王 晨，李曉明，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京　　210097）

氣相色譜法檢測(cè)飲料中二羰基化合物

王 晨，李曉明，盧永翎，鄭鐵松，呂麗爽*

（南京師范大學(xué)金陵女子學(xué)院，江蘇 南京210097）

建立同時(shí)在線檢測(cè)丙酮醛和乙二醛的氣相色譜方法。確定檢測(cè)二羰基化合物的最佳條件為：以丁二酮為內(nèi)標(biāo)，以鄰苯二胺為衍生化試劑，鄰苯二胺的用量67 倍于二羰基化合物、衍生化時(shí)間10 min、萃取溶劑二氯甲烷、超聲時(shí)間15 min、萃取2 次、柱箱初始溫度40 ℃、程序升溫5 ℃/min，色譜柱載氣流量2.0 mL/min，分流比1∶1。丙酮醛和乙二醛的定量限（RSN≈10）分別為0.06 mg/L和0.08 mg/L，檢出限（RSN≈ 3）分別為0.02 mg/L和0.03 mg/L，方法靈敏度高。

丙酮醛；乙二醛；氣相色譜

非酶糖基化終末產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是蛋白質(zhì)非酶糖基化過程產(chǎn)生的一系列反應(yīng)的終產(chǎn)物，還原糖和蛋白質(zhì)中的氨基酸基團(tuán)發(fā)生非酶促褐變反應(yīng)［1］。正常情況下，在人體內(nèi)AGEs維持在一個(gè)平衡狀態(tài)，但當(dāng)內(nèi)源［2-3］AGEs積累過多或者外源攝入［4-5］過多的AGEs時(shí)，會(huì)引起阿茲海默癥［6］以及糖尿病并發(fā)癥（如：糖尿病性腎病［7］和糖尿病性視網(wǎng)膜疾?。?］），從而對(duì)機(jī)體造成很大的損傷。AGEs的形成的過程中，中間產(chǎn)物如：丙酮醛（methylglyoxal，MGO）、乙二醛（glyoxal，GO）等可以引起蛋白質(zhì)交聯(lián)，形成交聯(lián)性的糖基化終末產(chǎn)物［9-10］，破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能［11］，引起組織的損傷［12］，在蛋白質(zhì)糖基化過程中發(fā)揮重要作用。近年來，研究發(fā)現(xiàn)在一些食品中檢測(cè)到二羰基化合物（dicarbonyl compounds，α-DCC），包括飲料［13-14］、餅干［5］、蜂蜜［15］、咖啡［16］和面包［17］，而這些活性α-DCC，有可能進(jìn)一步誘發(fā)食品中AGEs的產(chǎn)生。所以，建立一套能快速、有效地檢測(cè)α-DCC的方法，對(duì)于分析體內(nèi)外，以及食品加工和貯藏過程中α-DCC，抑制AGEs形成具有十分重要的意義。

