蘇 偉，楊旭卉，王 瑜，母應春，邱樹毅（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽　550025）

響應面試驗優(yōu)化基于膠原特性酶解豬皮工藝及其抗氧化特性

蘇 偉，楊旭卉，王 瑜，母應春，邱樹毅
（貴州大學釀酒與食品工程學院，貴州 貴陽550025）

以新鮮豬皮為原料，基于凝膠特性以羥脯氨酸含量為指標，對影響胃蛋白酶酶解過程的各個因素進行研究，通過Box-Behnken設計優(yōu)化酶解工藝；以清除O2－·、·OH、H2O2能力和DNA損傷保護作用為指標研究酶解產(chǎn)物的抗氧化功能。結果表明：最佳酶解條件為加酶量0.25%、料液比1∶2（g/mL）、酶解時間1.65 h、酶解溫度41.15 ℃，在此酶解條件下其產(chǎn)物清除O2－·的IC50值為20.19 mg/mL；清除·OH的IC50值為6.36 mg/mL；清除H2O2的IC50值為0.65 mg/mL；對DNA損傷保護作用的IC50值為1.86 mg/mL。

豬皮；膠原蛋白；胃蛋白酶；抗氧化性；DNA損傷

豬皮由表皮層、真皮層、皮下結締組織構成，其主要成分是水分、蛋白質(zhì)、脂肪及礦物質(zhì)，其中約含有水分65%、蛋白質(zhì)33%、脂肪1%、礦物質(zhì)0.5%。豬皮中的膠原蛋白含量約為87.7%［1］。豬皮膠原蛋白相對分子質(zhì)量為30萬左右，含有18 種氨基酸，其中甘氨 酸占1/3，丙氨酸占1/9，脯氨酸和羥脯氨酸占2/9，必需氨基酸共占1/8［2］。膠原蛋白是一種天然高分子可溶性蛋白，膠原蛋白不僅可用于改善食品的彈性、黏稠度和穩(wěn)定性等，而且可作為抗氧化劑和血管收縮素轉(zhuǎn)換酵素抑制劑應用于食品、醫(yī)藥、化妝品等工業(yè)中［3-4］。國內(nèi)外有不少研究豬皮膠原的文獻報道，但大多側重于膠原的結構和生化性質(zhì)的研究［5-6］，在提取工藝方面多集中在已水解的膠原蛋白或大分子明膠的工藝上［7］。Senaratne等［8］從棕色脊椎蟾魚魚皮的生產(chǎn)廢料中分離提取出大量的膠原蛋白；Alemán等［9］選用多種酶酶解的方法從烏賊的內(nèi)外表皮中提取出具有生物活性（抗高血壓、抗癌、抗氧化活性）的酶解產(chǎn)物；Zhang Junhui等［10］以脫脂大米胚乳為原料，采用色譜分析和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用的方法分離得到具有較強抗氧化活性的蛋白肽；羥脯氨酸的含量是衡量膠原蛋白品質(zhì)的重要指標，且L-羥脯氨酸（Pro-OH）是膠原蛋白的特征組分 之一，含量約為9%。在體內(nèi)羥基脯氨酸由脯氨酸酰羥化酶羥基化而成，其游離的4-羥基能清除O2－· 和·OH，左瑞雅等［11］研究得出羥脯氨酸具有一定的抗氧化能力。目前對于豬皮膠酶解產(chǎn)物及其抗氧化活性研究比較薄弱，本實驗以新鮮豬皮為原料，基于凝膠特性以羥脯氨酸含量為指標，對影響胃蛋白酶酶解過程的各個因素進行研究，通過Box-Behnken設計優(yōu)化酶解工藝；且以清除O2－·、·OH、H2O2和DNA損傷的保護作用為指標探究酶解產(chǎn)物的抗氧化特性， 旨在為豬皮膠原特性及功能特性在食品加工綜合利用提供一定的理論依據(jù)。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

