柯 璐，戴曉麗，林 杰*，黃嫦嬌，曾維揚(yáng)，張溫玲

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州　　350003）

志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備方法

柯 璐，戴曉麗，林 杰*，黃嫦嬌，曾維揚(yáng)，張溫玲

（福建出入境檢驗(yàn)檢疫局技術(shù)中心，福建省檢驗(yàn)檢疫技術(shù)研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350003）

采用冷凍干燥法制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。通過(guò)正交試驗(yàn)法選擇凍干保護(hù)率最高的保護(hù)劑配方方案。以雞肉粉作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)基質(zhì)，按比例與保護(hù)劑配方混合，添加擬定菌數(shù)的新鮮菌液后進(jìn)行冷凍干燥。實(shí)驗(yàn)制備的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)樣品其特性值（含菌數(shù)）為530 CFU/瓶，不確定度為24 CFU/瓶。冷凍干燥樣品在－20 ℃及4 ℃條件下保存12 個(gè)月，特性值穩(wěn)定；25 ℃條件下保存9 個(gè)月，特性值穩(wěn)定；60 ℃條件下保存，穩(wěn)定性差。

宋氏志賀氏菌；標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)；基質(zhì)；雞肉

志賀氏菌（Shigella）是一類具有高度傳染性的腸道致病菌，廣泛存在于各種食品中。人類對(duì)志賀氏菌的易感性較高，所以在食物和飲用水的衛(wèi)生檢驗(yàn)時(shí)，常以志賀氏菌作為指標(biāo)［1-2］。目前GB 4789.5—2012《食品微生物學(xué)檢驗(yàn)：志賀氏菌檢驗(yàn)》是對(duì)食品中志賀氏菌的定性檢測(cè)方法，在1988年，國(guó)際食品微生物標(biāo)準(zhǔn)委員會(huì)指出，定量是微生物風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估最理想的方式，因其方便風(fēng)險(xiǎn)管理政策的制定，食品中致病微生物的檢測(cè)也正逐步從定性檢測(cè)向定量檢測(cè)發(fā)展［3-4］。通過(guò)使用菌種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)能夠有效保證定量檢測(cè)高效、準(zhǔn)確地運(yùn)行，菌種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是生物特性標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中較為特殊的一類，國(guó)內(nèi)僅在出入境檢驗(yàn)檢疫系統(tǒng)內(nèi)少數(shù)幾個(gè)局在研制，大部分的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)都是靠國(guó)外引進(jìn)。2006年，遼寧出入境檢驗(yàn)檢疫局所研制的食品中微生物菌落總數(shù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)被批準(zhǔn)為國(guó)家二級(jí)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。該標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)包含兩種研制方法：一種是以模擬食品實(shí)物，添加腸桿菌、沙雷氏菌、芽孢桿菌等具有標(biāo)準(zhǔn)號(hào)、可溯源性的菌株經(jīng)冷凍干燥制成的：另一種是以魚(yú)粉為基質(zhì)與上述細(xì)菌混合經(jīng)冷凍干燥制成的，而我國(guó)在食品基質(zhì)的食源性致病微生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)領(lǐng)域仍是空白，因此研制添加基質(zhì)的志賀氏菌定量標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)有重要意義［5-9］。本實(shí)驗(yàn)以宋氏志賀氏菌為目標(biāo)菌，添加無(wú)菌雞肉粉，配合凍干保護(hù)劑通過(guò)冷凍干燥法研制含一定菌數(shù)的宋氏志賀氏菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，并評(píng)估不確定度以及對(duì)特性值進(jìn)行均勻性檢測(cè)和穩(wěn)定性追蹤。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

菌源：宋氏志賀氏菌Shigella sonnei，ATCC25931購(gòu)自上海漢尼公司；基質(zhì)：雞胸脯肉購(gòu)自福建圣農(nóng)集團(tuán)，低溫運(yùn)輸。－20 ℃儲(chǔ)存?zhèn)溆?；志賀氏菌增菌肉湯-新生霉素、志賀氏菌顯色培養(yǎng)基、木糖賴氨酸脫氧膽鹽瓊脂、菌落計(jì)數(shù)瓊脂北京陸橋有限公司；蔗糖（分析純）上海試一化學(xué)劑有限公司；聚乙烯吡咯烷酮（優(yōu)級(jí)純）國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酪氨酸（優(yōu)級(jí)純）上海百賽生物技術(shù)有限公司；德運(yùn)脫脂牛奶富祺仕貿(mào)易（上海）有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

