楊澤華，楊長(zhǎng)水，韋建華，盧汝梅（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧　53000；.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州　5009）

荔枝草提取物的體外抗菌活性研究

楊澤華1，楊長(zhǎng)水2，韋建華1，盧汝梅1
（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧530001；2.揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院，江蘇 揚(yáng)州225009）

摘要：［目的］研究荔枝草提取物的體外抗菌活性。［方法］采用試管稀釋法，測(cè)定了荔枝草提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的最低抑菌濃度（MIC）。采用紙片擴(kuò)散法測(cè)定荔枝草中部分化學(xué)成分的抑菌圈直徑。［結(jié)果］荔枝草乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)受試菌株的MIC可低至3.1 mg/ml，具有明顯抑菌作用；荔枝草中齊墩果酸和2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有明顯抑菌效果。［結(jié)論］荔枝草抗菌作用的活性部位是乙酸乙酯部位和正丁醇部位；齊墩果酸和2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸是荔枝草抗菌作用的主要活性成分。

關(guān)鍵詞：荔枝草；齊墩果酸；2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸；抗菌活性

荔枝草（Salvia plebeia R.Br.）又名蛤蟆草、雪見(jiàn)草、皺皮草等，為唇形科鼠尾草屬植物，全草入藥。廣泛分布于除西北以外的全國(guó)各地，野生資源極為豐富。荔枝草始載于《本草綱目》，具有清熱解毒、涼血止血、利尿作用［1］?，F(xiàn)代藥理研究表明，荔枝草具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、鎮(zhèn)靜、止咳化痰、抗組胺和抗氧化作用［2-5］，此外還有明顯的抗菌抗炎作用，可抑制和殺傷多種細(xì)菌、病毒，有利于清除體內(nèi)抗原，減少免疫復(fù)合物的形成［6］。筆者前期從荔枝草中分離鑒定了齊墩果酸、高車前素、2α，3β，24-三羥基-12-烯-28-齊墩果酸、3，4-二羥基苯甲酸、2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸、2α，3β-二羥基-12-烯-28-齊墩果酸、高車前苷、假荊芥屬苷等化合物［7］。在此基礎(chǔ)上，本文對(duì)荔枝草不同提取物和單體化合物的體外抗菌活性進(jìn)行初步研究，以明確其有效部位和有效成分，為深入探討其物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制研究提供依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1試藥荔枝草采于廣西大明山，經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)劉壽養(yǎng)副教授鑒定為唇形科植物荔枝草Salvia plebeia R.Br.。荔枝草用乙醇回流提取，回收乙醇得乙醇總提取物，乙醇總提取物用系統(tǒng)溶劑分離法分離得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位的浸膏，單體化合物提取參考文獻(xiàn)［7］的方法，臨用前以生理鹽水溶解，無(wú)菌過(guò)濾后備用。

1.2試劑所用溶劑均為分析純（上海化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；0.9%氯化鈉注射液（廣西南寧百會(huì)藥業(yè)集團(tuán)有限公司產(chǎn)品）；醫(yī)用蒸餾水；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）；DMSO（天津匯英化學(xué)試劑有限公司提供）；0.2%氧氟沙星注射液（江蘇揚(yáng)州中寶制藥有限公司）；營(yíng)養(yǎng)瓊脂（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品）。

1.3試驗(yàn)菌株金黃色葡萄球菌ATCC35923，表皮葡萄球菌ATCC12228，大腸桿菌ATCC25922，綠膿桿菌ATCC27853均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，由廣西中醫(yī)藥大學(xué)微生物與免疫學(xué)教研室保存提供。

1.4儀器DLF560型超凈工作臺(tái)（荷蘭clear Air Techniek bv公司）；YXO-8G41.208壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)公司）；AG135型電子天平（瑞士產(chǎn)）；HHB11.500電熱恒溫培養(yǎng)箱（中國(guó)上海醫(yī)療器械七廠）；一次性使用無(wú)菌注射器（規(guī)格:1 ml，2 ml，5 ml；浙江京環(huán)醫(yī)療有限公司）。

2　方法

2.1瓊脂稀釋法［8-10］取保存的實(shí)驗(yàn)菌株接種于瓊脂平皿培養(yǎng)基上，在37℃條件下孵育24 h后，挑取典型的單個(gè)菌落，轉(zhuǎn)接種于肉湯培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)孵育18 h，得到的菌液作為實(shí)驗(yàn)菌液備用。分別稱取荔枝草乙醇總提取物及石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位浸膏各1.0 g溶于20 ml 0.9%氯化鈉注射液中，不易溶于水的可先用二甲基亞砜（DMSO）溶解后再加水定容，DMSO含量小于0.5%（V/V），分別制備得到濃度為50 mg/ml的受試藥液。將各提取物溶液倍比稀釋成 8個(gè)不同濃度（50，25，12.5，6.3，3.1，1.6，0.8，0.4 mg/ml），分別吸取各提取物原液和稀釋液與已融化并冷卻至40℃左右的普通瓊脂培養(yǎng)基均勻混合，制成不同含藥濃度的平板培養(yǎng)基（厚度約為4 mm），編號(hào)為1～8。另外以含0.5% DMSO的培養(yǎng)基和不加藥液的培養(yǎng)基作為空白對(duì)照實(shí)驗(yàn)，編號(hào)為9～10。用定量接種環(huán)取試驗(yàn)液，在無(wú)菌條件下分別接種于不同濃度的各含藥培養(yǎng)基中，置于37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18 h。