豬皮、米醋市購；胃蛋白北京索萊寶生物科技有限公司；色譜純小牛胸腺DNA、魯米諾美國Sigma公司；色譜純鄰苯三酚、鄰菲啰啉、抗壞血酸、氯胺T試劑、對二甲氨基苯甲醛試劑、羥脯氨酸標液國藥集團化學試劑有限公司。

1.2儀器與設備

電子分析天平賽多利斯科學儀器（北京）有限公司；FW135型粉碎機天津市泰斯特儀器有限公司；TDL8M臺式低速冷凍離心機長沙湘儀貝克儀器儀表有限公司；BPCL-2-JZ-TGC微弱發(fā)光儀北京建新力拓科技有限公司。

1.3方法

1.3.1原料預處理

市購新鮮豬皮，刮去表面脂肪，置于沸水中預煮3～5 min后取出，冷卻后將其切成長寬為1 cm左右的小方塊，用高速粉碎機打碎成顆粒狀，冷凍備用［12］。預實驗采用30%的米醋可以滿足胃蛋白酶的酶解pH值，且口感適合，因此本實驗采用米醋與水體積比3∶7作為酶解的液體［13-14］。

1.3.2酶法制備豬皮膠工藝流程

實驗所用凍干粉是樣品通過恒溫酶解后，90～100 ℃滅酶5 min，離心直接取其澄清透明的上清液冷卻至20 ℃左右即得豬皮膠凍，再經(jīng)過真空冷凍干燥得到凍干粉。

1.3.3羥脯氨酸標準曲線的繪制

按照GB/T 9695.23—2008《肉與肉制品：羥脯氨酸含量測定》繪制羥脯氨酸標準曲線。

1.3.4酶解工藝優(yōu)化試驗設計

研究胃蛋白酶在30%的米醋溶液中豬皮的酶解條件，以羥脯氨酸含量為指標，以不同的酶解時間、酶解溫度、加酶量、料液比為因素條件，在單因素試驗基礎上，通過Box-Behnken設計優(yōu)化酶解工藝。

1.3.4.1單因素試驗

考察胃蛋白酶酶解膠原蛋白的酶解時間、酶解溫度、加酶量、料液比4 個因素對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響。按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，加酶量0.3%、酶解溫度40 ℃的條件下，研究酶解時間（1、2、3、4、5 h）對羥脯氨酸含量的影響；按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，加酶量0.3%、酶解時間3 h的條件下，研究酶解溫度（30、35、40、45、50 ℃）對羥脯氨酸含量的影響；按照料液比1∶3加入30%的米醋溶液，酶解溫度40 ℃、酶解時間3 h的條件下，研究加酶量（0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%）對羥脯氨酸含量的影響；按照加酶量0.3%、酶解溫度40 ℃、酶解時間3 h的條件下，研究料液比（1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5）對羥脯氨酸含量的影響。

1.3.4.2響應面試驗

在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken試驗設計原理，以羥脯氨酸含量為響應值，以酶解時間、酶解溫度、加酶量、料液比4 個因素為自變量，設計四因素三水平共29 組的響應面分析試驗，優(yōu)化酶法制備豬皮膠的工藝條件，試驗因素與水平如表1所示。1.3.5豬皮膠原蛋白酶解液的抗氧化功能特性

表1　酶解制備豬皮膠工藝優(yōu)化設計因素水平TTaabbllee 11 　FFaaccttoorrss aanndd tthheeiirr ccooddeedd lleevveellss uusseedd iinn BBooxx--BBeehhnnkkeenn ddeessiiggnn ffoorr ooppttiimmiizzaattiioonn ooff eennzzyymmaattiicc hhyyddrroollyyssiiss ooff ppoorrcciinnee sskkiinn

