羅雪菲，顧國龍，蘭太進(jìn)（.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧　5300；.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧　53000）

余甘子葉提取物對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響

羅雪菲1，顧國龍1，蘭太進(jìn)2
（1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院，廣西 南寧530011；2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，廣西 南寧530200）

摘要：［目的］觀察余甘子葉提取物（PL）對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響。［方法］建立H22荷瘤小鼠模型，灌胃給予余甘子葉提取物高、中、低劑量（1.982，0.991，0.496 g/kg），觀察余甘子葉提取物對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響。［結(jié)果］余甘子葉提取物高、中劑量（1.982，0.991 g/kg）能顯著提高荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞及其CD4+亞群相對數(shù)量（P＜0.05），上調(diào)CD4+/CD8+亞群比例（P＜0.05）。［結(jié)論］通過提高T淋巴細(xì)胞及其CD4+亞群相對數(shù)量，使CD4+/CD8+比例接近正常值，此可能是余甘子葉提取物抗腫瘤的免疫學(xué)機(jī)制之一。

關(guān)鍵詞：余甘子葉提取物；荷瘤小鼠；CD3+；CD4+；CD8+

余甘子葉來源于大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblica L.，近年來研究報(bào)道余甘子葉具有抗腫瘤［1-2］、增強(qiáng)免疫［3］、抗菌［4］、抗炎［5］等廣泛的藥理作用。本研究進(jìn)一步觀察余甘子葉提取物對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響，為明確其抗腫瘤免疫機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1　實(shí)驗(yàn)材料

1.1受試藥物余甘子葉提取物（PL）:將余甘子葉曬干，打碎成最粗粉，加乙醇滲漉提取得滲濾液，再減壓蒸餾得到干浸膏，最后加入乙酸乙酯萃取得到PL。以蘆丁為對照品，經(jīng)高效液相色譜法測定PL總黃酮含量為50%。本實(shí)驗(yàn)所用PL由廣西中醫(yī)藥大學(xué)新藥研究開發(fā)中心制備。

1.2細(xì)胞株小鼠肝癌細(xì)胞株（H22），取自廣西中醫(yī)藥研究院。1.3動(dòng)物昆明種小鼠，SPF級，購于廣西醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào):SCXK桂2009-0002。

1.4試劑HANK’S Balanced Salt Mixture（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格:每瓶500 ml；批號(hào):20140810）；小鼠外周血淋巴細(xì)胞分離液（北京索萊寶科技有限公司，規(guī)格:每瓶100 ml；批號(hào):20140719）；氯化鈉注射液（上海信誼金朱藥業(yè)有限公司，規(guī)格:每支10 ml；批號(hào):140829）；FITC Hamster Antimouse CD3e（美國BD公司，規(guī)格:0.5 mg/ml；批號(hào):4216765）；PE-CYTM7Ratanti-mouseCD4（美國BD公司，規(guī)格:0.2mg/ml；批號(hào):3247509）；PE Rat anti-mouse CD8a（美國BD公司，規(guī)格:0.2 mg/ml；批號(hào):3276860）。

1.5儀器3210型單道可調(diào)移液器（德國Eppendorf公司）；明澈TM-D超純水儀（美國Millipore公司）；ST16R型離心機(jī)（Thermo Fisher公司）；AL104型電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；EL-620J型電子天平（常州市天之平儀器設(shè)備有限公司）；SW-CJ-2FD型潔凈工作臺(tái)（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；YXQ-LS-50-SⅡ型立式壓力蒸汽滅菌器（上海博迅實(shí)業(yè)有限醫(yī)療設(shè)備廠）；Primovert型倒置式顯微鏡（德國ZEISS公司）；LSR Fortessa型流式細(xì)胞分析儀（美國BD公司）。

