賈寒冰，申明月，謝俊華，劉玲玲，聶少平*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌　330047）

糖醋排骨中羧甲基賴氨酸分析方法的建立及其烹飪過程中動態(tài)變化

賈寒冰，申明月，謝俊華，劉玲玲，聶少平*

（南昌大學(xué) 食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西 南昌330047）

采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種操作簡單、穩(wěn)定性好的檢測中式菜肴糖醋排骨中羧甲基賴氨酸（Nε-（carboxymethyl）lysine，CML）的方法。樣品用正己烷去脂肪，硼氫化鈉還原，鹽酸水解蛋白，Oasis MCX固相萃取小柱凈化。以5 mmol/L的乙酸銨溶液和甲醇-水（80∶20，V/V）溶液作為流動相，采用

Phenomenex Synergi 4 μ Hydro-RP 80A色譜柱，在正離子模式下采用多重反應(yīng)監(jiān)測分析，同位 素內(nèi)標法定量。該方法檢出限為1.40 μg/g，加標回收率為90.94%～105.26%，相對標準偏差為5.80%～15.46%。采用該分析方法對中式菜肴糖醋排骨加工過程中CML的含量變化進行分析，結(jié)果表明，加工溫度和加熱時間以及糖和油脂的添加均可以顯著影響糖醋排骨中CML 的含量。

晚期糖基化末端產(chǎn)物；羧甲基賴氨酸；糖醋排骨；高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)；多重反應(yīng)監(jiān)測

晚期糖基化末端產(chǎn)物（advanced glycation end products，AGEs）是糖類和蛋白質(zhì)、氨基酸等大分子物質(zhì)的非酶糖基化產(chǎn)物，主要在美拉德反應(yīng)中期階段產(chǎn)生［1］。人體內(nèi)的AGEs部分來源于飲食，有研究表明飲食攝入人體的AGEs大約1/10進入血液循環(huán)，其中只有1/3通過腎臟排出體外，剩下的2/3通過共價鍵和組織結(jié)合留在體內(nèi)，從而誘發(fā)人體各種疾病的產(chǎn)生［2-4］，如糖尿病、腎?。蚨景Y）、動脈粥樣硬化、衰老、心血管疾病和阿茨海默爾等疾病［5-7］。目前在生物和醫(yī)藥領(lǐng)域已經(jīng)分離鑒定出多種AGEs，其中羧甲基賴氨酸（Nε-（carboxymethyl）lysine，CML）是AGEs的主要成員之一，由于CML在食品中廣泛存在且對人體潛在危害性大，因此將CML作為AGEs的研究代表具有重要意義［8］。

目前用于檢測CML的技術(shù)主要有酶聯(lián)免疫（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）法［9-10］、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）［10-11］、氣相色譜-質(zhì)譜（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法［12］、LC-MS［13］等。不同檢測方法都有自身的優(yōu)越性，同時也會存在不足的地方，或者會受到檢測限制［14］。如ELISA法對抗體特異性要求較高，對測定不同生物樣品差異性大；對于HPLC、GC-MS檢測方法而言，往往需要通過對CML進行柱前 衍生，步驟相對繁瑣，且會降低檢測靈敏度［15-18］。因此，檢測不同樣品選擇相適應(yīng)的檢測方法顯得尤為重要。HPLC-MS法檢測CML不需要進行柱前衍生化處理，預(yù)處理步驟簡單，而且保留時間穩(wěn)定，重復(fù)性好［14］。