目前，檢測(cè)α-DCC的主要方式有液相色譜法、氣相色譜法（gas chromatography，GC）和電化學(xué)檢測(cè)法，其中液相色譜法由于其衍生化試劑種類豐富，運(yùn)行時(shí)間短，在檢測(cè)α-DCC的應(yīng)用中最為普遍。Degen等［18］以喹喔啉類物質(zhì)為內(nèi)標(biāo)，用高效液相色譜-紫外檢測(cè)（high performance liquid chromatography-ultraviolet detection，HPLC-UV）法檢測(cè)果汁、醋和餅干中的MGO、GO、3-葡萄 糖醛酮（3-deoxyglucosone，3-DG）、3-脫氧半乳糖（3-deoxygalactosone，3-DGal）和3-脫氧-1，2-二酮戊糖（3-deoxyp entoson，3-DPs）；Gensberger等［19］用超高效液相色譜聯(lián)用二極管陣列-串聯(lián)質(zhì)譜（ultrahighperformance liquid chromatography with hyphenated diode array-tandem mass spectrometry，UHPLC-DAD-MS-MS）法檢測(cè)軟飲料中的MGO、GO、3-DG、葡糖醛酮、3-DGal、1-DG和3，4-二脫氧葡糖醛酮-3-烯。Randell等［20］以2，3-己烷二酮和5-甲基喹喔啉作為內(nèi)標(biāo)，用LC-MS聯(lián)用法檢測(cè)小鼠血液中的MGO。Tang Dan等［21］在研究中藥材虎杖粗提物和其活性成分抑制MGO的實(shí)驗(yàn)中，以鄰苯二胺為衍生化試劑，用5-甲基喹喔啉作為內(nèi)標(biāo)，在紫外波長(zhǎng)315 nm處檢測(cè)。王麗蘋［22］、Bao Mingliang［23］等在檢測(cè)羰基化合物時(shí)，先將其衍生化為色譜可檢測(cè)的另一種物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)在檢測(cè)α-DCC之前，首先要把MGO和GO衍生化為2-甲基喹喔啉和喹喔啉，才能被檢測(cè)出來。文獻(xiàn)［5，14，18，24］均以鄰苯二胺為衍生化試劑，將二羰基化合物衍生化為喹喔啉類物質(zhì)后，進(jìn)行檢測(cè)。

Khuhawar等［25］用GC-氫火焰離子檢測(cè)器（GC-hydrogen flame ion detector，GC-FID）檢測(cè)MGO和GO，選擇間苯二甲酸二烯丙酯（diallyl isophthalate，DAP）作為衍生化試劑，在最佳衍生化pH 3條件下，在0.09～1.04 μg/mL檢測(cè)范圍內(nèi)，檢測(cè)限達(dá)到40 ng/mL，整個(gè)檢測(cè)時(shí)間設(shè)定在2.6 min，但主要存在以下2 點(diǎn)問題：1）反應(yīng)最佳pH值為3，應(yīng)用范圍有限。2）反應(yīng)運(yùn)行時(shí)間太短，體系目標(biāo)峰與雜質(zhì)峰不能有效的分離，尤其是在復(fù)雜的食品體系中更復(fù)雜，影響定量測(cè)定。因此，有待進(jìn)一步優(yōu)化。α-DCC分子質(zhì)量低，易于氣化，相比于LC法，GC法運(yùn)行成本較低，且FID靈敏度高，對(duì)大多數(shù)有機(jī)物都有響應(yīng)。本實(shí)驗(yàn)擬選用GC法分析活性α-DCC的含量，建立用GC-FID同時(shí)在線檢測(cè)MGO、GO的方法，檢測(cè)市售10 種固體飲料中的α-DCC，為控制食品加工和貯藏過程中，有害α-DCC的測(cè)定提供理論依據(jù)。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

固體飲料市售；乙酸乙酯、二氯甲烷（均為分析純）、三氯甲烷（色譜純）南京化學(xué)試劑有限公司；磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、乙醛、2，3-丁二酮、2，3-己烷二酮、3，4-己烷二酮（均為分析純）上海國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；MGO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%）、GO（質(zhì)量分?jǐn)?shù)40%）、衍生化試劑鄰苯二胺（O-phenylenediamine，DB）美國(guó)Sigma-Aldrich公司；純凈水杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

7820GC系統(tǒng)（手動(dòng)進(jìn)樣器、柱溫箱、FID檢測(cè)器）美國(guó)Agilent公司；XW-80A微型漩渦混合儀上海滬西分析儀器廠有限公司；HH-6數(shù)顯恒溫水浴鍋金壇市富華儀器有限公司；FA2104N電子分析天平上海精密科學(xué)儀器有限公司；PHS-3C數(shù)字式pH計(jì)上海三信儀表廠；KQ-300B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；HGC-12A氮?dú)獯蹈蓛x上海Hengao T&D公司。

