賈倩楠，趙麗麗，鄧 濤，曹萌萌

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)研究所， 北京 100176)

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研究論文

重組H9N2禽流感病毒的構(gòu)建及其在不同細(xì)胞中的復(fù)制特性

賈倩楠，趙麗麗，鄧 濤，曹萌萌*

(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 病原生物學(xué)研究所， 北京 100176)

目的利用反向遺傳學(xué)技術(shù)構(gòu)建具有感染性的H9N2亞型禽流感病毒，并揭示其在不同細(xì)胞中的復(fù)制特性。方法以A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)禽流感病毒基因組RNA為模板，用RT-PCR技術(shù)獲得該病毒的8條完整基因片段，并分別將它們插入到pHW2000載體上，最終在293T細(xì)胞中包裝產(chǎn)生重組H9N2病毒。并將重組的H9N2病毒感染不同細(xì)胞，觀察病毒在不同細(xì)胞上的增殖狀況來揭示該病毒在不同細(xì)胞上的復(fù)制特性。結(jié)果應(yīng)用流感病毒8質(zhì)粒反向遺傳學(xué)技術(shù)，成功獲得重組病毒，并揭示了該毒株在不同細(xì)胞(A549, MDCK, Vero)中的復(fù)制特性,發(fā)現(xiàn)A549人肺腺癌細(xì)胞更適宜H9N2病毒的正常復(fù)制。此外還分析總結(jié)了該毒株的與病毒毒力相關(guān)的重要位點(diǎn)特征。結(jié)論成功建立了H9N2禽流感病毒的反向遺傳系統(tǒng)，該系統(tǒng)的建立為在分子水平研究H9N2病毒以及制備H9N2禽流感疫苗提供了依據(jù)。

禽流感病毒；反向遺傳學(xué)；復(fù)制特性

近年來，流感病毒的傳播呈現(xiàn)出新的趨勢，如高致病性毒株不斷出現(xiàn)、禽流感病毒突破宿主間屏障進(jìn)行跨種間傳播[1]等。1998年H9N2禽流感病毒在廣東出現(xiàn)全球首例人感染H9N2病毒的病例，隨后在香港和內(nèi)地也出現(xiàn)人感染H9N2病毒的病例。這說明H9N2病毒已經(jīng)突破宿主間屏障，能夠直接感染人類。有血清學(xué)調(diào)查顯示，H9N2病毒對人源唾液酸受體的親和力，比H5N1更強(qiáng)[2]。還有研究發(fā)現(xiàn)，H9N2病毒的HA和NA與2009年世界大流行的H1N1病毒6個基因重組的病毒能顯著提高病毒的致病力和適應(yīng)性[3]。如果H9N2病毒發(fā)生變異，獲得更高的致病力和人與人直接傳播的能力，極有可能導(dǎo)致下一次流感大流行。因此，對H9N2禽流感病毒的研究和監(jiān)測具有重要的意義。

1 材料與方法

1.1 主要材料

A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)(中國科學(xué)院生物物理研究所李春峰博士饋贈)。pGL3-IFNβ-Luc和pGL3-RLuc質(zhì)粒(趙振東教授饋贈)。RNA提取試劑Trizol、反轉(zhuǎn)錄試劑SuperScriptⅢ和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000(Invitrogen公司)。T4 DNA連接酶和BsmBⅠ限制性內(nèi)切酶(New England BioLabs公司)。錐蟲藍(lán)染液Trypan Blue Dye(BIO-RAD公司)。熒光素酶檢測試劑盒Dual-Luciferase Reporter Assay System和MTT試劑(Promega公司)。

1.2 引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)病毒序列設(shè)計(jì)反轉(zhuǎn)錄通用引物5′-AGC AAAAGCAGG-3′。同時設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增引物，在引物5′加入BsmBⅠ酶切位點(diǎn)(表1)。

表1 H9N2病毒各基因引物序列Table 1 Primer sequences of eight genes of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

1.3 重組質(zhì)粒的構(gòu)建

按照相應(yīng)試劑說明書提取病毒RNA，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增。PCR產(chǎn)物及pHW2000經(jīng)酶切連接后，轉(zhuǎn)化并挑取陽性克隆測序，得到8個重組質(zhì)粒。

1.4 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和病毒拯救

將8個重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到MDCK和293T細(xì)胞中，當(dāng)有明顯的細(xì)胞病變時收集上清，即為所需的病毒，經(jīng)兩次傳代培養(yǎng)后作為病毒儲存液。

1.5 噬斑計(jì)數(shù)實(shí)驗(yàn)和病毒增殖曲線繪制

將病毒逐次10倍稀釋，分別感染MDCK細(xì)胞，37 ℃孵育72 h，計(jì)數(shù)可見噬斑的數(shù)量，并計(jì)算病毒滴度。將病毒以MOI=0.001感染細(xì)胞，分別收取12～108 h的細(xì)胞上清，根據(jù)不同時間的病毒滴度繪制病毒的增殖曲線。