KD-TBC-300M電子天平福建科迪技術(shù)有限公司；MODULYO-4K冷凍干燥機(jī)（配有真空泵）美國(guó)Edword公司；FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)天津市泰斯特儀器有限公司；M37610-33振蕩器金華雷琪實(shí)驗(yàn)器材有限公司；Stomacher3500拍擊式均質(zhì)器英國(guó)Seward公司；SpectraMax M5多功能酶標(biāo)儀美國(guó)Molecular Devices公司；SHKE4450臺(tái)式恒溫振蕩器美國(guó)Thermo公司；VXE380超低溫冰箱法國(guó)Jouan公司；Vitek2COMPACT30微生物鑒定儀（配套GP鑒定卡）法國(guó)生物梅里埃公司；BOX389微生物鑒定儀配套麥?zhǔn)媳葷醿x美國(guó)Hach公司；5 mL西林瓶（配套丁基膠塞）安徽華欣藥用玻璃制品有限公司。

1.3方法

1.3.1制備保存液

標(biāo)準(zhǔn)菌株凍干粉用志賀氏菌增菌肉湯溶解后劃線接種于志賀氏菌顯色培養(yǎng)基，（36±1） ℃培養(yǎng)20～48 h，挑取單菌落接種100 mL志賀氏菌增菌肉湯中，（41.5±1）℃培養(yǎng)16～20 h。吸取400 μL新鮮菌液（OD600 nm=0.264）于無(wú)菌1.5 mL聚乙烯離心管，再吸取600 μL 40%無(wú)菌甘油與之混合，即為保存液。保存液平均菌數(shù)為4.3×107CFU/mL。保存在－20 ℃?zhèn)溆?，使用前恢?fù)室溫（22 ℃）后渦旋10 s。

1.3.2菌液OD600 nm值對(duì)應(yīng)的菌數(shù)范圍

加保存液2 μL于200 mL志賀氏菌增菌肉湯增菌液，設(shè)計(jì)10 個(gè)平行，（41.5±1） ℃培養(yǎng)8、12、16、18 h，利用多功能酶標(biāo)儀測(cè)定培養(yǎng)液的OD600 nm值，同時(shí)按照GB 4789.2—2010《動(dòng)物源性食品中抗生素類藥物殘留檢測(cè)方法：微生物抑制法》進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)［10］。

1.3.3基質(zhì)的前處理

雞肉（無(wú)抗生素殘留）剔除脂肪組織（因動(dòng)物脂肪較易氧化酸敗，使得干粉質(zhì)量下降，保存狀態(tài)不穩(wěn)定，因此盡量剔除脂肪），冷凍干燥后脫水率為73.029%。脫水雞肉用高速萬(wàn)能粉碎機(jī)粉碎，基質(zhì)組織細(xì)度為170 目，疏松粉末狀，易分散于熱水中，有少量的沉淀。60Co γ輻射劑量選擇6 kGy，滅菌后分裝于自封袋中，100 g/袋，于玻璃干燥鍋儲(chǔ)存待用［11-12］。

1.3.4保護(hù)劑的設(shè)計(jì)

4 個(gè)因素脫脂乳、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖、酪氨酸分別記作M、P、S、T，水平設(shè)計(jì)見(jiàn)表1。選用L9（34）正交表安排試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。每種保護(hù)劑配方液加入體積為1%的新鮮菌液（OD600 nm=0.215），于臺(tái)式恒溫振蕩器上混勻（300 r/min，30 min），分別按2 mL/瓶分裝無(wú)菌西林瓶，冷凍干燥參數(shù)見(jiàn)表3。以保護(hù)率為指標(biāo)選出保護(hù)率最高的保護(hù)劑配方。保護(hù)率（B1）計(jì)算公式：