1.3方法

1.3.1GC條件

HP-5色譜柱（30 m×0.32 mm i.d.，0.25 μm）；進(jìn)樣溫度250 ℃；壓力10 psi；分流比1∶1；升溫程序：初始值40 ℃，保持1 min；程序升溫第1階段4 ℃/min，升至140 ℃，保持1 min；第2階段50 ℃/min，升至250 ℃，保持1 min；FID溫度280 ℃；載氣流量：H2流量30 mL/min；空氣流量300 mL/min；N2流量25 mL/min；總運(yùn)行時(shí)間30.2 min。

1.3.2目標(biāo)峰的確立

1.3.2.1MGO和GO色譜峰的確立

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)40% MGO溶液和GO溶液和純凈水總共4 mL，使MGO質(zhì)量濃度分別為72、36、18、7.2 mg/L，GO質(zhì)量濃度分別為58、29、14.5、5.8 mg/L，然后在樣品管中加入1 mL 100 mmol/L DB，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴加熱15 min，冰浴后在室溫條件下加入2 mol/L乙醛1 mL，將上述溶液體系混合均勻后在60 ℃水浴加熱15 min，冰浴后在室溫條件下加入4 mL二氯甲烷，超聲波萃取15 min，萃取3 次。氮?dú)獯蹈珊笥?.5 mL二氯甲烷復(fù)溶，取1 μL進(jìn)入GC檢測(cè)。

1.3.2.2內(nèi)標(biāo)峰的選擇

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入純凈水4 mL，然后分別加入1 mmol/L的2，3-丁二酮、2，3-己烷二酮、3，4-己烷二酮0.5 mL，具體衍生化方法同1.3.2.1節(jié)，GC進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3衍生化條件的建立

1.3.3.1衍生化試劑用量的選取

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，然后加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL，分別加入20、50、100、200 mmol/L DB 1 mL，剩余衍生化步驟同1.3.2.1節(jié)方法，GC進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.2衍生化時(shí)間的選取

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，然后分別加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL、100 mmol/L DB 1 mL，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴分別加熱10、15、20、25 min，剩余衍生化步驟同1.3.2.1節(jié)方法，GC進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.3過量衍生物去除劑乙醛用量的確定

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液各0.5 mL，然后分別加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL、100 mmol/L DB 1 mL，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴分別加熱10 min，冰浴后在室溫條件下分別加入0、0.5、1、2 mol/L乙醛1 mL，剩余衍生化步驟同1.3.2.1節(jié)方法，GC進(jìn)行檢測(cè)。

1.3.3.4萃取溶劑的選取

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，然后分別加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL、100 mmol/L DB 1 mL，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴分別加熱10 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mol/L乙醛1 mL，將上述體系混合均勻后在60 ℃水浴加熱15 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mL二氯甲烷、三氯甲烷、乙酸乙酯溶液，超聲波萃取15 min，萃取3 次。氮?dú)獯蹈珊蠓謩e用0.5 mL相應(yīng)溶液復(fù)溶，取1 μL進(jìn)入GC檢測(cè)。

1.3.3.5萃取方式的確定

根據(jù)文獻(xiàn)［24］的測(cè)定方法加以改進(jìn)，在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，然后分別加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL、100 mmol/L DB 1 mL，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴分別加熱15 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mol/L乙醛1 mL，將上述體系混合均勻后在60 ℃水浴加熱15 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mL二氯甲烷，分別采取超聲波15 min 1、2、3 次，振蕩3、5 min這5 種方式進(jìn)行萃取。氮?dú)獯蹈珊蠓謩e用0.5 mL相應(yīng)萃取溶液復(fù)溶，取1 μL進(jìn)入GC檢測(cè)。

1.3.4色譜條件的確定

1.3.4.1柱箱初始溫度的選取

依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件，參照1.3.1節(jié)方法，對(duì)柱箱初始溫度40、50、60、70 ℃進(jìn)行考察。

