朱廣躍，楊 衛(wèi)，吳 健，馬翠云，趙 毅，吳 笛，高小雪，戴桂馥*（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州　450001）

HPLC法定量分析微生物法制備液中產(chǎn)物γ-氨基丁酸和底物L(fēng)-谷氨酸

朱廣躍，楊 衛(wèi)，吳 健，馬翠云，趙 毅，吳 笛，高小雪，戴桂馥*
（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450001）

建立一種測定微生物法制備液中γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）和L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）的高效液相色譜法。 樣品經(jīng)10%三氯乙酸溶液預(yù)處理后，用4 mmol/L氯甲酰芴甲酯進行柱前衍生。采用Phenomenex C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以A ［50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V）］∶B［50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，V/V）］=30∶70為流動相，流速1.0 mL/min，柱溫40 ℃洗脫，檢測波長265 nm。該方法穩(wěn)定、靈敏、測定周期短、重復(fù)性好。在GABA和L-Glu質(zhì)量濃度為20～400 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系。與常用衍生劑鄰苯二甲醛相比，衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性更好，且無需梯度洗脫。

高效液相色譜；微生物制備液；γ-氨基丁酸；L-谷氨酸；氯甲酰芴甲酯

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一種廣泛分布在生物體內(nèi)的功能性非蛋白質(zhì)氨基酸，是哺乳動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)一種重要的抑制性神經(jīng)遞質(zhì)，具有降血壓、降血氨、改善腦細胞、促進睡眠和改善記憶力等生理功能［1-4］。其生物合成 原理是以L-谷氨酸（L-glutamic，L-Glu）為底物經(jīng)谷氨酸脫羧酶催化獲得［5-6］。微生物轉(zhuǎn)化法是食品級GABA的主要制備方法［7-8］。微生物轉(zhuǎn)化法包括生長培養(yǎng)法和靜息法，前者指微生物菌體經(jīng)培養(yǎng)后，直接向培養(yǎng)基中投入底物進行轉(zhuǎn)化，從而得到GABA，該方法轉(zhuǎn)化液成分復(fù)雜，產(chǎn)物提取困難；后者是先將培養(yǎng)后的微生物菌體進行菌液分離，然后將得到的菌體投入到底物L(fēng)-Glu的溶液中進行轉(zhuǎn)化，從而得到較為純凈的轉(zhuǎn)化液［9-10］。

建立方便、快捷，特別是適應(yīng)復(fù)雜轉(zhuǎn)化液中定量分析GABA和L-Glu的方法，是微生物法工業(yè)制備GABA的前提條件。目前GABA定量分析方法主要有高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法、電泳法和紙層析法等［11-15］。

HPLC法測定GABA和L-Glu主要為柱前衍生法，應(yīng)用最廣泛的柱前衍生劑是鄰苯二甲醛［16-17］，但鄰苯二甲醛衍生產(chǎn)物存在不穩(wěn)定、易降解等缺點，難以適應(yīng)大量樣本的準確、快速測定［18-20］。氯甲酰芴甲酯（9-fluorenylmethyl chloroformate，F(xiàn)MOC-Cl）作為衍生劑具有衍生產(chǎn)物穩(wěn)定性好、無副反應(yīng)、靈敏度高等優(yōu)點，并且能與二級胺進行反應(yīng)［21-25］。然而，利用FMOC-Cl測定微生物制備液中GABA和L-Glu的研究國內(nèi)外鮮有報道。本實驗針對GABA微生物法制備液中主要含有GABA 和L-Glu的特點，以FMOC-Cl為柱前衍生劑，建立了一種HPLC法快速測定GABA和L-Glu含量的方法。

1　　材料與方法

1.1材料與試劑

甲醇、乙腈（均為色譜純）天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；四氫呋喃（分析純）天津市凱通化學(xué)試劑有限公司；乙酸鈉、冰醋酸（均為分析純）西隴化工股份有限公司；γ-氨基丁酸（純度≥99%）德國Sigma公司；L-谷氨酸（純度≥98%）、氯甲酰芴甲酯（分析純）上海紫一試劑廠。