1.6 錐蟲藍(lán)染色實(shí)驗(yàn)

將病毒以MOI=0.1感染細(xì)胞，待感染的細(xì)胞出現(xiàn)明顯病變后，加入0.04%錐蟲藍(lán)染液，3 min后觀察細(xì)胞活性變化。

1.7 MTT實(shí)驗(yàn)

將H9N2病毒分別以MOI=1、2、4感染A549細(xì)胞，按參考文獻(xiàn)[4]的實(shí)驗(yàn)步驟，于490 nm波長處測量吸光度。

1.8 細(xì)胞干擾素表達(dá)活性檢測

將pGL3-IFNβ-Luc和 pGL3-RLuc質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中，24 h后將病毒以MOI=1感染細(xì)胞。24 h后裂解細(xì)胞，檢測熒光素酶。

圖1 H9N2禽流感病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物電泳圖Fig 1 RT-PCR products of genes from avian influenza virus A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

2 結(jié)果

2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

H9N2病毒RNA的RT-PCR產(chǎn)物(圖1)，并對8個重組質(zhì)粒測序，各片段序列與原始毒株完全一致。

2.2 重組病毒的拯救

細(xì)胞轉(zhuǎn)染(圖2)后，細(xì)胞病變情況(圖3)。同時對病毒進(jìn)行全基因組測序，測序結(jié)果與原始毒株的序列完全一致。

圖2 8質(zhì)粒操作系統(tǒng)拯救病毒流程圖Fig 2 Eight-plasmid system for generation of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

A.cytopathic effect; B.negative control圖3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后細(xì)胞病變結(jié)果Fig 3 Cytopathic effect after cell transfection(×100)

2.3 病毒復(fù)制能力的比較

重組病毒與野生型病毒在MDCK細(xì)胞上的增殖幾乎一致，編碼H9N2的8個重組質(zhì)粒被成功構(gòu)建，得到H9N2亞型流感病毒(圖4)。

圖4 病毒在MDCK細(xì)胞上的增殖曲線Fig 4 Growth curves of the viruses in MDCK cells

2.4 病毒對細(xì)胞功能的影響

H9N2病毒能對細(xì)胞造成損傷(圖5A,B)，可以誘導(dǎo)細(xì)胞死亡并呈現(xiàn)劑量依賴現(xiàn)象(圖5C)。感染H9N2病毒的細(xì)胞干擾素表達(dá)量是正常細(xì)胞表達(dá)量的17.58倍，H9N2病毒能夠誘導(dǎo)細(xì)胞表達(dá)更高水平的干擾素。

2.5 病毒在不同細(xì)胞復(fù)制能力的比較

H9N2病毒在A549上增殖最快；在MDCK上增殖較慢，滴度較A549細(xì)胞低；在Vero上增殖過程與MDCK相似，但病毒滴度比MDCK上高(圖6)。

2.6 A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)毒力相關(guān)的重要位點(diǎn)分析

該病毒的PB2上與毒力相關(guān)的位點(diǎn)呈現(xiàn)低毒力特征， 而在PA上則多呈現(xiàn)高的復(fù)制活性。此外還對決定宿主特異性的關(guān)鍵位點(diǎn)進(jìn)行了分析，表現(xiàn)為PB2 627E/701D，提示了H9N2的跨種傳播并不依賴于上述兩個位點(diǎn)的改變(表2)。

A.trypan blue dye after cell infection; B.negative control; C.MTT assay

圖6 病毒在不同細(xì)胞上的增殖曲線Fig 6 Growth curves of the viruses in different cells

3 討論

2013年爆發(fā)的H7N9病毒6個內(nèi)部基因來源于兩個不同組的H9N2病毒[11]。而H7N9本是感染野生鳥類的禽流感病毒，在家禽中幾乎無法生存并傳播，而H7N9和H9N2的基因重組可能就是H7N9在禽類中傳播的原因，也可能由此演變成能感染人類的病毒[12]。因此，H9N2禽流感病毒對人類健康造成嚴(yán)重威脅，迫切需要全球的共同監(jiān)測及預(yù)防。

本研究發(fā)現(xiàn)H9N2病毒在3種不同細(xì)胞中都能正常增殖，提示了H9N2病毒具有跨種傳播的潛質(zhì)。同時該病毒在A549細(xì)胞上的復(fù)制速度遠(yuǎn)高于MDCK和Vero細(xì)胞，這提示人肺腺癌細(xì)胞更適合H9N2病毒增殖。此外，該病毒在Vero細(xì)胞上的整體病毒滴度較MDCK高，由于Vero細(xì)胞上缺乏INF受體，不能激活I(lǐng)NF信號通路，因此更利于流感病毒的復(fù)制。