式中：C1為凍干前菌數(shù)/（CFU/mL）；C2為凍干后菌數(shù)/（CFU/mL）。

表1　單因素水平設(shè)計(jì)Taabbllee 11 　　FFaaccttoorrss aanndd tthheeiirr ccooddeedd lleevveellss uusseedd iinn oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn

注：純水、S、M的體積分別記作：N1、N2、N3；2％（N2+N3）代表添加體積為蔗糖和脫脂乳體積的2％，其余計(jì)算方式一致。

表2　保護(hù)劑正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 2　Orthogonal array design scheme for lyoprotectant formulationsTable 2　Orthogonal array design scheme for lyoprotectant formulations

表3　　凍干參數(shù)設(shè)計(jì)Table 3　　Parameter settings of lyophilizer

1.3.5混懸液的配制

基質(zhì)與無(wú)菌水混合后稱為基質(zhì)懸液，基質(zhì)懸液與配方保護(hù)劑混合后稱為混懸液，根據(jù)基質(zhì)脫水率（估為75%），設(shè)計(jì)混懸液的配制方案見(jiàn)表4。新鮮菌液（OD600 nm=0.270）按體積1%添加至混懸液，于臺(tái)式恒溫振蕩器上搖勻（300 r/min，30 min），2 mL/瓶分裝西林瓶。凍干程序參數(shù)見(jiàn)表5。根據(jù)混懸液保護(hù)率B2（計(jì)算參見(jiàn)公式（1））選擇最優(yōu)配制方式。

凍干后樣品復(fù)原方法：樣品于室溫（22 ℃）條件下放置10 min，加2 mL生理鹽水渦旋10 s，靜置10 min。

表 4　　混懸液的配制設(shè)計(jì)Table 4　　Volume proportions of mixed suspensions

表5　　凍干參數(shù)設(shè)計(jì)Table 5　　Parameter settings of lyophilizer

1.3.6混懸液含菌數(shù)的確定

1.3.6.1凍干樣品含菌數(shù)短期下降率

按照1.3.5節(jié)結(jié)果選擇的最優(yōu)混懸液配制方式配制100 mL混懸液，根據(jù)保護(hù)率B2及新鮮菌液含菌數(shù)，設(shè)計(jì)混懸液含菌數(shù)（添加1%體積的菌液）。充分混勻后2 mL/瓶分裝西林瓶，凍干參數(shù)見(jiàn)表5。

凍干后樣品于－20 ℃條件保存，于0、7、14、28、40 d時(shí)取出計(jì)數(shù)，按式（2）計(jì)算凍干樣品菌數(shù)的短期下降率（Xn）。

式中：C0為凍干后當(dāng)日菌數(shù)/（CFU/瓶）；Cn為－70 ℃條件下儲(chǔ)存n d后的菌數(shù)/（CFU/瓶）；Xn為第n天菌數(shù)下降率/%。

1.3.6.2混懸液菌數(shù)的確定

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)含菌數(shù)預(yù)期值為：200～600 CFU/瓶（即100～300 CFU/mL）。根據(jù)保護(hù)率B2及X40，按式（3）、（4）計(jì)算混懸液最小含菌數(shù)Y1、最大含菌數(shù)Y2：

式中：Y1為最小含菌數(shù)/（CFU/mL）；Y2為最大含菌數(shù)/（CFU/mL）；B2為保護(hù)率/%；X40為第40天菌數(shù)下降率/%。

則在添加新鮮菌液時(shí)應(yīng)保證Y1≤混懸液含菌數(shù)≤Y2。

1.3.7批量制備標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)凍干樣品

按照上述工藝流程制備6 個(gè)批次，每批次100 個(gè)樣品，共計(jì)540 個(gè)樣品，批次編號(hào)為：SH1～SH6。固定鋁蓋后存于－20 ℃待測(cè)。

1.3.8志賀氏菌的驗(yàn)證

對(duì)制備后的凍干樣品利用VITEK2程序進(jìn)行志賀氏菌的鑒定。

1.3.9均勻性驗(yàn)證

按隨機(jī)表抽樣，每批樣品抽取15 瓶，在控制同樣實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)樣品的含菌數(shù)（CFU/瓶），對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析［17-20］。