2　方法與結(jié)果

2.1造模與給藥50只昆明小鼠，雌雄各半，分為5組，分別為空白對照組、模型對照組和PL高、中、低劑量組（1.982，0.991，0.496 g/kg）。除空白對照組外，其余4組小鼠均在右前肢腋窩皮下注射H22細(xì)胞懸液（濃度為2×107/ml，每只0.2 ml）造成H22荷瘤小鼠模型。造模后24 h各組開始每日灌胃給藥1次（20 ml/kg），空白對照組和模型對照組同時(shí)給予等量蒸餾水，連續(xù)給藥7 d。

2.2指標(biāo)檢測末次給藥后1 h，各組小鼠用平口毛細(xì)管從眼眶后靜脈叢采血20滴/只（EDTA-2Na抗凝），按1∶1比例加入HANK’S Balanced Salt Mixture稀釋血液，再將其緩緩傾斜加至盛有小鼠淋巴細(xì)胞分離液的15 ml離心管中，保持界面清晰，4℃離心（800 g）20 min后吸出中間層的白色淋巴細(xì)胞，移至另一支15 ml離心管內(nèi)，每管加入10 ml PBS，重懸，4℃離心（400 g）20 min后棄去上清液，再加入2 ml PBS，重懸，4℃離心（300 g）5 min后棄去上清液，加適量PBS重懸，取20 μl加于血細(xì)胞計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞濃度為1.0×108/ml，之后加表面抗體（FITC Hamster Anti-mouse CD3e，PE-CYTM7 Rat anti-mouse CD4，PE Rat anti-mouse CD8a）混勻，4℃冰箱避光孵育30 min，每管加入1ml PBS，混勻，4℃離心（300 g）5 min，吸取上清液，加入500 μl 1%多聚甲醛，200目過濾后流式細(xì)胞儀檢測。

2.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 19.0 for Windows進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，計(jì)量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組均數(shù)之間進(jìn)行one-way ANOVA比較檢驗(yàn)，以P＜0.05為有顯著性差異。

2.4對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響見表1。

表1　PL對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響（±s，n=10）

表1　PL對荷瘤小鼠外周血T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響（±s，n=10）

注:與空白對照組比較，①P＜0.05；與模型對照組比較，②P＜0.05

CD4+/CD8+（%）空白對照組—　55.1±1.9　32.3±3.7　22.3±3.0　1.50±0.36模型對照組—　52.0±3.1①　28.3±4.4①　23.6±3.4　1.21±0.2①PL高劑量組　1.982　54.8±2.6②　32.1±3.6②　22.3±2.9　1.48±0.33②PL中劑量組　0.991　55.0±2.4②　31.8±2.3②　22.5±2.7　1.44±0.27②PL低劑量組　0.496　51.7±4.2　30.3±5.6　21.8±5.9　1.51±0.5組別劑量（g/kg）T淋巴細(xì)胞（%）CD4+亞群（%）CD8+亞群（%）

結(jié)果表明，與空白對照組比較，荷瘤小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞（CD3+）及其CD4+亞群相對數(shù)量顯著降低（P＜0.05），T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比例顯著降低（P＜0.05）；在灌胃給予PL高、中劑量（1.982，0.991 g/kg）干預(yù)后，模型小鼠外周血中T淋巴細(xì)胞（CD3+）、T淋巴細(xì)胞CD4+亞群相對數(shù)量顯著提高（P＜0.05）；T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比例顯著提高（P＜0.05），并接近正常小鼠水平，與空白對照組比較無顯著性差異（P＞0.05）。