通過流感病毒反向遺傳學(xué)研究，發(fā)現(xiàn)禽流感病毒PB2 627位點(diǎn)與病毒的復(fù)制能力和宿主特異性有密切的關(guān)系，E627K突變不僅提高病毒的復(fù)制能力，而且增強(qiáng)了病毒對小鼠的致病力，揭示了H5N1對人類致病的分子機(jī)制，而通過分析看到，H9N2的627位氨基酸仍為E，為禽類流感病毒特有的，但該病毒在哺乳動物細(xì)胞上增殖狀態(tài)良好，提示了該H9N2病毒在跨種傳播上不依賴于PB2 627位點(diǎn)的突變。PB2 627E/701N可能是PB2 627K在增強(qiáng)哺乳動物感染可能性上的補(bǔ)充[5]，由此推測，H9N2病毒能夠感染哺乳動物很可能存在新的潛在決定位點(diǎn)。

表2 A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)毒力相關(guān)的分子標(biāo)記Table 2 Molecular virulence markers of A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2)

由于H9N2病毒可以跨種傳播，且致病力比H5N1弱，因此可作為研究跨種傳播機(jī)制的模式病毒。H9N2病毒反向遺傳學(xué)技術(shù)的建立，不僅可以研究禽流感病毒跨種屬傳播人類的機(jī)制，對禽流感病毒的重組和進(jìn)化進(jìn)行有效監(jiān)控；還可以對病毒基因組進(jìn)行修飾改造，研究與減毒及溫度敏感表現(xiàn)型有關(guān)的序列，鑒定得到優(yōu)質(zhì)高效的疫苗株，為H9N2病毒新型疫苗的研制開辟新途徑；同時通過結(jié)合點(diǎn)突變技術(shù)，在病毒復(fù)制能力、致病性和宿主適應(yīng)性的研究上發(fā)揮了關(guān)鍵作用。

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新聞點(diǎn)擊

豐富的早餐有助于控制血糖

據(jù)美國WebMD醫(yī)學(xué)新聞網(wǎng)(2013-10-17)報(bào)道，含有蛋白質(zhì)與脂肪的健康早餐能讓II型糖尿病患者更加控制饑餓感與血糖。

歐洲糖尿病研究學(xué)會在巴塞隆納舉辦的年會中發(fā)表了一篇以色列研究顯示，吃大量早餐的患者在3個月后血糖降低，近1/3的患者能降低糖尿病藥物用量。

紐約Montefiore醫(yī)學(xué)中心臨床糖尿病中心的Joel Zonszein醫(yī)生認(rèn)為，這個改變非常明顯，但不知其重復(fù)性如何。

研究人員根據(jù)之前的調(diào)查所做的這篇最新研究發(fā)現(xiàn)，相較于不吃早餐的人來說，固定吃早餐的人身體質(zhì)量指數(shù)(BMI)較低，BMI是用身高與體質(zhì)量計(jì)算，吃早餐的人血糖也比較低，能夠更有效的使用胰島素。

這個試驗(yàn)隨機(jī)找59位II型糖尿病患者吃大量或少量的早餐，大份量的早餐熱量約占整天熱量的1/3；少量早餐的熱量約占整天熱量的12.5%。結(jié)果顯示，每天吃大量早餐的人在13周后血糖與血壓顯著降低，約有1/3的人減少服用糖尿病的藥物，同時約有17%吃少量早餐的人需要增加藥物用量。

Generation of an H9N2 avian influenza virus and characterization of its replication properties in different cells

JIA Qian-nan, ZHAO Li-li, DENG Tao, CAO Meng-meng*

(Institute of Pathogen Biology，CAMS & PUMC，Beijing 100176，China)

Objective Generation of an H9N2 avian influenza virus with reverse genetics and characterization of its replication properties in different cells. Methods Eight gene segments of avian influenza virus A/Quail/HongKong/G1/97(H9N2) were amplified by RT-PCR technique and inserted into the pHW2000 vectors. The recombinant virus was rescued by cell transfection and the virus replication properties were analyzed in A549, MDCK and Vero cells. Results Using eight plasmid-based reverse genetics, the recombinant Avian H9N2 influenza virus was rescued. It was observed that A549 cells were more suitable for the H9N2 virus replication than MDCK cells and Vero cells. The molecular virulence markers of the virus were also summarized with bioinformatics technology. Conclusions The eight plasmid-based reverse genetic system successfully set up the avian H9N2 virus. The system may not only facilitate genetic manipulation of the H9N2 virus but also provide a platform in studying the virus and developing avian influenza vaccine.

avian influenza virus; reverse genetics; replication property

2014- 12- 19

2015- 01- 13

病毒性疾病感染組學(xué)關(guān)鍵技術(shù)平臺十二五重大專項(xiàng)(2013ZX10004601-002)

1001-6325(2015)04-0480-05

R373.1+3

A

*通信作者(corresponding author)：caommeng@ipbcams.ac.cn