2.2紙片法［11-12］將從荔枝草中分離得到的單體化合物齊墩果酸（Ⅰ），2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸（Ⅱ），高車前苷（Ⅲ），假荊芥屬苷（Ⅳ），用丙酮配成25 μg/ml濃度的樣品溶液，選用直徑為6mm的滅菌濾紙片，以氧氟沙星藥敏片（濃度為25 μg/ml）作為陽(yáng)性對(duì)照，生理鹽水浸潤(rùn)的濾紙片作為陰性對(duì)照。用滅菌鑷子夾起每張濾紙片，蘸取藥液至布滿濾紙片，待溶劑揮發(fā)后，將已點(diǎn)樣的濾紙圓片貼于已涂布上述各菌懸液100 μl（菌液濃度106～107cfu/ml）的瓊脂培養(yǎng)基上，放入25℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。第2天測(cè)量其抑菌圈的直徑大小。

3　結(jié)果與分析

3.1提取物的最低抑菌濃度（MIC） 檢查整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中檢測(cè)菌的存活狀態(tài)，以能肉眼可見(jiàn)菌落生長(zhǎng)被完全抑制的最低藥物濃度為該藥對(duì)檢測(cè)菌的MIC。單一菌生長(zhǎng)可忽略不計(jì)。荔枝草總提取物和石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位、水部位提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌的MIC測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1　荔枝草提取物對(duì)4株試驗(yàn)菌的最低抑菌濃度（mg/ml）

由表1可知，除水部位提取物外，荔枝草其它提取物對(duì)4株試驗(yàn)菌均有一定的抑菌作用，其中石油醚部位抑菌作用最弱，乙酸乙酯部位和正丁醇部位抑菌作用最強(qiáng)，乙酸乙酯部位和正丁醇部位均能顯著抑制金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌等革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)，MIC可低至3.1 mg/ml。

3.2化合物的抑菌圈測(cè)定化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)4株試驗(yàn)菌的抑菌圈測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。抑菌程度常用敏感度來(lái)表示，判斷標(biāo)準(zhǔn):抑菌圈直徑大于15 mm為高度敏感，10～15 mm為中度敏感，7～9 mm為低度敏感，無(wú)抑菌圈表示無(wú)抑菌作用（—）。

表2　荔枝草中化合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)4株試驗(yàn)菌的抑菌圈直徑（mm）

從表2可知，陽(yáng)性對(duì)照藥氧氟沙星對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、綠膿桿菌的抑菌圈直徑均＞15 mm，具有高度敏感；對(duì)大腸桿菌的抑菌圈直徑為14.1 mm，屬中度敏感；化合物Ⅰ、Ⅱ?qū)瘘S色葡萄球菌及表皮葡萄球菌兩種革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著抑制作用，抑菌圈直徑分別為14.7、15.2 mm及16.4、17.5 mm；化合物Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ對(duì)上述四種菌均有顯著抑制作用，抑菌圈直徑為11.5～17.5 mm，均為中度敏感以上；且4種化合物對(duì)所測(cè)試的革蘭氏陰性菌的抑菌圈直徑均小于14 mm，整體抑菌作用弱于對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的作用。

4　結(jié)論

通過(guò)體外抑菌試驗(yàn)結(jié)果表明，荔枝草乙醇總提取物及各部位提取物在體外對(duì)金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌均表現(xiàn)出一定的抗菌活性，其中乙酸乙酯部位和正丁醇部位對(duì)金黃色葡萄球菌及表皮葡萄球菌有良好的抑制作用，而其它部位對(duì)該類菌的抑菌作用相對(duì)較弱。結(jié)果表明荔枝草抗菌活性部位主要是中等偏大的極性部位。

從荔枝草中分離得到的齊墩果酸（Ⅰ）和2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸（Ⅱ）對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌有顯著抑制作用，說(shuō)明該類成分是荔枝草抑制革蘭氏陽(yáng)性菌有效成分之一。高車前苷（Ⅲ）和假荊芥屬苷（Ⅳ）2種黃酮類成分對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用弱于齊墩果酸和2α，3β-二羥基-12-烯-28-烏蘇酸，而對(duì)革蘭氏陰性菌抑菌作用強(qiáng)于后者，這提示不同結(jié)構(gòu)的化合物其抑菌譜可能存在差異，值得進(jìn)一步深入研究。

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（編輯陳明偉）

中圖分類號(hào)：R284.1

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4441（2015）02-0065-03

收稿日期:2015-02-20

通信作者:盧汝梅，E-mail:lrm1969@163.com

Study on Antibacterial Activity in vitro of Extract from Salvia plebeia

YANG Ze-hua1，YANG Chang-shui2，WEI Jian-hua1，LU Ru-mei1

（1.Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001；2.College of Medicine，Yangzhou University，Yangzhou，Jiangsu，225009）

Abstract:［Objective］To study on the antibacterial activity in vitro of extract of Salvia plebeia R.Br.［Methods］Tube dilution method was used to determine the minimal inhibitory concentration（MIC）of extract from Salvia plebeian on staphylococcus aur-eus，staphylococcus，Escherichia oli，pseudomonas aeruginosa.Disc diffusion method was used to determine antibacterial circle diameter of partial chemical composition in Salvia plebeia R.Br.［Results］The MIC of Salvia ethyl acetate and n-butanol fraction on tested strains could be as low as 3.1 mg/ml，which showed significant bacteria-inhibitory effect；oleanic acid and 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid in Salvia plebeia had significant bacteria-inhibitory effect on gram-positive bacterium.［Conclusion］The antibacterial active sites of Salvia plebeia are ethyl acetate and n-butanol fraction.The main antibacterial active ingredients of Salvia plebeia are oleanic acid and 2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid.

Keywords:Salvia plebeia R.Br.；oleanic acid；2α，3β-dihydroxyurs-12-en-28-oic acid；antibacterial activity