1.3.4.2升溫方式的確定

依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件，在1.3.4.1節(jié)色譜條件基礎(chǔ)上，對(duì)程序升溫方式4、5、6、8 ℃/min進(jìn)行考察。

1.3.4.3色譜柱載氣流量的選取

依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件，在1.3.4.2節(jié)色譜條件基礎(chǔ)上，對(duì)色譜柱載氣流量1.0、1.5、2.0、2.5 mL/min進(jìn)行考察。

1.3.4.4分流比的確定

依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件，在1.3.4.3節(jié)色譜條件基礎(chǔ)上，對(duì)色譜柱分流比1∶1、2∶1、5∶1、1∶10和不分流進(jìn)行考察。

1.3.5方法學(xué)的考察

1.3.5.1線性關(guān)系

取MGO和GO的對(duì)照品適量，分別精密稱定，用純凈水溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度50 mg/L的混合溶液，取2，3-丁二酮的對(duì)照品適量，用純凈水溶解并定量稀釋制成質(zhì)量濃度86 mg/L的溶液。精密吸取MGO與GO混合溶液0.4、1、2、4、6、8、10 mL于10 mL容量瓶中，用純凈水定容到刻度，搖勻，取出1 mL于15 mL樣品管中，然后加入0.5 mL 2，3-丁二酮稀釋液，依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件與1.3.4節(jié)選出的色譜學(xué)最優(yōu)方法注入GC儀進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算MGO與GO和內(nèi)標(biāo)丁二酮的峰面積之比（R），并以峰面積之比（R）對(duì)質(zhì)量濃度（C，mg/L）進(jìn)行線性回歸。

1.3.5.2定量限和檢出限

取MGO和GO低質(zhì)量濃度對(duì)照品溶液，分別逐級(jí)稀釋并進(jìn)行GC測(cè)定。

1.3.5.3精密度

在15 mL樣品管中，加入1 mmol/L MGO與GO樣品標(biāo)準(zhǔn)液0.5 mL，然后加入1 mmol/L 2，3-丁二酮溶液0.5 mL，依據(jù)1.3.3節(jié)選出的衍生化最優(yōu)條件與1.3.4節(jié)選出的色譜學(xué)最優(yōu)方法，對(duì)同一個(gè)樣品連續(xù)進(jìn)樣6 次，取平均值，計(jì)算MGO與GO和內(nèi)標(biāo)丁二酮的峰面積之比，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中。

1.3.6固體飲料中α-DCC的檢測(cè)

精確稱取市售固體飲料1 g，溶于10 mL 100 mmol/L磷酸鹽緩沖溶液中，超聲10 min至完全溶解，取2 mL并加入4 mL甲醇，超聲10 min，然后置于－40 ℃冰箱2 h，13 000 r/min離心15 min，取上清液3 mL，加入1 mmol/L 2，3-丁二酮0.5 mL、100 mmol/L DB 1 mL，蓋緊樣品管蓋，60 ℃水浴分別加熱15 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mol/L乙醛溶液1 mL，將上述體系混合均勻后在60 ℃水浴加熱15 min，冰浴后在室溫條件下分別加入2 mL二氯甲烷溶液，分別采取超聲波15 min萃取2 次。氮?dú)獯蹈珊蠓謩e用0.5 mL相應(yīng)萃取溶液復(fù)溶，取1 μL進(jìn)入GC檢測(cè)。