1.2儀器與設(shè)備

1200 Series HPLC儀（包括G1322A脫氣機、G1310A四元泵、G1316A柱溫箱、G1314B VWD檢測器、7725i型手動進樣器）美國安捷倫科技公司；2-16型臺式離心機德國Sigma公司；明澈-D24UV純水儀德國默克密理博公司；BS223S型電子分析天平德國Sartorius公司；KQ5200DB型數(shù)控超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；PHS-3C型pH計上海鵬順科學(xué)儀器有限公司。

1.3方法

1.3.1HPLC條件

色譜柱：Phenomenex C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；柱溫：40 ℃；進樣體積：20 μL；檢測波長：265 nm；流動相A-流動相B體積比30∶70。

1.3.2流動相及衍生試劑的配制

50 mmo l/L乙酸鈉溶液：稱量4.101 5 g乙酸鈉溶于1 L水中，用稀釋5 倍的冰醋酸調(diào)節(jié)pH值。

流動相A：乙酸鈉溶液-甲醇-乙腈-四氫呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V）；流動相B：乙酸鈉溶液-甲醇-乙腈-四氫呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，V/V）；流動相A和流動相B使用之前均經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾。

4 mmol/L FMOC-Cl溶液：稱量0.052 g FMOC-Cl溶于50 mL乙腈中。

衍生緩沖液：pH 8.6的0.1 mol/L的硼砂-硼酸緩沖液。1.3.3標準溶液配制

準確稱量0.100 g GABA（或L-Glu）溶于適量水中，定容至100 mL，配制成1 000 μg/mL GABA（或L-Glu）母液。將母液稀釋5 倍得標準工作溶液。

1.3.4樣品處理及衍生

樣品處理：取200 μL含GABA的微生物轉(zhuǎn)化液于1.5 mL離心管中，加入800 μL 10%的三氯乙酸溶液，于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)2 h后，10 000 r/min離心10 min，取上清液稀釋適當倍數(shù)備用。

衍生方法：取40 μL標準工作溶液或樣品于0.5 mL離心管中，再加入90 μL超純水、80 μL硼酸-硼砂緩沖液（pH 8.6）、120 μL乙腈和80 μL FMOC-Cl溶液，混勻，于40 ℃水浴鍋中反應(yīng)5 min，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后即可用于HPLC分析。

2　　結(jié)果與分析

2.1衍生產(chǎn)物最大吸收峰測定結(jié)果

取400 μL GABA和L-Glu標準工作液（200 μg/mL）于試管中，按1.3.4節(jié)方法衍生，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾后用紫外分光光度計進行全波長掃描。

經(jīng)全波長掃描分析，衍生產(chǎn)物在波長249～266 nm處有最大吸收峰，所以進行HPLC分析時以265 nm作為紫外吸收波長效果最佳，見HPLC圖譜（圖1），表明GABA、L-Glu與衍生劑均可得到很好地分離，且峰形好。

圖 1 GABBAA和　　L-Glu標準工作液HPPLLCC圖譜Fig.1　HPLC chromatogram of mixed standard solution of GABA and L-Glu

2.2反應(yīng)時間對衍生反應(yīng)的影響

分別對GABA和L-Glu標準溶液進行衍生反應(yīng)，考察不同反應(yīng)時間對GABA和L-Glu峰面積的影響。由圖2可見，在5～20 min內(nèi)，隨著衍生時間的延長，GABA 和L-Glu的峰面積無明顯變化，說明反應(yīng)快且產(chǎn)物穩(wěn)定性好。為提高實驗的效率和準確性，選擇衍生反應(yīng)時間5 min為宜。

圖2　 衍生反應(yīng)時間對GABBAA和　　L-Glu峰面積的影響Fig.2　Infl uence of derivatization time on peak areas of GABA and L-Glu

2.3衍生劑濃度對衍生反應(yīng)的影響

圖3　 衍生劑濃度對GABBAA和　　L-Glu峰面積的影響Fig.3　The infl uence of concentration of the derivatization agent on peak areas of GABA and L-Glu

分別配制2.0～5.0 mmol/L的FMOC-Cl溶液，與GABA和L-Glu標準溶液分別進行衍生反應(yīng)，考察衍生劑濃度對GABA和L-Glu峰面積的影響。由圖3可見，在2.0～5.0 mmol/L范圍內(nèi)，隨著衍生劑濃度的增大，GABA和L-Glu的峰面積略有增加，但幅度很小。說明當衍生劑濃度為2 mmol/L時，GABA和L-Glu標準工作液已衍生充分。為確保衍生的徹底及保持衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，選用4 mmol/L作為后續(xù)實驗的衍生劑濃度。