中華美食色香味俱全，聞名中外，中式菜肴烹飪技術(shù)種類繁多，包括炒、炸、燉、煎等［19］。傳統(tǒng)中式菜肴菜色豐富，菜品都是通過主料、輔料的搭配再加以調(diào)味而成的，正所謂是“一菜一味，百菜百味”［20］。中式菜肴獨特的制作方法為CML的生成提供依據(jù)。目前我國沒有研究報道中式菜肴加工過程對CML生成的影響。淮揚菜在國內(nèi)享有盛譽，是招待國際政要的首選菜系［21］。糖醋排骨是經(jīng)典淮揚菜之一，其選用新鮮仔排為主料，肉質(zhì)鮮嫩，口味酸甜適中，色澤紅亮油潤，是江南一帶的大眾流行菜［22］。因此，本實驗選擇以CML為檢測目標，建立HPLC-MS/MS法研究探討糖醋排骨加工過程對CML含量變化的影響。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

排骨、米醋、鎮(zhèn)江香醋、白醋、料酒、白糖、老抽、蔥、姜市購；壓榨花生油山東魯花集團有限公司；超純水屈臣氏集團（香港）有限公司；CML標品、d4-CML內(nèi)標（純度均大于98%）加拿大TRC公司；甲醇、甲酸、乙酸銨（均為色譜級）上海Aladdin試劑有限公司。

1.2儀器與設(shè)備

1290/6460A LC-MS/MS儀美國Agilent公司；Synergi 4 μ Hydro-RP 80A色譜柱（2 mm×250 mm，4 μm）美國Phenomenex公司；3K15冷凍高速離心機美國Sigma公司；KQ-50B/KQ 3200E超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；BCD-179K超低溫冰箱青島海爾電冰箱股份有限公司；DHG-9023A電熱恒溫干燥箱上海一恒科技有限公司；XS-105電子分析天平瑞士梅特勒-托利多集團；MD 200氮吹儀上海摩億科貿(mào)有限公司；HGC-8固相萃取儀廣州智真生物科技有限公司；12L Freeze Dry System冷凍干燥機美國Labconco公司；OASIS系列MCX固相萃取柱（6 mL，150 mg）美國Waters公司；JYL-D051料理機九陽股份有限公司；C21-SK011電磁灶杭州九陽生活電器有限公司。1.3方法

1.3.1糖醋排骨加工過程及取樣

按照經(jīng)典淮揚菜糖醋排骨的制作方法［22］，將400 g排骨剁成長約3 cm的段，加100 g蔥、100 g姜、40 g料酒腌制30 min；在沸水中煮3 min，焯去蔥姜等雜質(zhì)，撈出瀝干；投入到熱油（120 ℃）中油炸6 min，此時肋排表面呈金黃色，大約八成熟，兩端露出尖尖的骨頭；炒糖色，加入15 g油，30 g糖，150℃ 2 min，快速升溫至180 ℃ 1 min，炒至糖色狀態(tài)，倒入50 mL水，120 ℃ 1 min熬成紅亮的糖色，此時放入炸好的排骨，加入老抽20 g，米醋40 g，倒入清水沒過排骨，150 ℃燒至沸騰，然后90 ℃加蓋燜40 min，開蓋后加入鎮(zhèn)江香醋20 g，180 ℃大火收干湯汁，淋入白醋10 g，出鍋即成。