2　　結(jié)果與分析

2.1色譜峰的確立

圖 1　　色譜峰的確立Fig.1　　Establishment of chromatographic peaks

在體系的內(nèi)標(biāo)濃度為1 mmol/L條件下，考察2，3-丁二酮為內(nèi)標(biāo)色譜峰，結(jié)果如圖1所示?？梢赃x擇的內(nèi)標(biāo)物有以下幾種：2，3-丁二酮、3，4-己烷二酮、2，3-己烷二酮、5-甲基喹喔啉。以鄰苯二胺為衍生化試劑，采用內(nèi)標(biāo)參與MGO、GO共同衍生化的方式，分別形成2-甲基喹喔啉、喹喔啉。內(nèi)標(biāo)參與共衍生化，與單一內(nèi)標(biāo)物相比，可以有效地減少在衍生化過程中，由于衍生化不徹底以及操作帶來的損失，使定量測(cè)定更為準(zhǔn)確。過量的衍生化試劑DB與乙醛反應(yīng)，去除干擾。

由圖1可以看出，以丁二酮為內(nèi)標(biāo)的組在20.11 min出現(xiàn)比較明顯的色譜峰，此色譜峰在MGO（17.50 min）、GO（15.10 min）色譜峰后，與MGO、GO保留時(shí)間差距不大，但無干擾，可見丁二酮色譜峰周圍不存在其他雜質(zhì)峰，干擾內(nèi)標(biāo)的定量測(cè)定。而2，3-己烷二酮與3，4-己烷二酮內(nèi)標(biāo)峰保留時(shí)間長(zhǎng)，其色譜峰會(huì)被在29.35 min的大色譜峰包裹。29.35 min出現(xiàn)的大色譜峰是由過量的乙醛和內(nèi)標(biāo)反應(yīng)形成的五元環(huán)狀物質(zhì)，與文獻(xiàn)［26］報(bào)道機(jī)理一致，故選取2，3-丁二酮為內(nèi)標(biāo)。

2.2衍生化條件的確定

表1　樣品衍生化及預(yù)處理優(yōu)化TTaabbllee 11 　　OOppttiimmiizzaattiioonn ooff ccoonnddiittiioonnss ffoorr ddeerriivvaattiizzaattiioonn aanndd pretreatment of samplleess

2.2.1衍生化試劑用量

衍生化試劑的用量對(duì)于MGO、GO的衍生化過程和定量測(cè)定有著極其重要的作用，Sang Shengming等［27］建立HPLC-DAD法考察MGO、GO與DB的衍生化反應(yīng)，在37 ℃條件下，DB的加入量是MGO/GO的10～20 倍時(shí)，反應(yīng)10 min，MGO和GO可以衍生化完全。Tan Di等［24］建立GC-FID法檢測(cè)飲料中的MGO，衍生化試劑DB的添加量為20 mmol/L，20 倍于α-DCC的量，反應(yīng)時(shí)間15 min。本實(shí)驗(yàn)體系中存在乙二醛、丙酮醛、2，3-丁二酮3 種α-DCC，這3 種物質(zhì)同時(shí)與DB發(fā)生衍生化反應(yīng)，若衍生化試劑不足量時(shí)，3 種物質(zhì)會(huì)發(fā)生競(jìng)爭(zhēng)衍生化反應(yīng)；若衍生化試劑足量甚至過量時(shí)，GO、MGO、2，3-丁二酮與DB反應(yīng)完全，其測(cè)定值趨于穩(wěn)定，不再發(fā)生變化，如表1所示。當(dāng)衍生化試劑的量達(dá)到100 mmol/L以上，60 ℃條件下反應(yīng)15 min，GC圖中MGO、GO與內(nèi)標(biāo)的峰面積比趨于穩(wěn)定。而當(dāng)衍生化試劑不足量時(shí)，由于內(nèi)標(biāo)物未能完全衍生化，測(cè)定值忽高忽低不穩(wěn)定。

2.2.2衍生化時(shí)間的考察

衍生化時(shí)間對(duì)于MGO、GO的衍生化是否完全和定量是否準(zhǔn)確起著較為重要的作用，當(dāng)衍生化時(shí)間不足時(shí)，體系中存在的GO、MGO和2，3-丁二酮這3 種α-DCC 和DB衍生化反應(yīng)的速率不同，會(huì)競(jìng)爭(zhēng)性地與DB反應(yīng)，從而引起，最終MGO和GO的測(cè)定值會(huì)有較大差異。