1.3.10凍干樣品的定值

定值結(jié)果表示為：標(biāo)準(zhǔn)值±總不確定度。標(biāo)準(zhǔn)值參考1.3.8節(jié)結(jié)果。

1.3.10.1菌落總數(shù)計(jì)數(shù)方法的不確定度評(píng)估

新鮮培養(yǎng)菌液，根據(jù)OD600 nm值，估計(jì)濃度約為2.0×108～3.0×108CFU/mL，稀釋至適當(dāng)濃度，吸取1 mL于平板計(jì)數(shù)，平行2 次，以結(jié)果的對(duì)數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證，用合并樣本標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)評(píng)估計(jì)數(shù)帶來(lái)的不確定度。

1.3.10.2樣品定值方法不確定度評(píng)估

按隨機(jī)表取樣品15 份，每份樣品平行測(cè)量2 次，用結(jié)果的對(duì)數(shù)值進(jìn)行驗(yàn)證。

1.3.10.3電子天平及移液器的不確定度評(píng)估

參照文獻(xiàn)［21-24］及校準(zhǔn)所依據(jù)的技術(shù)規(guī)范JJG 646—2006《移液器檢定規(guī)程》［25］、JJG 1036—2008《電子天平檢定規(guī)程》［26］。

1.3.11凍干樣品穩(wěn)定性統(tǒng)計(jì)檢驗(yàn)

樣品儲(chǔ)存在－20、4、25 ℃，在0、1、6、9、12 個(gè)月時(shí)，分別取出6 瓶進(jìn)行分析。

對(duì)于運(yùn)輸過(guò)程的特殊溫度，設(shè)計(jì)為60 ℃，保存第0、3、5、7、10天時(shí)，分別取出6 瓶進(jìn)行分析。

2　　結(jié)果與分析

2.1菌液OD600 nm值及對(duì)應(yīng)的菌數(shù)范圍

將蜂蜜樣品置于40 ℃數(shù)顯恒溫水浴鍋中加熱20 min，過(guò)200目篩除去蜂蜜樣品中不溶性的雜質(zhì)，真空脫氣。

表 66 　OODD60000 nnmm值對(duì)應(yīng)的菌數(shù)Table 66 　　OODD60000 nnmmvalue corresponding to the bacterial density

對(duì)新鮮菌液進(jìn)行OD600 nm值檢測(cè)，根據(jù)OD600 nm值參考表6評(píng)估菌液的含菌數(shù)以方便實(shí)驗(yàn)安排。

2.2保護(hù)劑正交試驗(yàn)結(jié)果

表7顯示，7號(hào)保護(hù)劑配方的B1最高，為32.39%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.074%，選擇該保護(hù)劑配方作為凍干保護(hù)劑。

表7　正交試驗(yàn)結(jié)果Taabbllee 77 　　RReessuullttss ooff oorrtthhooggoonnaall aarrrraayy ddeessiiggnn eexxppeerriimmeennttss %

2.3混懸液的保護(hù)率

表 8　混懸液的保護(hù)率Taabbllee 88 　　　PPrrootteeccttiioonn eeffffi i cciieennccyy ooff bbaacctteerriiaall ssuussppeennssiioonnss %

由表8可知，9號(hào)配制混懸液B2為36.67%，標(biāo)準(zhǔn)差為0.048%，選用9號(hào)方案配制混懸液。

2.4混懸液菌數(shù)短期下降率

根據(jù)B2為36.67%和新鮮菌液含菌數(shù)（4.0×108～5.0×108CFU/mL），設(shè)計(jì)混懸液菌數(shù)水平見(jiàn)表9。

表 99 　混懸液菌數(shù)設(shè)計(jì)Table 9　Design of mixed suspension concentrations

根據(jù)表9配制混懸液后，每種分裝2 mL/瓶，按照表5參數(shù)進(jìn)行凍干。凍干樣品含菌數(shù)檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表10。

表 10　混懸液菌數(shù)測(cè)定Taabbllee 1100 　　BBaacctteerriiaa ccoouunnttss ooff mmiixxeedd ssuussppeennssiioonnss dduurriinngg ssttoorraaggee CFU/瓶