2.4衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性分析

圖4　GABBAA和　　L-Glu衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性Fig.4　Stability of the derivatives of GABA and L-Glu

分別對GABA和L-Glu標準工作溶液衍生后，室溫條件下放置不同時間進行HPLC分析，考察衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性。由圖4可見，放置180 min以內(nèi)，GABA和L-Glu衍生產(chǎn)物穩(wěn)定；當放置460 min時GABA和L-Glu峰面積略有降低，但變化幅度不大。

2.5流動相pH值對保留時間的影響

分別配制乙酸鈉溶液pH值為4.5、4.8、5.0的流動相，對GABA和L-Glu標準工作溶液進行衍生后，進行HPLC分析，考察流動相pH值對保留時間的影響。在流動相pH值為4.5～5.0條件下，GABA、L-Glu和衍生劑均可分離，其中pH 4.8和pH 5.0分離效果更好（圖5）。兼顧保留時間，選擇流動相pH 4.8。

圖5　流動相pH值對GABBAA和　　L-Glu保留時間的影響Fig.5　Effect of mobile phase pH on retention times of GABA and L-Glu

2.6精密度分析

分別對GABA和L-Glu標準工作溶液進行衍生，采用HPLC進行分析，一日內(nèi)連續(xù)測定5 次，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)3 d進行測定，考察日間精密度。

分析系統(tǒng)的重復(fù)性是考察一種方法是否可靠的重要依據(jù)，考察HPLC法是否可靠，一般選擇保留時間和峰面積的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）作為方法可靠的依據(jù)。當一種分析方法的保留時間的RSD不大于1%，峰面積的RSD不大于2%時，可以認為該分析方法準確、可靠。

表1　　日內(nèi)精密度Table 1　　Intra-day precision of the method

日內(nèi)連續(xù)測定5 次，計算日內(nèi)精密度（表1）。L-Glu 和GABA保留時間的RSD分別為0.771%和0.387%，均小于1%；峰面積的RSD分別為0.738%和1.528%，均小于2%。連續(xù)3 d測定，計算日間精密度（表2），L-Glu和GABA保留時間RSD分別為0.693%和0.378%，均小于1%；峰面積RSD分別為0.570%和0.622%，均小于2%。綜上可知，建立的分析方法重復(fù)性好，可以達到定量分析的要求。

表2　　日間精密度Table 2　　Inter-day precision of the method

2.7標準曲線

經(jīng)預(yù)實驗分析GABA和L-Glu在20～400 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，當質(zhì)量濃度大于1 000 μg/mL時，測得的峰面積相對偏小。將GABA（20、60、100、200、300 μg/mL）和L-Glu（20、60、100、200、300、400 μg/mL）分別衍生，采用HPLC進行測定。以GABA 和L-Glu的質(zhì)量濃度為橫坐標，峰面積為縱坐標作圖，繪制標準曲線（表3）。

表 3 GABBAA和　　L-Glu的標準曲線Table 3　Standard curves of GABA and L--GGlluu

2.8樣品加標回收率

將GABA轉(zhuǎn)化液稀釋250 倍，分別與GABA或L-Glu含量為120、150、180 μg/mL的標準溶液以體積比1∶1混合，混合后衍生并進行HPLC分析。

樣品加標回收率是一種考察待測樣品在定量分析過程中樣品損失程度的方法。一般認為，回收率的RSD不大于3%時，即認為方法可靠，準確度高。

表 4 GABA樣品加標回收率

Table 4Recovery rates of spiked GABA

樣品/ （mg/L）標品/ （mg/L）回收率　　RSD/% 1　2　3　　平均值188.883 2　120　1.006 8　0.990 8　0.988 4　0.995 3 1.099 7 188.883 2　150　1.000 3　0.978 7　1.011 3　0.996 8 184.977 6　180　0.986 5　0.997 5　0.983 7　0.989 2