如表1所示，在反應(yīng)10～25 min時(shí)間內(nèi)，MGO與GO的值隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)沒有發(fā)生明顯變化，由此表明10 min時(shí)MGO、GO、丁二酮都已經(jīng)衍生化完全，且隨著反應(yīng)時(shí)間的延長(zhǎng)，MGO、GO和內(nèi)標(biāo)的衍生化產(chǎn)物很穩(wěn)定。故選取衍生化時(shí)間為10 min。

2.2.3衍生化試劑去除劑用量的確定

本實(shí)驗(yàn)中選擇乙醛去除多余的衍生化試劑，防止過量的衍生化試劑對(duì)于色譜峰的干擾。1分子的DB可以和1～2分子的乙醛反應(yīng)，形成五元環(huán)狀物質(zhì)。Tan Di等［24］建立GC-FID法檢測(cè)飲料中的MGO，當(dāng)乙醛的量為鄰苯二胺的20 倍時(shí)，乙醛能夠與多余的DB反應(yīng)完全。當(dāng)不加入乙醛時(shí)，多余的衍生化試劑DB出峰時(shí)間與MGO-DB衍生化產(chǎn)物相近，完全干擾了MGO的測(cè)定。所以通過加入乙醛去除多余的DB。如表1所示，當(dāng)加入乙醛濃度為2 mol/L時(shí)，能起到很好地屏蔽多余衍生化試劑的作用。

2.2.4萃取溶劑的確定

萃取溶劑的選擇主要取決于衍生化產(chǎn)物在有機(jī)相中的萃取效率及可操作性。乙酸乙酯、二氯甲烷和三氯甲烷3 種溶劑的極性依次為：乙酸乙酯＞二氯甲烷＞三氯甲烷。由表1可得，3 種衍生化試劑都能對(duì)MGO、GO、丁二酮與DB的反應(yīng)產(chǎn)物有良好的萃取效果，萃取溶劑對(duì)MGO、GO含量的測(cè)定無顯著性影響。3 種溶劑的沸點(diǎn)依次：乙酸乙酯77.2 ℃、二氯甲烷39.8 ℃、三氯甲烷61.3 ℃，二氯甲烷的揮發(fā)性最好，氮吹時(shí)間較短，因此選擇二氯甲烷作為萃取溶劑。

2.2.5萃取次數(shù)的考察

超聲波萃取利用超聲波輻射壓強(qiáng)產(chǎn)生的強(qiáng)烈空化應(yīng)效應(yīng)、機(jī)械振動(dòng)、擾動(dòng)效應(yīng)、高的加速度、乳化、擴(kuò)散、擊碎和攪拌作用等多級(jí)效應(yīng)，增大物質(zhì)分子運(yùn)動(dòng)頻率和速度，增加溶劑穿透力，從而加速目標(biāo)成分進(jìn)入溶劑，促進(jìn)提取的進(jìn)行。旋渦振蕩萃取5 min后測(cè)定的MGO質(zhì)量濃度為30.08 mg/L，GO的質(zhì)量濃度為22.15 mg/L，比較超聲萃取的效果（萃取2 次）MGO質(zhì)量濃度為36.05 mg/L，GO質(zhì)量濃度為28.35 mg/L來說，萃取不完全。實(shí)驗(yàn)表明，超聲波萃取在穩(wěn)定性和萃取效果上明顯高于旋渦振蕩器，從表1可以得到，萃取率（萃取3 次）≈萃取率（萃取2 次）＞萃取率（萃取1 次），而超聲萃取2 次和3 次的效果基本一致，所以選擇超聲萃取2 次。