3　討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，機(jī)體組織細(xì)胞的凋亡、代謝及疾病的發(fā)生發(fā)展都與機(jī)體免疫系統(tǒng)的功能密切有關(guān)，若機(jī)體的免疫功能不能對細(xì)胞的凋亡進(jìn)行調(diào)控，相應(yīng)組織器官就會(huì)發(fā)生病變，如艾滋病、腫瘤等疾病均為機(jī)體免疫系統(tǒng)失調(diào)導(dǎo)致免疫功能低下所致。T淋巴細(xì)胞是構(gòu)成機(jī)體免疫防御系統(tǒng)的重要細(xì)胞，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和判斷治療效果及預(yù)后的過程發(fā)揮著重要的作用，CD3+、CD4+、CD8+是T淋巴細(xì)胞細(xì)胞膜上的分化抗原簇，CD3+為所有T細(xì)胞的特有標(biāo)志，CD4+為輔助性T細(xì)胞的標(biāo)志，CD8+為細(xì)胞毒性T細(xì)胞的標(biāo)志。其中CD4+T淋巴細(xì)胞能通過輔助B細(xì)胞產(chǎn)生抗體、分泌細(xì)胞因子，促進(jìn)效應(yīng)細(xì)胞抗腫瘤作用，CD8+T淋巴細(xì)胞則主要是相反的免疫抑制作用［6］，因此通過檢測T淋巴細(xì)胞及其亞群可以有效地了解腫瘤的發(fā)生和發(fā)展及藥物的抗腫瘤療效。

本課題組前期實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PL對荷瘤小鼠表現(xiàn)出較好的抗腫瘤效果及免疫調(diào)節(jié)作用［1］。為進(jìn)一步完善其抗腫瘤免疫機(jī)制，本試驗(yàn)在此基礎(chǔ)上觀察了PL對荷瘤小鼠T淋巴細(xì)胞CD4+、CD8+亞群的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，荷瘤小鼠經(jīng)PL高、中劑量（1.982，0.991 g/kg）灌胃給藥干預(yù)后，外周血中T淋巴細(xì)胞及其CD4+亞群、CD4+/CD8+數(shù)量顯著提高，并接近正常小鼠水平。結(jié)果提示，余甘子葉提取物能提高T淋巴細(xì)胞及其CD4+亞群相對數(shù)量，使T淋巴細(xì)胞CD4+/CD8+比例接近正常值，由此推測，該作用可能是其抗腫瘤的免疫學(xué)機(jī)制之一。

參考文獻(xiàn)

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（編輯陳明偉）

中圖分類號(hào)：R285.5

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：2095-4441（2015）02-0004-03

收稿日期:2015-02-27

基金項(xiàng)目:廣西中藥藥效研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（省級）開發(fā)課題（編號(hào):051-06-K6）；廣西中醫(yī)藥大學(xué)自然科學(xué)研究項(xiàng)目（編號(hào): YB14001）

作者簡介:羅雪菲（1981-），女，漢族，醫(yī)師，碩士，研究方向:臨床輸血檢驗(yàn)教學(xué)與科研

通信作者:蘭太進(jìn)，E-mail:lantj0302@yahoo.com.cn

The Effect of Extract of Phyllanthus Emblica Leaves（PL）on CD4+and CD8+in Peripheral T-cell lymphocyte of Tumor-bearing Mice

LUO Xue-fei1，GU Guo-long1，LAN Tai-jin2
（1.Ruikang hospital Affiliated to Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530011；2.College of Preclinical Medicine，Guangxi University of Chinese Medicine，Nanning，Guangxi，530001）

Abstract:［Objective］ToobservetheeffectofextractinPLonCD4+and CD8+in peripheral T-cell lymphocyte of tumor-bearing mice. ［Methods］H22mice tumor-bearing model was established and treated with PL of high，medium and low dose（1.982，0.991，0.496 g/kg）by intragastric administration.The effect of PL on CD4+and CD8+in peripheral T-cell lymphocyte of tumor-bearing mice was observed. ［Results］The extract in PL of high and medium doses（1.982，0.991 g/kg）could significantly improve the relative quantity of T lymphocyte and CD4+T lymphocyte of tumor-bearing mice（P＜0.05）and up-regulated the proportion of CD4+and CD8+（P＜0.05）. ［Conclusion］Improving the quantity of T lymphocyte and CD4+T lymphocyte of tumor-bearing mice can make the proportion of CD4+/ CD8+T lymphocyte close to normal value.That is one of the anti-tumor immunological mechanisms of PL extract.

Keywords:Extract of Phyllanthus Emblica Leaves（PL）；Tumor-bearing Mice；CD3+；CD4+；CD8+