠ、COXⅡ及COXⅢ）是酶活性不可缺少的部分［23-24］，因此研究COX基因表達(dá)可以為從分子水平上探明COX對(duì)果實(shí)成熟軟化的作用提供理論依據(jù)。有研究證明，COX的表達(dá)量大小會(huì)關(guān)系到COX活性的大小［25］，而COX活性一旦受到影響，就會(huì)直接影響線粒體功能狀態(tài)，從而影響果實(shí)線粒體的呼吸代謝作用，導(dǎo)致活性氧的積累、果實(shí)的衰老等。本研究中，COXⅠ和COXⅡ兩種亞基基因相對(duì)表達(dá)量在桃果實(shí)貯藏前期（0～4 d）經(jīng)外源乙烯處理的要比對(duì)照組高，而在貯藏后低于對(duì)照組（圖5和圖6）?？梢?jiàn)，果實(shí)在采后貯藏過(guò)程中，外源乙烯在貯藏后期抑制COXⅠ和COXⅡ這兩個(gè)亞基的表達(dá)，與貯藏后期COX活性不斷下降密切相關(guān)（圖4）。經(jīng)外源乙烯處理的COXⅢ基因在果實(shí)采后貯藏各個(gè)時(shí)期都要比對(duì)照組低（圖7），與外源乙烯處理后COX活性變化趨勢(shì)相似，這可能與COXⅢ基因?qū)OX活性調(diào)控起重要作用存在一定關(guān)系。

4　　結(jié) 論

研究了外源乙烯對(duì)硬溶質(zhì)型桃果實(shí)貯藏過(guò)程中線粒體呼吸作用及呼吸代謝關(guān)鍵酶COX的影響。研究表明：外源乙烯能使桃果實(shí)更快軟化，但不能改變果實(shí)最終的硬度；外源乙烯促進(jìn)了呼吸速率和乙烯釋放，使得桃果實(shí)的呼吸高峰和乙烯釋放高峰提前到來(lái)，加速了桃果實(shí)貯藏過(guò)程中的成熟衰老。外源乙烯抑制了COX活性，對(duì)線粒體編碼的COX 3 種亞基表達(dá)都有一定程度的影響，抑制了COX途徑的呼吸，增加了抗氰呼吸，加速了果實(shí)的軟化衰老。

［1］INOUE J G， MIYA M， TSUKAMOTO K， et al. Complete mitochondrial DNA sequence of Conger myriaster （teleostei: Anguilliformes）: novel gene order for vertebrate genomes and the phylogenetic implications for anguilliform families［J］. Journal of Molecular Evolution， 2001， 52（4）: 311-320.

［2］KADENBACH B， RAMZAN R， VOGT S. Degenerative diseases，oxidative stress and cytochrome C oxidase function［J］. Trends in Molecular Medicine， 2009， 15（4）: 139-148.

［3］QIN Guozheng， MENG Xianghong， WANG Qing， et al. Oxidative damage of mitochondrial proteins contributes to fruit senescence: a redox proteomics analysis［J］. Journal of Proteome Research， 2009，8（5）: 2449-2462.

［4］KATAOKA M， FUKURA Y， SHINOHARA Y， et al. Analysis of mitochondrial membrane potential in the cells by microchip flow cytometry［J］. Electrophoresis， 2005， 26（15）: 3025-3031.

［5］SCARIOT V， PARADISO R， ROGERS H. Ethylene control in cut fl owers: classical and innovative approaches［J］. Postharvest Biology and Technology， 2014， 97: 83-92.

［6］柯德森， 王愛(ài)國(guó)， 羅廣華. 乙烯促進(jìn)線粒體呼吸過(guò)程中活性氧的作用［J］. 熱帶亞熱帶植物學(xué)報(bào)， 1999， 7（2）: 140-145.

［7］MAKKUMRAI W， ANTHON G E， SIVERTSEN H， et al. Effect of ethylene and temperature conditioning on sensory attributes and chemical composition of ‘Bartlett' pears［J］. Postharvest Biology and Technology， 2014， 97: 44-61.

［8］李正國(guó)， 曾凱芳， 黃瓊珍， 等. 農(nóng)產(chǎn)品貯藏運(yùn)銷學(xué)實(shí)驗(yàn)教程［M］. 重慶:西南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 1997.

［9］JIN Changhai， KASHIWAGI T， MIZUNO M， et al. Structural changes in the cell wall pectic polysacchar-ides accompanied by softening of apple （Malus pumila Mill） cultivars Fuji and Kinsei［J］. Food Preservation Science， 1999， 25: 293-300.

［10］ BONNER W D. A general method for the preparation of plant mitochondria［J］. Methods in Enzymology， 1967， 10: 126-133.

［11］ LIANG Wusheng， PAN Juan， LIANG Hongguo. Activation of cyanideresistant respiration by pyruvate in mitochondria of aged potato tuber slices［J］. Plant Physiology and Plant Molecular Biology， 2003，29: 317-321.