2.3色譜條件的確定

2.3.1初始溫度的考察

表2　色譜條件的優(yōu)化Taabbllee 22 　　OOppttiimmiizzaattiioonn ooff cchhrroommaattooggrraapphhiicc ccoonnddiittiioonnss

柱箱初始溫度的改變不影響MGO、GO、內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)保留時(shí)間差，但影響其保留時(shí)間和總運(yùn)行時(shí)間。由表2可以看出，柱箱初始溫度40、50、60、70 ℃時(shí)，MGO、GO的測(cè)定值基本不變，由于考慮將程序升溫的初始溫度升高可能在調(diào)節(jié)程序升溫和流速后會(huì)產(chǎn)生較多的干擾雜峰，所以選擇40 ℃作為柱箱初始溫度。

2.3.2程序升溫方式的考察

程序升溫速率的改變，不但影響MGO、GO、內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間和總運(yùn)行時(shí)間，而且影響MGO、GO、內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)保留時(shí)間差（表2）。另外，程序升溫速率4～8 ℃/min時(shí)，隨著升溫速率增大，目標(biāo)色譜峰周圍的雜質(zhì)峰也越多，干擾其測(cè)定結(jié)果。所以選擇5 ℃/min。

2.3.3色譜柱載氣流量的考察

色譜柱載氣流速的改變，不但影響MGO、GO、內(nèi)標(biāo)峰的保留時(shí)間和總運(yùn)行時(shí)間，而且影響MGO、GO、內(nèi)標(biāo)峰的相對(duì)保留時(shí)間差。由表2可以看出，色譜柱載氣流速1～2.5 mL/min范圍內(nèi)，MGO和GO的含量沒有顯著性變化，提高載氣流量會(huì)縮短運(yùn)行時(shí)間，但隨之而來的是目標(biāo)色譜峰周圍的雜質(zhì)峰增多，干擾測(cè)定，因此選擇流速2 mL/min。

2.3.4分流比的考察

當(dāng)GC進(jìn)樣量過大時(shí)，將考慮柱前分流問題。而分流比的大小取決于檢測(cè)器的靈敏度及線性范圍，出峰的大小，樣品成分的響應(yīng)大小。

由表2可以看出，分流比為1∶1或者2∶1時(shí)，MGO、GO的含量無顯著性差別。當(dāng)不分流時(shí)，MGO色譜峰和GO色譜峰會(huì)包裹其周圍的基質(zhì)雜質(zhì)峰，引起MGO、GO的測(cè)定干擾，當(dāng)分流比為5∶1或10∶1時(shí)，MGO、GO峰其出峰較小，背景雜質(zhì)對(duì)其有一定的干擾，無法達(dá)到基線分離，會(huì)引起測(cè)定干擾。當(dāng)不分流時(shí)，進(jìn)樣量大，雜質(zhì)干擾較大。而當(dāng)分流比超過5∶1時(shí)，樣品響應(yīng)值過低，無法定量GO的含量（表2）。分流比設(shè)定在1∶1～2∶1較為適合本測(cè)定方法。

2.4方法學(xué)的考察

2.4.1線性關(guān)系

圖2　MGO（a）和GO（b）標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2　　MGO and GO standard curves

由圖2可知，MGO的質(zhì)量濃度在0～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)得MGO的線性回歸方程為：R=0.017 5C+0.003 1（r=0.999 8）。GO的質(zhì)量濃度在0～50 mg/L范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。測(cè)得GO的線性回歸方程為：R=0.017 7C+0.003 4（r=0.999 4）。

2.4.2定量限和檢測(cè)限

逐級(jí)稀釋后測(cè)定的MGO和GO的定量限（RSN大于10，RSD小于2.0%）分別為0.06 mg/L（RSD=1.43%）和0.08 mg/L（RSD=1.08%），檢出限（RSN≈3）分別為0.02 mg/L和0.03 mg/L。