按照響應面試驗得出的胃蛋白酶酶解最佳工藝條件制備出豬皮膠凍干粉，以O－2·清除作用、·OH清除作用、H2O2清除作用、DNA損傷的保護作用為指標測其抗氧化活性。

1.3.5.1·清除作用的測定

采用鄰苯三酚-Luminol化學發(fā)光體系測定法［15］，具體為：用0.05 mol/L的NaOH溶液配制0.05 mol/L魯米諾溶液，避光保存，用前再用雙蒸水稀釋成1 mmol/L。鄰苯三酚用1 mmol/L鹽酸配成0.01 mol/L的溶液，于4 ℃冰箱中保存，用前用雙蒸水稀釋成6.25×10－4mol/L溶液。0.05 mol/L pH 10.2的Na2CO3-NaHCO3緩沖液（含乙二胺四乙酸0.1 mmol/L）用前現(xiàn)配，并與1 mmol/L魯米諾溶液以體積比2∶1進行混合，得到魯米諾-碳酸鹽緩沖液混合物。測量時，依次向發(fā)光池中注入10 μL樣品溶液、50 μL 6.25×10－4mol/L鄰苯三酚和 0.94 mL魯米諾-碳酸緩沖液后，立即啟動反應，反應溫度為30 ℃，每間隔3 s記錄，測定100 s的總發(fā)光強度。（對照取相同情況下不加入樣品溶液，本底為未加鄰苯三酚的發(fā)光強度）。

1.3.5.2·OH清除作用的測定

采用鄰菲羅啉-Cu2+-VC-H2O2體系［16］。向測量管中依次加入50 μL待測樣品、1 mmol/L CuSO4溶液50 μL、1 mmol/L鄰菲羅啉50 μL和0.05 mol/L硼砂溶液700 μL充分混勻，然后再加入100 μL 1 mmol/L抗壞血酸溶液和50 μL 0.15% H2O2溶液，立即啟動系統(tǒng)，間隔3 s記數(shù)，記錄360 s內(nèi)化學發(fā)光動力學曲線。

1.3.5.3對H2O2清除作用的測定

采用雙氧水-魯米諾化學發(fā)光體系［17］。向發(fā)光池中加入樣品溶液（空白對照為樣品緩沖液）50 μL、0.15 mol/L H2O250 μL和0.1 mmol/L魯米諾-0.05 mol/L碳酸鹽緩沖液（pH 9.4）的混合液（體積比為1∶17） 900 μL，啟動發(fā)光系統(tǒng)，每間隔3 s記數(shù)，記錄120 s內(nèi)發(fā)光強度，本底為不加雙氧水時的發(fā)光值。

1.3.5.4對DNA損傷保護作用的測定

采用CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA 化學發(fā)光體系［18］。試劑配制方法：用去離子水配制0.1 mol/L醋酸-醋酸鈉緩沖液；再用緩沖液配制DNA-Cu2+-Phen體系，配制后DNA質(zhì)量濃度為3 μg/mL，CuSO4·5H2O濃度為7.5×10－5mol/L，Phen濃度為5.25×10－4mol/L。測定方法：向發(fā)光池中加入樣品溶液（空白對照為樣品緩沖液）100 μL、DNA-Cu2+-Phen體系溶液800 μL、4.2× 10－3mol/L VC 100 μL和3%的H2O2200 μL，啟動發(fā)光裝置，間隔3 s記數(shù)，記錄480 s內(nèi)發(fā)光強度，本底為不加雙氧水時的發(fā)光值。

1.3.5.5清除率計算

所有實驗均重復3 次，取平均值，按照下式計算清除率：

式中：CL空白為空白對照組的相對發(fā)光強度；CL本底為本底組相對發(fā)光強度；CL樣品為樣品組相對發(fā)光強度。

以清除率為橫坐標，樣品質(zhì)量濃度為縱坐標，繪出曲線并計算出清除率為50%時的質(zhì)量濃度IC50，用來衡量樣品對自由基的清除能力。IC50值越小，表明樣品清除自由基能力越強。