分別取未處理、腌制后、沸水煮后、炸至金黃色、炒糖色、大火燒沸、出鍋后的排骨適量，粉碎機絞碎，冷凍干燥，再次粉碎后低溫保存。

1.3.2樣品前處理

參考Assar等［23］的研究進行樣品前處理。稱取60 mg樣品，加入2 mL正己烷，搖勻后以4 000 r/min離心3 min，棄上清液，重復(fù)3 次以徹底除去脂肪。加入1.5 mL硼酸鈉緩沖液（0.2 mol /L、pH 9.4）和1 mL硼氫化鈉溶液（1 mol/L含0.01 mol/L氫氧化鈉），混勻后在4 ℃冰箱中還原6 h。根據(jù)Folch等［24］的方法，加入4 mL三氯甲烷-甲醇（2∶1，V/V）溶液除去樣品中的油脂，同時使蛋白質(zhì)沉淀。5 000 r/min離心10 min后，在沉淀物中加入4 mL鹽酸溶液（6 mol/L），于烘箱中110 ℃酸水解24 h。用氮氣將酸解液吹干，于2 mL甲醇-水（80∶20，V/V）溶液中復(fù)溶，加入20 μL內(nèi)標（50 ng/mL）。分別用3 mL甲醇和3 mL水洗凈和活化MCX小柱，取上述樣品溶液過柱，依次用3 mL水和3 mL甲醇洗凈雜質(zhì)后，用5 mL體積分數(shù)5%氨水的甲醇溶液洗脫，收集的洗脫液經(jīng)氮吹濃縮后，復(fù)溶于1 mL甲醇-水（80∶20，V/V）溶液中，過0.22 μm水系濾膜后，用于HPLC-MS分析。

1.3.3HPLC-MS檢測條件

Phenomenex Synergi 4 μ Hydro-RP 80A色譜柱（250 mm×2 mm，4 μm）；流動相：A為5 mmol/L的乙酸銨溶液，甲酸調(diào)節(jié)pH 4.0；B為甲醇；進樣量10 μL；流動相速率0.2 mL/min；柱溫35 ℃。

MS條件：電離方式：電噴霧離子源正模式；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測駐留時間500 ms；毛細管電壓3.00 kV；離子源溫度100 ℃；脫溶劑氣溫度300 ℃；錐孔氣流量50 L/h；進樣錐電壓20 V；脫溶劑氣和錐孔氣為氮氣，碰撞氣體為氬氣。

2　結(jié)果與分析

2.1流動相的選擇

選擇CML標準溶液（1 μg/mL）進樣，通過實驗首先比較了乙腈-水溶液和甲醇-水溶液對CML的洗脫效果，結(jié)果表明乙腈作為流動相時出現(xiàn)倒峰，而甲醇作為流動相時不會出現(xiàn)倒峰，但是峰形不佳；接著在水相中加入5 mmol/L乙酸銨溶液，用甲酸調(diào)pH值分別為4.0、5.0、6.0，結(jié)果表明，當pH 4.0時，峰形顯著改善，如圖1所示。同時實驗還優(yōu)化了不同的流動相比例對CML保留時間和峰形的影響，分別選取了體積分數(shù)50%、70%、80%甲醇溶液作為流動相。結(jié)果在確保色譜柱對CML的保留效果的同時，體積分數(shù)80%甲醇溶液得到的CML峰形最優(yōu)，對稱性最好，如圖2所示。

圖1　 不同pH值對CML峰形的影響Fig.1　Effects of pH on CML peak shape

圖2　 不同流動相比例對CML峰形的影響Fig.2　Effect of mobile phase composition on CML peak shape

2.2質(zhì)譜條件的優(yōu)化

表1　各物質(zhì)的質(zhì)譜參數(shù)設(shè)置Taabbllee 11 　MMaasss parameters in multiple-reaction monitoring （MRM）mode for CML and d4--CCMMLL

在全掃描模式下，確定母離子及其分子質(zhì)量，見表1；選擇離子監(jiān)測模式下，在100～200 V每隔10 V分別對CML進行監(jiān)測，從而確定各個單標的最佳錐孔電壓；在子離子掃描模式下，確定最佳碰撞能、定性子離子和定量子離子；最后，在多重反應(yīng)監(jiān)測模式下，應(yīng)用并檢驗以上確定的MS條件，見圖3。

圖3　CML的二級質(zhì)譜圖Fig.3　MS-MS fragments of CML

2.3樣品前處理時硼氫化鈉還原時間的選擇

有文獻［12，13，18］報道，部分阿瑪多利重排產(chǎn)物，例如果糖基賴氨酸在酸水解時會轉(zhuǎn)化成CML，為了提高檢測的準確性，通常采用硼氫化鈉將果糖基賴氨酸等物質(zhì)進行還原。因此實驗按照1.3.2節(jié)方法分別取糖醋排骨成品6 份進行樣品前處理，還原時間分別為0、2、4、6、8、10 h。實驗結(jié)果表明，還原時間在6 h左右時，CML的含量基本穩(wěn)定如圖4所示，與He Jialiang等［13］研究報道結(jié)果一致。因此實驗最終選擇1 mol/L硼氫化鈉還原6 h。

