胡衛(wèi)成，王新風，沈 婷，王毓寧，陳 銘，尤 龍，紀麗蓮，*，李鵬霞，*

（1.淮陰師范學院 江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，淮陰師范學院生命科學學院，江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 淮安　223300；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 江蘇 南京　210014）

響應面試驗優(yōu)化蓮蓬殼總黃酮超聲提取條件及其抗氧化活性

胡衛(wèi)成1，王新風1，沈 婷1，王毓寧2，陳 銘1，尤 龍1，紀麗蓮1，*，李鵬霞2，*

（1.淮陰師范學院 江蘇省高校區(qū)域現(xiàn)代農(nóng)業(yè)與環(huán)境保護協(xié)同創(chuàng)新中心，淮陰師范學院生命科學學院，江蘇省環(huán)洪澤湖生態(tài)農(nóng)業(yè)生物技術重點實驗室，江蘇 淮安223300；2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所， 江蘇 南京210014）

對蓮蓬殼總黃酮的超聲提取工藝和抗氧化活性進行研究。在單因素試驗基礎上，采用響應面分析法對超聲輔助提取的工藝參數(shù)進行優(yōu)化，得到最優(yōu)工藝條件為液料比40∶1（mL/g）、乙醇體積分數(shù)48%、提取溫度60 ℃、提取時間10 min。在此條件下測得蓮蓬殼總黃酮提取率為8.32%?？寡趸瘜嶒灲Y(jié)果表明：蓮蓬殼總黃酮具有較強清除1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基能力和還原力，同時可顯著性抑制H2O2誘導的人皮膚纖維細胞氧化應激損傷，是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。

響應面分析法；蓮蓬殼；總黃酮；超聲提??；自由基Abstract: Using Box-Behnken design and response surface methodology， the optimized extraction conditions for maximum yield （83.2 mg rutin equivalents/g） of total fl avonoids from lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.） receptacle were determined as follows: temperature， 60 ℃； ethanol concentration， 48%； ratio of liquid to solid， 40:1 （mL/g）； and extraction duration，10 min. The fl avonoids extracted from lotus receptacle （FLR） exerted remarkable scavenging effects on 1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl （DPPH） free radical and exhibited high reducing power. Moreover， FLR pretreatment effectively elevated cell viability in H2O2-treated human skin fi broblast cells. The results obtained from in vitro models clearly suggest that FLR， as a byproduct of the agricultural and food industries， is a potential source of natural antioxidant.

蓮蓬殼又名蓮房，為睡蓮科多年生水生草本植物蓮（Nelumbo nucifera Gaertn.）的干燥成熟花托，是蓮子生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)物。中醫(yī)常用于治療崩漏、尿血、產(chǎn)后瘀阻、惡露不盡等病癥［1-3］。蓮蓬殼富含大量活性物質(zhì)，其中主要以金絲桃苷、槲皮素-3-二葡萄糖苷、槲皮素、蓮房原花青素、蓮子堿為主［4-6］。現(xiàn)代藥理研究表明蓮蓬殼具有較強的抗氧化作用［7］，可有效地抑制黑色素瘤細胞B16的增殖［8］，蓮蓬殼中的蓮房原花青素和銀杏內(nèi)酯聯(lián)用能夠改善東莨菪堿所致的小鼠學習記憶障礙［9］，與半胱氨酸聯(lián)用可有效地抑制氧化應激損傷，改善記憶障礙［10］。目前蓮蓬殼中有效成分的提取工藝包括熱回流提取總黃酮工藝、微波輔助提取多酚工藝以及超聲輔助提取多酚工藝［11-12］，超聲輔助提取總黃酮工藝鮮有系統(tǒng)研究。