表 11　混懸液在不同保存時(shí)間的菌數(shù)下降率TTaabbllee 1111 　　DDeecclliinneess iinn bbaacctteerriiaa ccoouunnttss ooff mmiixxeedd ssuussppeennssiioonnss aatt different storage timmeess %

由表11可知，高、中、低菌數(shù)的樣品凍干后菌數(shù)從第14～40天相對(duì)穩(wěn)定，計(jì)算X40的平均值為67.66%。將值帶入公式（3）、（4），計(jì)算得混懸液的菌數(shù)應(yīng)在8.4×102～2.5×103CFU/mL范圍內(nèi)。

2.5志賀氏菌驗(yàn)證

VITEK2生化鑒定結(jié)果是97%為Shigella sonnei，結(jié)果判定為Excellent identifi ation。

2.6均勻性驗(yàn)證

樣品于制備完成的第40天在同一實(shí)驗(yàn)條件下進(jìn)行檢測(cè)。6 個(gè)批次記為：m1～m6，每批次抽取15個(gè)樣品，記為：n1～n15，檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表12。

表 12　樣品的含菌數(shù)Table 12　The bacterial counts in real samplesCFU/瓶

該統(tǒng)計(jì)量是自由度（v1，v2）的F分布變量。根據(jù)自由度及給定的顯著性水平α=0.05，查得：F=2.19＜Fα= 2.201，則組內(nèi)和組間無(wú)顯著性差異，即樣品均勻。

2.7凍干樣品的定值

2.7.1凍干樣品的標(biāo)準(zhǔn)值

樣品的標(biāo)準(zhǔn)值采用均勻性實(shí)驗(yàn)的計(jì)數(shù)結(jié)果，即標(biāo)準(zhǔn)值為530 CFU/瓶。

2.7.2樣品的不確定度評(píng)估

2.7.2.1菌落計(jì)數(shù)方法不確定度的評(píng)估結(jié)果

表 13　計(jì)數(shù)方法不確定度的檢測(cè)結(jié)果TTaabbllee 1133 　　UUnncceerrttaaiinnttyy aarriissiinngg ffrroomm bbaacctteerriiaall ccoouunnttiinngg mmeetthhoodd

根據(jù)貝塞爾計(jì)算公式，計(jì)算出檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差合并樣本的標(biāo)準(zhǔn)差Sp，以評(píng)估計(jì)數(shù)方法帶來(lái)的不確定度。

根據(jù)公式：vi=lgXi－計(jì)算每個(gè)樣品檢測(cè)結(jié)果的殘差值vi，并進(jìn)一步計(jì)算殘差平方vi2及殘差平方和Σvi2，計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表14。

表 14　　檢測(cè)結(jié)果的殘差平方及殘差平方和Table 14　　residual squares and their sum

根據(jù)貝塞爾計(jì)算公式，可計(jì)算出檢測(cè)結(jié)果對(duì)數(shù)值標(biāo)準(zhǔn)偏差合并樣本的標(biāo)準(zhǔn)差：

式中：m為檢測(cè)的樣本數(shù)，即m=10；n為每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)的次數(shù)，即n=2。

當(dāng)檢測(cè)結(jié)果以2 次測(cè)量數(shù)據(jù)的對(duì)數(shù)值的平均值表示時(shí)，其值區(qū)間分布于±0.021之間。由于菌數(shù)最小基數(shù)為1，因此該不確定度可忽略不計(jì)。

2.7.2.2標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值的不確定度評(píng)估結(jié)果

取不同批次的凍干標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)10 份（于－70 ℃儲(chǔ)存40 d的樣品），每份樣品平行測(cè)量2 次，計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表15。為運(yùn)算方便，數(shù)值不采用科學(xué)計(jì)數(shù)法表示。

表 15　定值方法不確定度的計(jì)數(shù)結(jié)果Taabbllee 1155 　　BBaacctteerriiaall ccoouunnttss aanndd uunncceerrttaaiinnttyy ccaallccuullaattiioonnss iinn cceerrttiiffi i ccaattiioonn of reference materiaallss