2.4.3精密度

表 3 精密度Table 3　　Precision of the method

由表3可知，6 次平行實(shí)驗(yàn)得出，MGO和GO的RSD分別為0.83%、0.95%，在藥典規(guī)定范圍內(nèi)（＜2%）。表明在規(guī)定的測(cè)定條件下，精密度良好。

2.5固體飲料中二羰基化合物的測(cè)定結(jié)果

表 4　固體飲料中α-DCC的測(cè)定結(jié)果Taabbllee 44 　　DDeetteerrmmiinnaattiioonn ooff ddiiccaarrbboonnyyll ccoommppoouunnddss iinn ppoowwddeerreedd bbeevveerraaggeess μg/g

采用本實(shí)驗(yàn)建立的檢測(cè)MGO和GO的GC方法，對(duì)市售10 種不同的固體飲料進(jìn)行檢測(cè)，如表4所示，其中MGO含量最高達(dá)到44.06 μg/g，GO含量最高達(dá)到15.87 μg/g，GO和MGO作為活性中間體攝入會(huì)進(jìn)一步誘發(fā)AGEs的產(chǎn)生，由此經(jīng)常飲用固體飲料會(huì)對(duì)人體帶來潛在的危害。

3　　結(jié) 論

通過對(duì)樣品衍生化條件和色譜條件的優(yōu)化，建立了一種同時(shí)測(cè)定MGO和GO的GC方法。具體為：以丁二酮為內(nèi)標(biāo)，以DB為衍生化試劑，DB用量為1 mL （100 mmol/L）、衍生化時(shí)間10 min、除去DB的乙醛用量1 mL（2 mol/L）、萃取溶劑二氯甲烷2 mL、超聲萃取2 次、柱箱初始溫度40 ℃、程序升溫5 ℃/min、色譜柱載氣流量2 mL/min，分流比1∶1。并將此方法應(yīng)用于市售10 種固體飲料中二羰基化合物進(jìn)行檢測(cè)。表明本實(shí)驗(yàn)所建立的檢測(cè)方法較簡(jiǎn)便、快速、成本低，對(duì)MGO和GO同時(shí)在線檢測(cè)具有一定的實(shí)際意義。

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Detection of Dicarbonyl Compounds in Beverages by Gas Chromatography

WANG Chen， LI Xiaoming， LU Yongling， ZHENG Tiesong， Lü Lishuang*（Ginling College， Nanjing Normal Uni versity， Nanjing210097， China）

This study established an effi cient method for the detection of methylglyoxal （MGO） and glyoxal （GO） with a gas chromatograph （GC）. The optimum experimental conditions were set as follows： ratio of O-phenylenediamine to α-dicarbonyl compounds， 67； derivatization time， 10 min； extraction solvent， methylene chloride； ultrasonic extraction time， 15 min； and the number of extraction， 2. The injector was operated in split mode with a split ratio of 1：1， and the carrier gas （helium）fl ow rate through the chromatographic column was 2.0 mL/min. The GC oven temperature was programmed as follows： the initial oven temperature was set as 40 ℃ and then increased at a rate of 5 ℃/min. The minimum quantitation limits （RSNapproximately equal to 10） and detection limits （RSNapproximately equal to 3） for MGO and GO were 0.06 and 0.08 mg/L，and 0.02 and 0.03 mg/L， respectively. This method was sensitive and effi cient.

methylglyoxal （MGO）； glyoxal （GO）； gas chromatography （GC）

TS201.2

A

1002-6630（2015）24-0235-07

10.7506/spkx1002-6630-201524044

2015-03-31

江蘇省基礎(chǔ)研究計(jì)劃（自然科學(xué)基金）資助項(xiàng)目（BK2012850）

王晨（1991—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称房茖W(xué)。E-mail：839541621@qq.com

呂麗爽（1969—），女，副教授，博士，研究方向?yàn)槭称坊瘜W(xué)和功能性食品。E-mail：lishuanglv@126.com