超聲提取是利用超聲波的機械振動與空化作用來促使植物有效成分的浸出方法，與傳統(tǒng)提取工藝相比，超聲波提取法通過破壞植物細胞膜，加快了溶劑向細胞內(nèi)的擴散和有效成分的溶出，顯著地提高了細胞物質(zhì)的溶出速率，縮短了提取時間，有效地提高了提取率。近年來超聲提取技術被廣泛用于植物有效成分的提取研究［13-17］。蓮蓬殼一般于立夏后采摘，僅少量蓮蓬殼作為民間香料使用，大部分被作為農(nóng)業(yè)廢棄物處理，不僅造成生物資源的浪費，同時也給環(huán)境帶來嚴重的污染。本實驗采用超聲輔助提取技術優(yōu)化蓮蓬殼中總黃酮提取工藝，測定其提取液抗氧化能力和對人皮膚纖維細胞氧化應激損傷的保護作用。不僅為蓮蓬殼總黃酮的高效提取開發(fā)探究新的途徑，同時也為探究天然抗氧化劑提供一定的理論基礎。

1　材料與方法

1.1材料與試劑

蓮蓬殼（江蘇省金湖縣，2013年9月），50 ℃烘干后，粉碎過80 目篩，得蓮蓬殼粉末，置常溫干燥處備用。

蘆丁標準品、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）、甲氮甲唑藍（1-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-3，5-diphenylformazan，MTT）、2，6-二叔丁基對甲基苯酚（butylated hydroxytoluene，BHT）、叔丁基對苯二酚（tertbutylhydroquinone，TBHQ）、臺盼藍美國Sigma公司；硝酸鋁、氫氧化鈉、亞硝酸鈉、氯化鐵、鐵氰化鉀、三氯乙酸、無水乙醇均為分析純試劑；人皮膚成纖維細胞CCD-986Sk細胞美國典型培養(yǎng)物保藏中心（ATCC）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清美國Gibco公司。

1.2儀器與設備

分析天平北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司；Tecan infinite M200PRO酶標儀瑞士Tecan公司；KQ-500B超聲波清洗器昆山市超聲儀器有限公司；二氧化碳培養(yǎng)箱日本Sanyo公司；倒置顯微鏡日本Olympus公司。

1.3方法

1.3.1標準曲線的制作

準確稱取蘆丁標準品0.05 g，80%乙醇溶液溶解后定容至50 mL，得到1 mg/mL蘆丁標準溶液。

參照Hossain等［18］的方法，用80%乙醇溶液配制不同質(zhì)量濃度的蘆丁標準溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg/mL），各吸取1 mL后加入5%亞硝酸鈉溶液0.3 mL，搖勻，避光反應5 min，依次加入10%硝酸鋁溶液0.3 mL，4%氫氧化鈉溶液2 mL，混勻放置15 min后，在波長510 nm處測定其吸光度。以蘆丁質(zhì)量濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標，繪制蘆丁標準曲線，標準方程Y= 0.003X－0.013 9，R2=0.999 8。式中：Y為吸光度；X為黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）。

1.3.2蓮蓬殼總黃酮含量的測定

蓮蓬殼提取物過濾后，取濾液1 mL，按照標準曲線的測定方法，在510 nm波長處測定吸光度。根據(jù)回歸方程計算蓮蓬殼中總黃酮提取率，如式（1）所示：

式中：ρ為總黃酮質(zhì)量濃度/（mg/mL）；V為提取液體積/mL；N為稀釋倍數(shù)；M為蓮蓬殼質(zhì)量/g。

1.3.3蓮蓬殼總黃酮提取的單因素試驗

分別以超聲提取時間、提取溫度、液料比、乙醇體積分數(shù)4 個單因素試驗，考察各因素對總黃酮提取率的影響。

1.3.4響應面分析法優(yōu)化工藝條件

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Design-Expert 7.0軟件進行響應面分析，優(yōu)化蓮蓬殼總黃酮的提取工藝，試驗因素與水平見表1。

表1　Box-Behnken試驗因素和水平Table 1 Factors and levels used in Box-Behnken design

1.3.5抗氧化能力測定

1.3.5.1配制不同質(zhì)量濃度蓮蓬殼總黃酮溶液

準確稱取1.000 g蓮蓬殼粉末后用響應面法所得最佳工藝參數(shù)提取，濾液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮后定容至10 mL，將定容后的提取液配制成不同質(zhì)量濃度的蓮蓬殼總黃酮溶液。

1.3.5.2蓮蓬殼總黃酮清除DPPH自由基的測定［19］

分別向板孔內(nèi)加入100 μL不同質(zhì)量濃度蓮蓬殼提取液和100 μL 0.2 mmol/L的DPPH溶液，混勻后避光反應30 min，在波長517 nm處測定吸光度，重復3 次，取平均值，對DPPH自由基清除率計算如式（2）所示。