2　結果與分析

2.1羥脯氨酸標準曲線繪制

以羥脯氨酸質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標繪制標準曲線，得出回歸方程為y=0.307 2x+0.012 2，相關系數(shù)R2=0.997 4。

2.2單因素試驗結果

2.2.1酶解時間對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響

圖 1　酶解時間對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響Fig.1　Effects of hydrolysis time on the content of hydroxyproline in pig skin collagen

從圖1可以看出，隨著酶解時間的延長，羥脯氨酸含量增加，在2 h達到最大值4.812%。隨著時間延長水解底物質(zhì)量濃度逐漸減小，酶的特異性催化位點減少，即水解過程中酶逐漸失活［19］。由于在反應初期，酶活力及底物濃度比較高，有利于酶解反應進行，但隨著時間的延長，豬皮膠中的膠原蛋白繼續(xù)酶解為其他肽類物質(zhì)，膠原蛋白隨著酶解時間的延長將逐漸減少，羥脯氨酸含量也隨之減少，因此酶解的最佳時間為2 h。

2.2.2酶解溫度對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響

圖 2　酶解溫度對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響Fig.2　Effect of hydrolysis temperature on the content of hydroxyproline in pig skin collagen

如圖2所示，在30～40 ℃之間，隨著酶解溫度的升高，羥脯氨酸含量呈上升的趨勢，當酶解溫度高于40 ℃時，羥脯氨酸含量呈現(xiàn)出下降的趨勢，在溫度為40 ℃時達到了最高5.389%。由于酶解反應，胃蛋白酶本身也是蛋白質(zhì)，其對溫度的影響比較敏感，當酶解溫度為胃蛋白酶的最佳酶解溫度時，其活力最強，對原料的酶解作用也最強；當酶解溫度高于40 ℃時，高溫使酶變性，酶活力會下降，因此最適溫度為40 ℃。

2.2.3加酶量對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響

如圖3所示，加酶量在0.1%～0.3%范圍，呈現(xiàn)上升趨勢，加酶量在0.3%時羥脯氨酸含量為4.849%。由于底物蛋白與酶的結合位點還沒被完全占據(jù)，形成的中間復合物的量也比較少，隨著加酶量的增加，羥脯氨酸含量呈現(xiàn)出上升趨勢，但隨著酶的不斷加入，底物的蛋白結合位點被 逐漸占據(jù)，此時便會導致酶解反應緩慢，出現(xiàn)下降的趨勢可能是因為酶解產(chǎn)生的膠原蛋白繼續(xù)酶解后導致羥脯氨酸含量下降，因此最適加酶量為0.3%。

圖 3　加酶量對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響Fig.3　Effect of enzyme concentration on the content of hydroxyproline in pig skin collagen

2.2.4料液比對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響

圖 4　料液比對豬皮膠中羥脯氨酸含量的影響Fig.4　Effects of ratio of material to liquid on the content ofhydroxyproline in pig skin collagen

從圖4可以看出，隨著溶劑用量的增大，羥脯氨酸含量呈現(xiàn)出先增大后減小的趨勢，在料液比為1∶3時羥脯氨酸含量為5.378%。酶法制備豬皮膠是在30%的醋酸水溶液中進行的，反應過程是酶促反應，水在反應中有利于分子的擴散和運動。當溶劑用量較小時，溶液中的分子擴散很慢，且分布不均；在溶劑用量較高時，酶被稀釋，酶分子與原料蛋白的結合也會受到影響，因此最適料液比為1∶3。

2.2.5胃蛋白酶酶解豬皮膠原蛋白工藝響應面優(yōu)化

采用Box-Behnken試驗設計原理，以羥脯氨酸含量為響應值，以加酶量（X1）、料液比（X2）、酶解時間（X3）、酶解溫度（X4）4 個因素為自變量，設計四因素三水平的響應面試驗。