2.4凈化樣品時固相萃取柱的選擇

圖 5　不同類型固相萃取柱對CML含量的影響Fig.5　Effect of solid phase extraction columns on CML content

根據(jù)CML的結(jié)構(gòu)，選取Sep-Pak C18、Oasis HLB、Oasis MCX 3 種固相萃取小柱對糖醋排骨成品進行凈化處理，然后測定CML含量。如圖5所示，MCX柱凈化富集效果明顯比C18柱和HLB柱好。根據(jù)相關(guān)文獻［25-26］報道，因此推斷，由于CML屬于兩性電離物質(zhì)，較強極性，C18固相萃取柱對CML吸附能力弱，容易與雜質(zhì)一起被洗脫；HLB固相萃取柱對極性和非極性物質(zhì)有一個平衡的吸附效果，對酸性、中性和堿性物質(zhì)都可以簡單地吸附在材料表面，因此物質(zhì)不同的極性和pH值對吸附效率影響較大；MCX混合型固相萃取柱可以同時通過反相機制保留干擾物和離子交換選擇性保留CML，最后通過離子置換將CML洗脫。

2.5線性關(guān)系與檢出限

甲醇-水（80∶20，V/V）溶液梯度稀釋標準液，以不同質(zhì)量濃度CML標品峰面積與一定質(zhì)量濃度內(nèi)標d4-CML峰面積比值為橫坐標，CML質(zhì)量濃度為縱坐標，制作標準曲線，以3 倍信噪比為檢出限。由表2可知，在線性范圍內(nèi)，峰面積與質(zhì)量濃度有良好的線性關(guān)系（R2＞0.999），檢出限為1.40 μg/g，與已報道［27］的方法相比，本方法具有較高的靈敏度。

表2　CML的線性范圍、線性方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限TTaabbllee 22 　LLiinneeaarr eeqquuaattiioons， correlation coefficients， limits of detectio（LODs） and limits of quantifi cation （LOQs） for CML

2.6精密度與回收率結(jié)果

取制作完成的糖醋排骨為原料，添加3 個不同質(zhì)量濃度的混合標準溶液進行回收率和精密度實驗。未加標準品的糖醋排骨和加標糖醋排骨肉樣按照優(yōu)化后的方法進行測定，每個水平重復(fù)測定6 次。結(jié)果顯示，原料的加標回收率在90.94%～105.26%之間，相對標準偏差（relative standard deviation，RSD）在5.80%～15.46%之間。以上結(jié)果表明，該方法準確可靠，可用于實際樣品的測定，見表3。n

表 3 添加回收率及RSD結(jié)果（n==66）Taabbllee 33 　RReessuullttss ooff rreeccoovveerryy aanndd rreellaattiivvee ssttaannddaarrdd ddeevviiaattiioonn （n==66）

2.7糖醋排骨各加工階段樣品CML的含量

表 4　糖醋排骨各加工階段CML檢測結(jié)果TTaabbllee 4　CML contents of sweet and sour pork ribs during different processing stages μg/g