式中：A1為DPPH溶液與待測液的吸光度之和；A2為待測液與溶劑的吸光度之和；A3為DPPH溶液與溶劑的吸光度之和。

1.3.5.3Fe3+還原能力測定［19］

取0.2 mL不同質(zhì)量濃度蓮蓬殼提取液，加入0.5 mL 0.2 mol/L pH 6.6磷酸緩沖液和0.5 mL 1%鐵氰化鉀溶液，50 ℃條件下水浴30 min，然后加入0.5 mL 10%的三氯化鐵溶液，離心，取上清液0.5 mL，加入0.5 mL蒸餾水和0.1 mL 0.1%氯化鐵溶液，混合均勻，靜置10 min。在波長700 nm處測定吸光度，重復3 次，取平均值。

1.3.5.4CCD-986Sk細胞培養(yǎng)［20］

CCD-986Sk細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL鏈霉素的DMEM培養(yǎng)液（4.5 g/L D-葡萄糖、L-谷氨酰胺、110 mg/L丙酮酸鈉）中，置于37 ℃、5% CO2細胞培養(yǎng)箱中。待細胞生長至融合率達80%時，用1 mL 0.25%胰酶+0.02%乙二胺四乙酸消化2 min，按1∶4傳代進行傳代培養(yǎng)。

1.3.5.5蓮蓬殼總黃酮對細胞存活率的影響

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至3×104個接種于96 孔板，培養(yǎng)16 h，用不同質(zhì)量濃度的蓮蓬殼總黃酮共培養(yǎng)。處理24 h后，吸取上清液，每個孔加入100 μL 的MTT工作液，于二氧化碳培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)4 h，加入100 μL MTT終止液，完全溶解后，在酶聯(lián)免疫檢測儀上于波長550 nm處測定各孔吸光度，計算細胞存活率。

1.3.5.6蓮蓬殼總黃酮對H2O2誘導細胞損傷的保護作用

取對數(shù)生長期細胞，調(diào)整細胞數(shù)至3×104個接種于96 孔板，培養(yǎng)16 h。分別設正常組（不加藥物正常培養(yǎng)的細胞），蓮蓬殼總黃酮預先處理組 （5、10、20、40 μg/mL），同時設空白對照組，每組設3 個復孔。樣品處理0.5 h后，加入1 mmol/L H2O2，處理6 h后，吸取上清，用上述方法測定細胞存活率。

1.4數(shù)據(jù)處理

2　結(jié)果與分析

2.1單因素試驗結(jié)果

圖 1　各單因素對蓮蓬殼總黃酮提取率的影響Fig.1　Effects of different extraction parameters on fl avonoid yield

由圖1a可知，超聲處理后，蓮蓬殼總黃酮提取率隨著提取時間的延長而升高，當提取時間超過40 min后，總黃酮提取率隨著時間的延長反而呈下降趨勢，可能是其他物質(zhì)如蛋白質(zhì)、糖類大量溶出影響了總黃酮的溶出率，故選擇40 min作為總黃酮的最佳提取時間。由圖1b可以看出，隨著超聲提取溫度的升高，蓮蓬殼總黃酮提取率總體趨勢是升高，這是由于溫度升高可以加快分子間運動速率，進而增大黃酮分子與乙醇水溶液的接觸面積，使得黃酮化合物更易溶出。而當提取溫度超過50 ℃，黃酮提取率略有下降，可能是由于蓮蓬殼總黃酮中存在不穩(wěn)定化合物，溫度過高被氧化造成的，故選擇50 ℃為最佳提取溫度。由圖1c可以看出，隨著液料比的增大總黃酮提取率逐漸升高。這主要是由于溶劑中溶質(zhì)濃度差逐漸在增大，使得黃酮溶解量也不斷在升高。當液料比達到30∶1（mL/g）時，增大溶劑用量，黃酮提取率反而下降。從節(jié)約成本方面考慮，故選擇料液比為30∶1（mL/g）。由圖1d可以看出，隨著乙醇體積分數(shù)的增大，總黃酮提取率也逐漸增大，當乙醇體積分數(shù)達到40%時，總黃酮提取率達到最大值。繼續(xù)增大乙醇體積分數(shù)，總黃酮提取率反而呈下降趨勢，可能因為隨著乙醇體積分數(shù)的增大，一些醇溶性雜質(zhì)溶出量也有所增加，使得黃酮浸出量受到影響，從而導致總黃酮提取率降低，故選擇40%為最佳乙醇體積分數(shù)。