［12］ ERREDE B， KAMEN M D， HATEFI Y. Preparation and properties of complex Ⅳ （ferrocytochrome c: oxygen oxidoreductase EC 1. 9. 3. 1）［J］. Methods in Enzymology， 1978， 53: 40-47.

［13］ MEISEL L， FONSECA B， GONZáLEZ S， et al. A rapid and effi cient method for purifying high quality total RNA from peachs （Prunus persica） for functional genomics analyses［J］. Biological Research，2005， 38: 83-88.

［14］ BAPAT V A， TRIVEDI P K， GHOSH A， et al. Ripening of fleshy fruit: molecular insight and the role of ethylene［J］. Biotechnology Advances， 2010， 28（1）: 94-107.

［15］ MAURA B， GEORGE A M， CLAUDIO B， et al. Different postharvest conditions modulate ripening and ethylene biosynthetic and signal transduction pathways in stony hard peaches［J］. Postharvest Biology and Technology， 2008， 48: 84-91.

［16］ ARNHOLDT-SCHMITT B， COSTA J H， de MELO D F. AOX-a functional marker for efficient cell reprogramming under stress［J］. Trends in Plant Science， 2006， 11（6）: 281-287.

［17］ JUNG C R， KIM Y. Different types of fruit damages of three internal apple feeders diagnosed with mitochondrial molecular markers［J］. Journal of Asia-Pacifi c Entomology， 2013， 16（2）: 189-197.

［18］ HIWASA K， KINUGASA Y， SATOM I. Ethylene is required for both the initiation and progression of softening in pear fruit［J］. Journal of Experimental Botany， 2003， 54（383）: 771-779.

［19］ MURAYAMA H， ARIKAWA M， SASAKI Y， et al. Effect of ethylene treatment on expression of polyuronide-modifying genes and solubilization of polyuronides during ripening in two peach cultivars having different softening characteristics［J］. Postharvest Biology and Technology， 2009， 52: 196-201.

［20］ FRANCISCA D. Cytochrome C oxidase defi ciency: patients and animal models［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2010， 1802: 100-110.

［21］ VYGODINA T V， ZAKIRZIANOVA W， KONSTANTINOV A A. Inhibition of membrane-bound cytochrome C oxidase by zinc ions: high-affi nity Zn2+-binding site at the P-side of the membrane［J］. FEBS Letters， 2008， 582（30）: 4158-4162.

［22］ WAKATSUKI A， KITAZAKI K， KATO S， et al. An intact mitochondrial COXⅠ gene and a pseudogene with different genomic confi gurations are present in apple cultivars ‘Golden Delicious' and ‘Delicious': evolutionary aspects［J］. Scientia Horticulture， 2011， 130: 49-53.

［23］ FRANCISCA D. Cytochrome C oxidase defi ciency: patients and animal models［J］. Biochimica et Biophysica Acta， 2010， 1802: 100-110.

［24］ KADENBACH B， RAMZAN R， VOGT S. Degenerative diseases，oxidative stress and cytochrome C oxidase function［J］. Trends in Molecular Medicine， 2009， 15（4）: 139-148.

［25］ POYTON R O， BELLUS G， MCKEE E E， et al. In organello mitochondrial protein and RNA synthesis systems from Saccharomyces cereuisiae［J］. Methods of Enzymology， 1996， 264: 36-42.

Effect of Exogenous Ethylene on Mitochondrial Cytochrome C Oxidase during Postharvest Storage of Peach Fruit

KAN Juan， ZHANG Qingqing， WAN Bing， LIU Jun， JIN Changhai*
（College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou225127， China）

The effect of exogenous ethylene on respiration rate， ethylene production， cytochrome C oxidase （COX） activity and the gene expression levels of mitochondrial DNA-encoded subunits Ⅰ， Ⅱ and Ⅲ of cytochrome C oxidase in fruits of the stony-hard peach （Prumus persica） cultivar ‘Jianayan' was determined during postharvest storage. The results showed that exogenous ethylene accelerated the decline of fi rmness and promoted the respiration rate and ethylene production of peach fruits during postharvest storage and resulted in earlier appearance of the peaks of respiration and ethylene production. Meanwhile， exogenous ethylene inhibited COX activity and the expression level of COX Ⅲ gene throughout the storage process and suppressed the expression of COX Ⅰ and COX Ⅱ genes in the later stage of the storage period. Exogenous ethylene inhibited the respiration via COX pathway and accelerated the softening and senescence of fruit.

peach； ethylene； mitochondria； respiration rate； cytochrome C oxidase

TS255.1

A

1002-6630（2015）24-0302-05

10.7506/spkx1002-6630-201524056

2015-05-25

國(guó)家自然科學(xué)基金青年科學(xué)基金項(xiàng)目（31101586）；江蘇省科技計(jì)劃項(xiàng)目（BC2013401）；

江蘇省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（BK2010310）

闞娟（1980—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：kanjuan@yzu.edu.cn

金昌海（1963—），男，教授，博士，研究方向?yàn)檗r(nóng)產(chǎn)品貯藏與加工。E-mail：chjin@yzu.edu.cn