取適量上述糖醋排骨各加工階段樣品進行CML檢測（n=3），如表4所示。實驗結(jié)果表明，隨著加熱強度、時間和原料的不同直接影響CML含量的變化，沸水煮后較腌制后增加21.3 μg/g，油炸后較沸水煮后增加29.64 μg/g；在加入白糖后，大火燒沸較炒糖色急劇增加40.59 μg/g。結(jié)合相關(guān)文獻［28］，推斷由于肉在熱加工前，由機體本身和貯藏過程中生成的主要是游離態(tài)CML，而肉在漂洗和腌制過程時，部分游離態(tài)CML溶解在水和料酒中，導(dǎo)致CML含量在腌制后含量有所降低。CML產(chǎn)生途徑包括美拉德反應(yīng)、葡萄糖的自氧化降解和脂質(zhì)的自氧化降解等［14］，因此糖醋排骨在加入油和糖后CML含量顯著增加。房紅娟［29］研究結(jié)果也表明，加工溫度和加熱時間以及糖和油脂的添加均可以顯著影響糖醋排骨中CML的含量。如低乳糖牛奶CML含量為5.47 μg/mL比牛奶CML含量（4.26 μg/mL）高，而脫脂牛奶CML含量為3.64 μg/mL低于牛奶CML含量，由于低乳糖牛奶中還原糖增加促進了CML的產(chǎn)生而脫脂牛奶減少了由脂質(zhì)過氧化物生成CML。在發(fā)酵食品中，由于蛋白質(zhì)水解為游離氨基酸、多糖水解為寡糖和單糖，CML含量相對更高，如腐乳中達124.92 μg/g；富含賴氨酸的豆奶五谷粉生產(chǎn)中加入大量糖且為粉末狀態(tài)，因此在噴霧干燥或長期貯存過程產(chǎn)生的CML達到67.49 μg/g［28］。一些經(jīng)過中溫條件加工且蛋白含量低的面食制品如掛面、水餃皮等CML含量相對更少，分別為4.13、8.34 μg/g；而經(jīng)過油炸的食品如方便面、油條的CML含量分別高達38.77、32.69 μg/g［28］；另外經(jīng)過高溫烘烤的食品如小麥面包皮、硬質(zhì)餅干中CML含量分別為94.29、117.53 μg/g［13］。

3　結(jié) 論

本研究采用高效液相色譜-三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)建立了一種操作簡單、穩(wěn)定性好、回收率高的檢測中式菜肴糖醋排骨中CML的方法。該方法中樣品經(jīng)正己烷去脂肪，硼氫化鈉還原，酸水解蛋白，Oasis MCX固相萃取小柱凈化。該方法檢出限為1.40 μg/g，加標回收率為90.94%～105.26%，RSD為5.80%～15.46%。采用該分析方法對中式菜肴糖醋排骨加工過程中CML的含量變化進行了分析，結(jié)果表明，加工溫度和加熱時間以及糖和油脂的添加均可以顯著影響糖醋排骨中CML的含量。因此，如何改善糖醋排骨的加工工藝也是控制CML生成的一個重要途徑。

［1］VLASSARA H， BROWNLEE M， CERAMI A. Accumulation of diabetic rat peripheral nerve myelin by macrophages increases with the presence of advanced glycosylation endproducts［J］. The Journal of Experimental Medicine， 1984， 160（1）: 197-207.

［2］GOLDBERG T， CAI Weijing， PEPPA M， et al. Advanced glycoxidation end products in commonly consumed foods［J］. Journal of the American Dietetic Association， 2004， 104（8）: 1287-1291.

［3］URIBARRI J， WOODRUFF S， GOODMAN S， et al. Advanced glycation end products in foods and a practical guide to their reduction in the diet［J］. Journal of the American Dietetic Association， 2010，110（6）: 911-916.

［4］YAMAGISHI S， MATSUI T， NAKAMURA K. Possible link of foodderived advanced glycation end products （AGEs） to the development of diabetes［J］. Medical Hypotheses， 2008， 71（6）: 876-878.

［5］馮建勛， 李紅艷， 田建偉. 飲食中晚期糖基化終產(chǎn)物對健康SD大鼠腎臟的影響［J］. 中國臨床康復(fù)， 2006， 36 （10）: 116-119.

［6］LOSSO J N， BAWADI H A， CHINTALAPATI M. Inhibition of the formation of advanced glycation end products by thymoquinone［J］. Food Chemistry， 2011， 128（1）: 55-61.