式中：m為檢測(cè)的樣本數(shù)，即m=10；n為每個(gè)樣品重復(fù)檢測(cè)的次數(shù)，即n=2，則標(biāo)準(zhǔn)偏差合并樣本樣品標(biāo)準(zhǔn)差：Sp=15.165 750 89 CFU/瓶，則總體合成的樣本差10.723 805 29 CFU/瓶。取置信水平95%， f（自由度）=10，經(jīng)過(guò)查t分布表得：t0.05（10）=2.228，擴(kuò)展不確定度：U2=t×Uc=2.228×10.723 805 29= 23.892 638 2 CFU/瓶，取整數(shù)則U=24 CFU/瓶。

當(dāng)測(cè)量檢驗(yàn)結(jié)果用2 次測(cè)量值平均值表示結(jié)果時(shí)，其值分布區(qū)間至±24 CFU/瓶之間。這個(gè)取值的區(qū)間適用于每一次測(cè)量。

2.7.2.3移液器和電子天平的不確定度

移液器本次校準(zhǔn)容量相對(duì)誤差測(cè)量結(jié)果的擴(kuò)展不確定度：U=0.1%（k=2）；電子天平擴(kuò)展不確定度U=2.793 4 mg。在本標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)定值中移液器和電子天平的不確定度可忽略不計(jì)。

2.8樣品的穩(wěn)定性

樣品儲(chǔ)存在－20、4、25 ℃，每個(gè)時(shí)間取6 瓶檢測(cè)，以平均值作為檢測(cè)數(shù)值，結(jié)果見(jiàn)表16。

表 16　凍干樣品的穩(wěn)定性測(cè)量數(shù)據(jù)Taabbllee 1166 　　BBaacctteerriiaall ccoouunnttss ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess dduurriinngg ssttoorraaggee at different temperaturreess

表16顯示，保存第1個(gè)月，由于冷凍干燥后，樣品性狀不穩(wěn)定，細(xì)菌對(duì)環(huán)境溫度的變化敏感，樣品含菌數(shù)下降幅度大，因此除去第0個(gè)月數(shù)值，以x代表時(shí)間，y代表凍干樣品的特性值（菌含量），擬合成一條直線，－20、4、25 ℃斜率分別記為b1、b2、b3。以－20 ℃為例，計(jì)算如下：

b0=－b1=548.56

直線的標(biāo)準(zhǔn)偏差s2：

取其平方根s=31.35，斜率的不確定度s（b1）計(jì)算：

自由度為n－2，p=0.95（95%置信水平），則t=4.30。

由于|b1|=5.15＜t0.95（n－2）×s（b1）=6.73，故斜率是不顯著的，因而樣品在－20 ℃保存第1～12個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。

表17結(jié)果顯示，樣品在4 ℃保存第1～12個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。在25 ℃保存第1～9個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性。由表18結(jié)果顯示，樣品在運(yùn)輸?shù)奶厥鉁囟?0 ℃條件下，保存第10天，下降率高達(dá)84.38%，穩(wěn)定性差［27］。表 17凍干樣品的穩(wěn)定性TTaabbllee 1177 SSttaabbiilliittyy aannaallyyssiiss ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess

時(shí)間/ 月t值（自由度為n－2，p=0.95）4 ℃保存穩(wěn)定性分析25 ℃保存穩(wěn)定性分析169 12.71　|b3|=14.69＜t0.95（n－2）×s（b3）=19.06 12　4.30　|b2|=11.82＜t0.95（n－2）×s（b2）=12.87|b3|=14.09＞t0.95（n－2）×s（b3）=4.89

表 18　60 ℃保存的短期穩(wěn)定性Taabbllee 1188 　　SSttaabbiilliittyy ooff tthhee ffrreeeezzee--ddrriieedd ssaammpplleess ssttoorreedd aatt 6600 ℃