由表2可以看出，一次項X1影響不顯著（P＞0.05），X2影響極顯著（P＜0.01），X3和X4影響不顯著（P＞0.05），交互作用項X1X3、X1X4、X2X3、X2X4和X3X4交互作用不顯著（P＞0.05），X1X2影響顯著（P＜0.05）；二次項X12、X3

2影響極顯著（P＜0.01），X42影響顯著（P＜0.05），X22影響不顯著（P＞0.05）。

表2　回歸方程各項回歸系數(shù)顯著性檢驗Ta ble 2 Signififi cance test of regression coeffifi cients in regression equation

表3　回歸方程各項的方差分析TTable 3 Analysis of variance of regression equation

表3　回歸方程各項的方差分析Table 3 Analysis of variance of regression equation

注：**.差異極顯著，P＜0.01；*.差異顯著，P＜0.05。

由表3可知，回歸模型是顯著的（P=0.001 1＜0.05），模型R2=0.853 2，說明該模型擬合程度良好，能夠反映數(shù)據(jù)85.32%的有效性，失擬項F值為1.715 713（P= 0.317 8＞0.05），表明失擬項不顯著，試驗誤差較小，用該模型進行酶解工藝參數(shù)優(yōu)化的預測是可行的。通過用軟件Design-Expert 8.0.6對表3中數(shù)據(jù)進行二次多元回歸擬合，得以下回歸方程：

編碼回歸方程：

Y=4.39+0.091X1－0.30X2－0.11X3－0.031X4－0.27X1X2－8.346×10－3X1X3－0.024X1X4+0.072X2X3－0.12X2X4－0.082X3X4－0.35X12+0.025X2

2－0.29X3

2－0.23X4

2

實際值回歸方程：

Y=－17.200 86+25.185 55X1+0.919 08X2+ 1.513 48X3+0.838 41X4－2.743 37X1X2－0.083 463X1X3－0.047 418X1X4+0.072 385X2X3－0.024 038X2X4－0.016 332X3X4－34.962 87X12+0.025 321X2

2－0.291 92X3

2－9.129 54×10－3X4

2

響應面分析充分反映兩個因素交互作用對響應值的影響，等高線圖能直觀反映各因素交互 作用的強弱，圓形表示交互作用不顯著，橢圓形表示交互作用顯著，響應面三維圖則反應各酶解條件的交互作用［20］。用軟件Design-Expert 8.0.6分析并繪制得出加酶量、料液比、酶解時間及酶解溫度對響應值羥脯氨酸含量的交互影響的曲面圖，各因素固定值為0水平值，結果如圖5所示。

圖 5　各因素對羥脯氨酸含量交互影響的響應面圖Fig.5　Response surface graphs showing the interactive effects ofhydrolysis conditions on hydroxyproline content

由圖5可知，隨著加酶量增加、酶解時間延長及酶解溫度的升高，羥脯氨酸含量呈先增大后減小的趨勢；隨著溶劑用量的增大，羥脯氨酸含量下降。用軟件Design-Expert 8.0.6分析得出最佳工藝條件為：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解時間1.65 h、酶解溫度41.15 ℃。按此條件所制備的豬皮膠凍的羥脯氨酸含量為4.849 5%。考慮到實驗設備和實際操作的可行性，將上述最佳工藝條件改為：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解時間1.5 h、酶解溫度40 ℃。在此條件下進行3 次驗證性實驗，測得豬皮膠凍的羥脯氨酸平均含量為4.832 5%。與理論預測值4.849 5%較為接近，說明模型的擬合程度較好，所擬合的回歸方程對最佳工藝條件進行分析和預測非?？煽?。

2.3豬皮膠原蛋白酶解液的抗氧化活性

2.3.1對O2－·的清除作用

圖6　 豬皮膠對OO－2·的清除作用Fig.6　Superoxide anion free radical scavenging activity of porcine skin col lagen