表 55 　L-Glu樣品加標回收率Table 5　Recovery rates of spiked L--GGlluu

GABA和L-Glu的樣品加標回收率分別見表4和表5。GABA和L-Glu的樣品加標回收率的RSD分別為1.099 7% 和1.425 0%，均小于3%，即認為該分析方法可靠，準確度高。

2.9樣品HPLC測定結(jié)果

將適量微生物制備液，經(jīng)三氯乙酸除去蛋白，衍生后，進行HPLC分析（圖6）。微生物制備液中含有的氨基酸主要為GABA和L-Glu，雜質(zhì)含量極少，并且2 種氨基酸不僅可以得到很好的分離，而且保留時間均較短，所以該方法可以用于GABA微生物制備液中GABA和L-Glu含量的快速分析測定。

圖6　 微生物發(fā)酵液HPLCC圖譜Fig.6　HPLC chromatogram of the microbial fermentation liquid

3　　結(jié) 論

微生物制備液是微生物菌體以L-Glu為底物進行發(fā)酵（轉(zhuǎn)化）而得到的主要含有GABA和L-Glu的混合溶液。針對微生物制備液的特點，本研究建立了一種HPLC定量分析GABA和L-Glu的方法。該方法采用FMOC-Cl衍生，流動相A［50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（82∶8.5∶8.5∶1，V/V）］∶B［50 mmol/L乙酸鈉溶液（pH 4.8）-甲醇-乙腈-四氫呋喃（22∶38.5∶38.5∶1，

V/V）］=30∶70，在柱溫40 ℃條件下進行洗脫。與常用衍生劑鄰苯二甲醛相比，大大提高了衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，且無需梯度洗脫。在GABA和L-Glu質(zhì)量濃度為20～

400 μg/mL范圍內(nèi)有良好的線性關(guān)系，且該測定方法穩(wěn)定、靈敏、周期短、基線平穩(wěn)、重復(fù)性好、操作簡便，適合大量樣本的快速準確分析。

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Quantitative Analysis of γ-Aminobutyric Acid and L-Glutamic Acid in Microbial Fermentation Broth by HPLC

Z HU Guangyue， YANG Wei， WU Jian， MA Cuiyun， ZHAO Yi， WU Di， GAO Xiaoxue， DAI Guifu*（School of Life Sciences， Zhengzhou University， Zhengzhou450001， China）

An improved high performance liquid chromatogra phy （HPLC） method for the determination of γ-aminobutyric acid （GABA） and L-glutamic acid （L-Glu） in microbial fermentation broth was developed. Amino acids in samples were derivatized with 4 mmol/L 9-fluorenylmethyl chloroformate （FMOC-Cl） after being pretreated with 10% trichloro acetic acid. The chromatographic separation was performed on a Phenomenex C18column （4.6 mm × 250 mm， 5 μm） using A ［50 mmol/L sodium acetate （pH 4.8）:methanol:acetonitrile:diethylene oxide = 82:8.5:8.5:1， V/V］ and B ［50 mmol/L sodium acetate （pH 4.8）:methanol:acetonitrile:diethylene oxide = 22:38.5:38.5:1， V/V］ （30:70， V/V） as mobile phas e at a fl ow rate of 1.0 mL/min. The chromatogram was detected at a wavelength of 265 nm with the column temperature being maintained at 40 ℃. This method was proved to be of good stability， high sensitivity， good repeatability and short determination period. The linear ranges for the analysis of γ-aminobutyric acid and L-glutamic acid were 20□400 μg/mL. Co mpared with those from the common derivatizing agent， o-phtha laldehyde （OPA）， the derivatives in the present me thod， without gradient elution， were more stable.

high performance liquid chromatography （HPLC）； microbial fermentation broth； γ-aminobutyric acid （GABA）；L-glutamic acid （L-Glu）； 9-fl uorenylmethyl chloroformate （FMOC-Cl）

TS202.3

A

1002-6630（2015）24-0190-05

10.7506/spkx1002-6630-201524035

2015-02-12

鄭州大學(xué)博士啟動基金項目

朱廣躍（1988—），男，碩士研究生，研究方向為微生物發(fā)酵與代謝工程。E-mail：516050581@qq.co m

戴桂馥（1963—），女，教授，博士，研究方向為天然產(chǎn)物活性與微生物制藥。E-mail：daiguifu@zzu.edu.cn