2.2響應面試驗結(jié)果

2.2.1Box-Behnken試驗設計及結(jié)果

采用Design-Expert 7.0軟件，在單因素試驗的基礎上，以總黃酮提取率為響應值，根據(jù)Box-Behnken試驗設計原理，設計四因素三水平響應面試驗，試驗設計及結(jié)果見表2。

表2　響應面試驗設計及結(jié)果Table 2 Response surface design with experimental results

2.2.2回歸模型的建立與顯著性分析

表3　方差分析表Table 3 Analysis of variance of regression equation

從方差分析表3可知，由試驗數(shù)據(jù)所得模型的F值為3.28，P值為0.016 7，表示該模型顯著。由模型擬合所得回歸方程：Y=6.29+0.30A+0.53B－0.035C－0.091D－0.41AB－0.04AC－0.28AD－0.55BC+0.19BD－0.065CD+ 0.49A2+0.41B2+0.18C2－0.61D2。方程中顯著項有一次項B，二次項A2、D2，交互項均不顯著，且影響蓮蓬殼總黃酮提取率的因素依次是：B＞A＞D＞C。由此可知，各影響因素與響應值并不是簡單的線性關系。方程的失擬度0.50，與絕對誤差相比失擬度并不顯著，說明該回歸方程可以較好地描述各因素與響應值之間的真實關系，可以用其確定最佳提取工藝條件。

2.2.3響應面分析與工藝優(yōu)化

根據(jù)提取溫度、乙醇體積分數(shù)、提取時間和液料比4 個因素及其交互作用對蓮蓬殼總黃酮提取率的影響，繪制等高線圖。根據(jù)等高線橢圓形狀可反映出交互效應的強弱趨勢，如果等高線呈橢圓形表示兩因素交互作用顯著，圓形則與之相反。任兩個因素交互作用等高線見圖2。

圖 2　各交互作用對總黃酮提取率影響的等高線Fig.2　Contour plots showing the effects of extraction conditions on fl avonoid yield

確定回歸模型預測的最優(yōu)提取工藝為：提取時間10 min、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數(shù)48%、液料比40∶1（mL/g），蓮蓬殼總黃酮提取率理論值為8.64%。為檢驗該最優(yōu)提取工藝的可靠性，進行驗證實驗，得到總黃酮的提取率為8.32%。蓮蓬殼總黃酮提取率的驗證值與理論值較接近，因此認為利用響應面法優(yōu)化蓮蓬殼總黃酮的提取工藝有效可行。

2.3蓮蓬殼提取物抗氧化作用

2.3.1蓮蓬殼提取物對DPPH自由基清除能力

DPPH自由基是一種穩(wěn)定的以氮為中心的自由基，當存在抗氧化物質(zhì)時，其孤電子被配對，吸收消失或減弱，導致深紫色溶液顏色變淺，在5l7 nm波長處的吸光度變小。DPPH法測定簡便易行，靈敏可靠，重現(xiàn)性好，被廣泛用于評價天然產(chǎn)物的自由基清除活性［21-23］。由圖3可知，蓮蓬殼清除DPPH自由基能力隨著質(zhì)量濃度的升高也逐步增強，它們的自由基消除能力大小依次為VC＞蓮蓬殼總黃酮＞BHT。

同一質(zhì)量濃度不同字母表示差異顯著（P＜0.05）。圖4同。圖3　 蓮蓬殼總黃酮對DPPH自由基消除能力Fig.3　DPPH free radical-scavenging activity of fl avonoids from lotus receptacle