在發(fā)光體系中，鄰苯三酚首先在堿性條件下自動氧化，產(chǎn)生O2－·，向魯米諾發(fā)起進攻。魯米諾受到刺激后處于激發(fā)態(tài)，當其從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時伴有能量的釋放，產(chǎn)生化學發(fā)光。抗氧化劑的加入可清除O2－·從而抑制化學發(fā)光。如圖6所示，空白是未加樣品產(chǎn)生的發(fā)光曲線，在2 s時達最大值，隨后迅速下降。豬皮膠的加入使發(fā)光曲線發(fā)生變化，發(fā)光值降低。

圖 7 豬皮膠對OO－2·的清除率擬合曲線Fig.7　Concentration dependence of the superoxide anion radical scavenging effect of porcine skin collagen

如圖7所示，隨著樣品質(zhì)量濃度的升高，清除率上升，對該曲線進行擬合可得到清除率與質(zhì)量濃度的曲線方程為：y=－0.029 7x2+3.122 3x－0.937 （R2=0.995 4）。當質(zhì)量濃度為25 mg/mL時，抑制率為57.72%，通過方程可得到其對O2－·清除作用IC50值為20.19 mg/mL。

2.3.2·OH的清除作用

在本體系中，Cu2+被VC還原成Cu+，Cu+與H2O2在Fenton反應中產(chǎn)生·OH，·OH氧化Phen使Phen激發(fā)，Phen退激時產(chǎn)生化學發(fā)光。如圖8所示，發(fā)光動力學曲線在24 s左右內(nèi)迅速增加到最大發(fā)光強度，之后發(fā)光值開始較緩慢的下降，在200 s左右時，各發(fā)光曲線開始趨近于平行。

圖 9 豬皮膠對·OH的清除率擬合曲線Fig.9　Concentration dependence of the hydroxyl radical scavenging effect of porcine skin collagen

如圖9所示，在質(zhì)量濃度0～20 mg/mL范圍內(nèi)，清除率隨質(zhì)量濃度增加而升高，當質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，其清除率達到98.86%，對該曲線進行擬合可得到清除率與質(zhì)量濃度的曲線方程為：y=23.187lnx+7.095 8 （R2=0.993 8），通過方程可得到其對·OH清除作用IC50值為6.36 mg/mL。

2.3.3對H2O2的清除作用

圖 10　豬皮膠對HH2O2的清除作用Fig.10　Hydrogen peroxide scavenging activity of porcine skin collagen

在有氧和堿性條件下，H2O2可以氧化魯米諾產(chǎn)生化學發(fā)光。由圖10可知，相對發(fā)光強度在2 s左右可迅速達到最大值，然后急劇下降。在40 s的時候處于平緩狀態(tài)。

圖 11 豬皮膠對HH2O2的清除率擬合曲線Fig.11　Concentration dependence of the hydrogen peroxide scavenging effect of porcine skin collagen

如圖11所示，在質(zhì)量濃度0～10 mg/mL范圍內(nèi)，清除率隨質(zhì)量濃度增加而升高，當質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，其清除率達到93.94%，對該曲線進行擬合可得到清除率與質(zhì)量濃度的曲線方程為：y = 9.771 9lnx+54.134 （R2=0.988 3），通過方程可得到其對H2O2清除作用的C50值為0.65 mg/mL。

2.3.4DNA損傷的保護作用

圖 12　豬皮膠對DNA損傷保護的清除作用Fig.12　DNA damage protection activity of porcine skin collagen

由圖12可知，CuSO4-Phen-VC-H2O2-DNA化學發(fā)光體系的動力學曲線出現(xiàn)兩個峰，其中，第一個峰是由Fenton反應產(chǎn)生的·OH攻擊Phen而出現(xiàn)的化學發(fā)光現(xiàn)象，第二個峰則是由·OH引起DNA損傷而產(chǎn)生的一個延遲化學發(fā)光峰。第二個峰出現(xiàn)不同程度的漂移，可能是啟動微弱發(fā)光儀的時間快慢不一致。DNA的損傷可引發(fā)癌基因活化，抑癌基因失活，導致惡性腫瘤細胞增殖。