［7］KRAUTWALD M， MüNCH G. Advanced glycation end products as biomarkers and gerontotoxins-A basis to explore methylglyoxallowing agents for Alzheimer's disease［J］. Experimental Gerontology，2010， 45（10）: 744-751.

［8］FU M X， REQUENA J R， JENKINS A J， et al. The advanced glycation end product， N-（epsilon）（carboxymethyl）lysine， is a product of both lipid peroxidation and glycoxidation reactions［J］. Journal of Biological Chemistry， 1996， 271（17）: 9982-9986.

［9］BEAULIEU L P， HARRIS C S， SALEEM A， et al. Inhibitory effect of the Cree traditional medicine wiishichimanaanh （Vaccinium vitisidaea） on advanced glycation endproduct formation: identifi cation of active principles［J］. Phytotherapy Research， 2010， 24（5）: 741-747.

［10］ DITTRICH R， HOFFMANN I， STAHL P， et al. Concentrations of N-epsilon-carboxymethyllysine in human breast milk， infant formulas，and urine of infants［J］. Journal of Agricultural and Food Chemistry，2006， 54（18）: 6924-6928.

［11］ VANDEMERBEL N. Liquid chromatographic method for the quantitative determination of Nε-carboxymethyllysine in human plasma proteins［J］. Journal of Chromatography B， 2004， 808（2）: 163-168. ［12］ CHARISSOU A， AIT-AMEUR L， BIRLOUEZ-ARAGON I. Evaluation of a gas chromatography/mass spectrometry method for the quantifi cation of carboxymethyllysine in food samples［J］. Journal of Chromatography A， 2007， 1140（1/2）: 189-194.

［13］ HE Jialiang， ZENG Maom ao， ZHENG Zongpin， et al. Simultaneous determination of Nε-（carboxymethyl） lysine and Nε-（carboxyethyl）lysine in cereal foods by LC-MS/MS［J］. European Food Research and Technology， 2014， 238（3）: 367-374.

［14］ 付全意. 食品模擬體系糖化反應(yīng)過程中羧甲基賴氨酸的形成和抑制［D］. 廣州: 華南理工大學(xué)， 2012: 62-124.

［15］ DELGADO-ANDRADE C， SEIQUER I， NAVARRO M P， et al. Maillard reaction indicators in diets usually consumed by adolescent population［J］. Molecular Nutrition and Food Research， 2007， 51（3）: 341-351.

［16］ HARTKOPF J， PAHLKE C， LüDEMANN G， et al. Determination of Nε-carboxymethyllysine by a reversed-phase high-performance liquid chromatography method［J］. Journal of Chromatography A， 1994，672（1）: 242-246.

［17］ DRUSCH S， FAIST V， ERBERSDOBLER H F. Determination of Nεcarboxymethyllysine in milk products by a modifi ed reversed-phase HPLC method［J］. Food Chemistry， 1999， 65（4）: 547-553.

［18］ BüSER W， ERBERSDOBLER H F， LIARDON R. Identification and determination of Nε-carboxymethyllysine by gas-liquid chromatography［J］. Journal of Chromatography A， 1987， 387: 515-519.

［19］ 陳永清. 風(fēng)味與菜點質(zhì)構(gòu)［J］. 四川烹飪高等專科學(xué)校學(xué)報， 2007（1）: 12-14.

［20］ 趙鉅陽， 孔保華， 劉騫， 等. 中式傳統(tǒng)菜肴方便食品研究進展［J］. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報， 2015（4）: 1342-1349.

［21］ 關(guān)向峰. 譯介淮揚菜系， 促進淮揚飲食文化走向世界［J］. 滄桑，2013（4）: 226-228.

［22］ 杜憲， 江天舒. 經(jīng)典淮揚菜100 款［M］. 濟南: 山東出版?zhèn)髅焦煞萦邢薰荆?2014: 18.