2.3.2蓮蓬殼提取物還原能力

圖 4　蓮蓬殼總黃酮FFee33++還原能力Fig.4　Reducing power of fl avonoids from lotus receptacle

還原力是評價物質(zhì)抗氧化活性的重要指標，該方法的機理是抗氧化劑將Fe3+還原成Fe2+的形式，從而中斷自由基的鏈式反應。還原能力的大小可以通過在波長700 nm處的吸光度來檢測，吸光度越大還原力越大，抗氧化能力越強［24-25］。由圖4可知，蓮蓬殼總黃酮、VC和TBHQ均具有一定的還原力，還原力隨著體系質(zhì)量濃度的增大而增強，且呈明顯的量效關系。

2.3.3蓮蓬殼提取物對CCD-986sk細胞氧化損傷保護作用

字母不同表示差異顯著（P＜0.05）。圖6同。圖 5　蓮蓬殼總黃酮對CCD-986sk細胞存活率的影響Fig.5　Cytotoxicity activity of fl avonoids from lotus receptacle on CCD-986sk cells

如圖5所示，與正常組相比，加入多不同質(zhì)量濃度的蓮蓬殼總黃酮的各組中細胞存活率分別為：（98.56±9.57）%、（96.32±8.62）%、（97.53±16.43）%、（94.37±17.32）%。經(jīng)統(tǒng)計學分析，組間差異沒有統(tǒng)計學意義，在實驗質(zhì)量濃度范圍內(nèi)，蓮蓬殼總黃酮對細胞的毒性作用不會影響其對H2O2誘導的皮膚纖維細胞損傷的保護作用研究。

圖6　 蓮蓬殼總黃酮HH2O2引起CCD-986sk細胞毒性保護作用Fig.6　Cytoprotective activity of fl avonoids from lotus receptacle on H2O2induced CCD-986sk cell injury

如圖6所示，與對照組比較，模型細胞存活率顯著降低。說明模型組CCD-986sk細胞經(jīng)過1 mmol/L H2O2作用6 h后，細胞損傷明顯，活力顯著降低。由圖6可以看出，蓮蓬殼總黃酮質(zhì)量濃度5 μg/mL時，對H2O2造成的氧化損傷并無保護作用，而當蓮蓬殼總黃酮質(zhì)量濃度不小于10 μg/mL，則表現(xiàn)出明顯的保護作用。

33　結(jié) 論

結(jié)果表明，選擇提取時間10 min、提取溫度60 ℃、乙醇體積分數(shù)48%、液料比40∶1（mL/g），蓮蓬殼總黃酮提取率可達8.32%。該提取物能清除DPPH自由基能力與還原力均隨質(zhì)量濃度增加而增強，同時可顯著抑制H2O2誘導的人皮膚纖維細胞氧化應激損傷，是一種極具開發(fā)潛力的天然抗氧化劑。下一步的研究工作將對提取物進一步的分離、純化和鑒定，探討發(fā)揮抗氧化活性的主要單體成分。

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Optimization of the Extraction Process for Flavonoids from Lotus （Nelumbo nucifera Gaertn.） Receptacle and Their Antioxidant Activities

HU Weicheng1， WANG Xinfeng1， SHEN Ting1， WANG Yuning2， CHEN Ming1， YOU Long1， JI Lilian1，*， LI Pengxia2，*
（1. Jiangsu Key Laboratory for Eco-Agricultural Biotechnology around Hongze Lake， Jiangsu Collaborative Innovation Center of Regional
Modern Agriculture & Environmental Protection， Huaiyin Normal University， School of Life Science， Huaiyin Normal University，Huai'an223300， China； 2. Institute of Agro-product Processing， Jiangsu Academy of Agricultural Sciences， Nanjing210014， China）

response surface methodology； lotus receptacle； total fl avnoids； ultrasound-assisted extraction； free radicals

Q501

A

1002-6630（2015）24-0051-06

10.7506/spkx1002-6630-201524009

2015-05-17

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項目（CX（13）3079）

胡衛(wèi)成（1984—），男，副教授，博士，研究方向為食品分子營養(yǎng)學 。E-mail：hu_weicheng@163.com

紀麗蓮（1965—），女，教授，博士，研究方向為微生物與生化藥學。 E-mail：jll2663@sina.com

李鵬霞（1976—），女，研究員，博士，研究方向為果蔬保鮮與加工。E-mail：lpx213@126.com