3　　結(jié) 論

3.1凍干配方保護(hù)劑的配制方案

通過(guò)正交試驗(yàn)獲得配方保護(hù)劑的配制最佳方案：設(shè)定純水體積為N1，蔗糖體積為N2=N1，脫脂奶體積為N3=4N2，聚乙烯吡咯烷酮和酪氨酸的體積分別為2%（N2+ N3）和4%（N2+N3）。其凍干保護(hù)率為32.39%，相對(duì)高，為獲得更高的保護(hù)效果還需進(jìn)一步研究各因素水平的設(shè)計(jì)以及混合比例的安排。

3.2混懸液的配制方案

以凍干后保護(hù)率為指標(biāo)獲得混懸液的最佳配制方案：基質(zhì)與無(wú)菌水按1 g/7 mL的比例配制后再與配方保護(hù)劑按1∶3的體積比混勻，加入體積為1%的新鮮菌液（菌液用無(wú)菌生理鹽水稀釋使得混懸液的含菌數(shù)在8.4×102～2.5×103CFU/mL。其保護(hù)率為36.67%，－20 ℃保存40 d時(shí)菌數(shù)下降率為67.66%。

3.3穩(wěn)定性跟蹤

追蹤樣品保存于－20、4 ℃以及25 ℃條件下12 個(gè)月的特性值穩(wěn)定性，其－20 ℃和4 ℃保存條件下12 個(gè)月未觀測(cè)到不穩(wěn)定性，25 ℃保存9 個(gè)月穩(wěn)定性良好，60 ℃的短期穩(wěn)定性差。冷凍干燥過(guò)程對(duì)細(xì)菌的損傷大，凍干后的存活細(xì)菌中有一部分已被損傷，而凍干后的環(huán)境只具備基本存活條件，使得細(xì)菌處于休眠狀態(tài)，損傷菌未能獲得營(yíng)養(yǎng)進(jìn)行修復(fù)，因此在短期內(nèi)死亡率大。

［1］魏新元， 魯博， 樊明濤， 等. 志賀氏菌在不同食品中檢出效率分析［J］.食品工業(yè)， 2011， 32（11）: 101-103.

［2］林曉麗， 賴衛(wèi)華， 張莉莉. 志賀氏菌檢測(cè)方法的最新研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2012， 32（6）: 108-109.

［3］王永， 趙新， 蘭青闊， 等. 食品中微生物危害控制及風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估研究［J］.天津農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 20（5）: 47-50.

［4］董慶利， 王海梅， MALAKAR P K， 等. 我國(guó)食品微生物定量風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估的研究進(jìn)展［J］. 食品科學(xué)， 2015， 36（11）: 221-229. doi: 10.7506/ spkx1002-6630201511042.

［5］葉子弘， 趙煦弘， 鄒克琴， 等. 生物標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究簡(jiǎn)析［J］. 中國(guó)計(jì)量，2009（4）: 67-69.

［6］王晶. 生物計(jì)量: 一個(gè)嶄新的科學(xué)領(lǐng)域［J］. 中國(guó)計(jì)量， 2004（3）: 5-6.

［7］張紅. 論計(jì)量器具產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)在現(xiàn)代計(jì)量中的重要性［J］. 計(jì)量與測(cè)試技術(shù)， 2008（12）: 59-61.

［8］俞曉平， 葉子弘， 蔣家新， 等. 生物計(jì)量及其在檢驗(yàn)檢疫中的應(yīng)用研究［J］. 中國(guó)計(jì)量學(xué)院報(bào)， 2008， 19（4）: 289-295.

［9］盧曉華， 李紅梅， 郭敬. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)領(lǐng)域總體發(fā)展趨勢(shì)［J］. 中國(guó)計(jì)量，2010（7）: 75-76.

［10］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局. SN/T 1750—2006 動(dòng)物源性食品中抗生素類藥物殘留檢測(cè)方法: 微生物抑制法［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

［11］ 任春磊. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料菌群輻照抗性分布的實(shí)驗(yàn)研究［D］. 北京: 軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院， 2006.

［12］ 衛(wèi)生部. GB 4789.2—2010 食品微生物學(xué)檢驗(yàn): 菌落總數(shù)測(cè)定［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2010.

［13］ 葉晴， 尹光琳. 用真空冷凍干燥法保存微生物菌株［J］. 現(xiàn)代科學(xué)儀器， 2000（4）: 19-20.