［23］ ASSAR S H， MOLONEY C， LIMA M， et al. Determination of Nε-（carboxymethyl）lysine in food systems by ultra performance liquid chromatography-mass spectrometry［J］. Amino Acids， 2009， 36（2）: 317-326.

［24］ FOLCH J， LEES M， SLOANE S G H. A simple method for the isolation and purifi cation of total lipides from animal tissues［J］. The Journal of Biological Chemistry， 1957， 226（1）: 497-509.

［25］ BENAVENTE F， MEDINA-CASANELLAS S， BARBOSA J， et al. Investigation of commercial sorbents for the analysis of opioid peptides in human plasma by on-line SPE-CE［J］. Journal of Separation Science， 2010， 33（9）: 1294-1304.

［26］ NA Guangshui， GU Jia， GE Linke， et al. Detection of 36 antibiotics in coastal waters using high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry［J］. Chinese Journal of Oceanology and Limnology，2011（5）: 1093-1102.

［27］ 高暢， 何志勇， 曾茂茂， 等. SPE-LC-MS/MS法檢測肉制品中羧甲基賴氨酸與羧乙基賴氨酸［J］. 2014， 7（19）: 1986-1991.

［28］ 卞華偉， 李玉婷， 李冰， 等. 國內(nèi)常見食品中羧甲基賴氨酸含量分析［J］.現(xiàn)代食品科技， 2014， 30（11）: 223-228.

［29］ 房紅娟. 食品加工過程中晚期糖基化末端產(chǎn)物形成及控制研究［D］.西安: 西北農(nóng)林科技大學(xué)， 2013: 1-39.

Establishment of Analytical Method for Nε-（carboxymethyl）lysine in Sweet and Sour Pork Ribs and Its Dynamic Change during the Cooking Process

In this study， high performance liquid chromatography-triple quadrupole mass spectrometry （HPLC-MS/ MS） was used to establish a simple and stable method for the detection of advanced glycation end products （AGEs） of Nε-（carboxymethyl）lysine （CML） in sweet and sour pork ribs. Samples were reduced by sodium borohydride after removing lipid. HCl was then added to hydrolyze the protein in the samples. After hydrolysis， the target compounds were cleaned up by Oasis MCX SPE cartridges and then separated by Phenomenex Synergi 4 μ Hydro-RP 80A column with ammonium acetate aqueous solution and methanol solution as mobile phases. HPLC-MS analysis was conducted using electron spray ionization （ESI） in the positive ion mode （ESI+） and quantifi cation was performed in multiple-reaction monitoring （MRM）mode by stable isotope dilution method. The limit of detection was 1.40 μg/g and the average recoveries of CML ranged from 90.94% to 105.26% with relative standard deviation （RSD） in the range of 5.80%-15.46%. The contents of CML in Huaiyang style sweet and sour spareribs were analyzed. The results showed that heating time， heating temperature and the addition of sugar and oil caused a signifi cant increase in CML content.

advanced glycation end products； Nε-（carboxymethyl）lysine； sweet and sour pork ribs； high performance liquid chromatography triple quadrupole mass spectrometry； multiple reaction monitoring

TS201.6

A

1002-6630（2015）24-0142-05

10.7506/spkx1002-6630-201524025

2015-06-23

“十二五”國家科技支撐計劃項目（2014BAD04B03）；國家重點基礎(chǔ)研究發(fā)展計劃（973計劃）項目（2012CB720805）；教育部“新世紀優(yōu)秀人才支持計劃”項目（NCET-12-0749）

賈寒冰（1991—），女，碩士研究生，研究方向為食品質(zhì)量安全。E-mail：hbjia6@163.com

聶少平（1978—），男，教授，博士，研究方向為食品化學(xué)與分析、食品營養(yǎng)與安全、食品復(fù)雜碳水化合物。E-mail：spnie@ncu.edu.cn