圖 13 豬皮膠對DNA損傷的清除率擬合曲線Fig.13　Concentration dependence of the protective effect of porcine skin collagen against DNA damage

如圖13所示，在質(zhì)量濃度0～10 mg/mL范圍內(nèi)，豬皮膠對DNA損傷的清除率隨質(zhì)量濃度增加而升高，當質(zhì)量濃度為50 mg/mL時，其清除率達到96.52%，對該曲線進行擬合可得到清除率與質(zhì)量濃度的曲線方程為：

y=14.573lnx+40.961（R2=0.978 9），通過方程可得到其對DNA損傷保護作用的IC50值為1.86 mg/mL。

33　結 論

本研究對最佳工藝參數(shù)條件下制備的豬皮膠的功能特性進行分析，基于凝膠特性以羥脯氨酸含量為指標，通過單因素、響應面試驗優(yōu)化胃蛋白酶酶解豬皮制備酶解液的最佳工藝參數(shù)為：加酶量0.25%、料液比1∶2、酶解時間1.65 h、酶解溫度41.15 ℃。在此條件下，豬皮膠的羥脯氨酸平均含量4.832 5%，清除O2－·的IC50值20.19 mg/mL，清除·OH的IC50值6.36 mg/mL，清除H2O2的IC50值0.65 mg/mL，DNA損傷保護作用的IC50值1.86 mg/mL。

可以看出，本研究所采用的加酶高速攪拌低溫制備豬皮膠具有較強的抗氧化能力。這是因為高速攪拌使原料質(zhì)地較松散，酶解時有利于酶在底物間的充分分散，從而提高了酶解效率；另外本實驗所使用的胃蛋白酶在酶解過程中保持了具有抗氧化活性的膠原蛋白肽結構的完整性，一些研究結果顯示多肽的抗氧化活性取決于肽鏈中暴露的氨基酸側鏈的性質(zhì)和肽的氨基酸序列［21］，這與李誠［22］、張君慧［23］等的研究結果一致。豬皮膠在此工藝優(yōu)化條件下具有較好的自由基清除能力，這為豬皮在天然抗氧化劑方面的研究提供了相關的理論依據(jù)。

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Optimization of Enzymatic Hydrolysis of Porcine Skin Based on Collagen Characteristics and Antioxidant Activity of the Resulting Hydrolysate

SU Wei， YANG Xuhui， WANG Yu， MU Yingchun， QIU Shuyi
（School of Liquor and Food Engineering， Guizhou University， Guiy ang550025， China）

In this study， the pepsin-catalyzed hydrolysis of fresh pig skin was optimized by response surface methodology （RSM） based on Box-Behnken design. The antioxidant activity of the resulting hydrolysates was studied by scavenging capacities against superoxide anion radical， hydroxyl radical and hydrogen peroxide and DNA damage protection activity. The optimal conditions for the enzymatic hydrolysis of porcine skin were determined to be hydrolysis at 41.15 ℃ for 1.65 h with an enzyme amount of 0.25% and solid/liquid ratio of 1:2. Under these conditions， the IC50of the hydrolysate for scavenging of superoxide anion， hydroxyl radicals and hydrogen peroxide and for DNA damage protection were 20.19， 6.36，0.65， and 1.86 mg/mL， respectively.

pig skin； collagen； pepsin； antioxidant activity； DNA damage

TS202.3

A

1002-6630（2015）24-0070-07

10.7506/spkx1002-6630-201524012

2015-05-15

黔西南州種草養(yǎng)羊產(chǎn)業(yè)發(fā)展省州科技合作專項（黔西南科號（2012）4）；畢節(jié)實驗區(qū)科技項目（畢循專合字（2010）2K010）作者簡介：蘇偉（1974—），男，副教授，博士研究生，研究方向為食品加工與安全、畜產(chǎn)品品質(zhì)安全控制。

E-mail：suwei1886@163.com