［14］ 朱敖蘭， 楊潔. 生物制品凍干保護(hù)劑及其保護(hù)機(jī)理的研究進(jìn)展［J］.喀什師范學(xué)院學(xué)報(bào)， 2007， 28（6）: 26-28.

［15］ ALISON S D， THEODORE W R. Effects of drying methods and additives on structure and function of actin［J］. Archives of Biochemistry and Biophysics， 1998， 64（3）: 171-181.

［16］ HUANG Lijin， LU Zhaoxin， YUAN Yougjun. Optimization of a protective medium for enhancing the viability of freeze-dried Lactobacillus delbrueckii subsp. Bulgricus based on response surface methodology［J］. Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology， 2006， 33（1）: 55-61.

［17］ 黃鑫. 乳粉中阪崎腸桿菌標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備［D］. 福州: 福建農(nóng)林大學(xué)，2009.

［18］ 施昌彥. 測(cè)量準(zhǔn)確度、重復(fù)性、復(fù)現(xiàn)性及標(biāo)準(zhǔn)偏差［J］. 中國(guó)計(jì)量，2000（4）: 51-52.

［19］ 李鵬剛， 劉眾宣. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的均勻性檢驗(yàn)［J］. 機(jī)械工程師， 2010（8）: 32-33.

［20］ 闞瑩， 張正東. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)均勻性檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)量F的判斷［J］. 中國(guó)計(jì)量，2010（4）: 78-79.

［21］ 韓永志. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的定值［J］. 化學(xué)分析計(jì)量， 2001， 10（5）: 38-39.

［22］ 韓永志. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)不確定度的給定與評(píng)定［J］. 地質(zhì)實(shí)驗(yàn)室， 1995（3）: 162-163.

［23］胡曉燕. 論測(cè)量不確定度［J］. 理化檢驗(yàn): 化學(xué)分冊(cè)， 2002， 38（8）: 406-409. ［24］ 楊力. 電子天平測(cè)量不確定度評(píng)定［J］. 煤質(zhì)技術(shù)， 2008（1）: 41-42.

［25］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)疫總局. JJG 646—2006 移液器檢定規(guī)程［S］. 北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2006.

［26］ 國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)疫總局. JJG 1036—2008 電子天平檢定規(guī)程［S］.北京: 中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社， 2008.

［27］ 韓永志. 標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的穩(wěn)定性監(jiān)測(cè)及評(píng)價(jià)［J］. 化學(xué)分析計(jì)量， 2001，10（4）: 37-79.

Preparation of Reference Materials for Shigella

KE Lu， DAI Xiaoli， LIN Jie*， HUANG Changjiao， ZENG Weiyang， ZHANG Wenling
（Fujian Provincial Key Laboratory of Inspection and Quarantine Technology Research， Center of Technology，F(xiàn)ujian Entry-Exit Inspection and Quarantine Bureau， Fuzhou350003， China）

This study aimed to prepare reference materials for Shigella by a freeze-drying method. Orthogonal array design was applied to choose the optimal formulation of lyoprotectant that provided maximum protection effi ciency. Chicken powder was used as the substrate for reference materials， which was mixed proportionally with the lyoprotectant and freeze-dried after addition of the fresh bacterial solution with a predetermined number of cells. The reference materials had a characteristic value （bacterial count） of 530 CFU/bottle with an uncertainty of 24 CFU/bottle. At -20 and 4 ℃ the freeze-dried samples could be stored for 12 months with good stability of the characteristic value. At 25 ℃，the storage life of the freeze-dried samples was 9 months， during which the characteristic value remained stable. However， at 60 ℃， the stability was poor.

Shigella sonnei； reference materials； matrix； chicken

TS207.4

A

1002-6630（2015）24-0253-07

10.7506/spkx1002-6630-201524047

2015-06-23

福建出入境檢驗(yàn)檢疫局科技計(jì)劃項(xiàng)目（FK2013-22）

柯璐（1987—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物及動(dòng)物毒理學(xué)研究。E-mail：15980216539@163.com

林杰（1968—），男，高級(jí)工程師，本科，主要從事食品微生物研究。E-mail：lj19102102@sina.com