趙靜，吳曉云，朱玉蓉，劉春玲，邱慧麒，方路

（浙江省湖州市婦幼保健院生殖醫(yī)學中心，湖州 313000）

1983年澳大利亞首例凍融胚胎移植（FET）獲得臨床妊娠［1］，1984年世界首例凍融胚胎移植活產(chǎn)嬰兒出生［2］?，F(xiàn)在胚胎凍融技術在輔助生殖技術中不可或缺。胚胎凍融技術不僅提高累計臨床妊娠率，還能降低多胎妊娠［3］與卵巢過度刺激綜合征（OHSS）發(fā)生率［4］。目前，胚胎凍融技術主要分為兩類：程序化凍融和玻璃化凍融。1985年美國首例玻 璃 化 凍 融 鼠 胚 成 功［5］，1990 年Gordts 等［6］玻 璃化凍融人胚胎，成功獲得妊娠。目前玻璃化凍融方法較程序化凍融胚胎復蘇率高［7］，但由于玻璃化冷凍試劑中的二甲基亞砜（DMSO）對胚胎有一定的毒性，胚胎長期保存后其安全性仍需要進一步研究。本文對我中心941 例玻璃化胚胎解凍周期進行回顧，分析玻璃化胚胎保存時間對解凍后胚胎質(zhì)量與妊娠結局的影響。

材料與方法

一、研究對象

回顧性分析我中心2011年3 月至2014 年10月941例玻璃化冷凍胚胎解凍周期的患者資料。女方年齡20～40歲，平均（30.23±4.00）歲，不孕原因主要為男方因素與女方輸卵管因素，排除患子宮內(nèi)膜異位癥與干擾胚胎著床疾病的患者。本研究僅納入促排方案為常規(guī)長方案與超長方案所獲的玻璃化冷凍胚胎，排除行FET 三個周期以上患者。其中IVF周期762 例，ICSI周期179 例，均采用開放式玻璃化載桿冷凍第3天胚胎。

二、研究方法

1.分組：根據(jù)胚胎玻璃化冷凍保存時間不同將941 例FET 周 期 分 為3 組：1～＜9 個 月 組（749例）、9～＜16 個月組（144 例）與≥16 個月組（48例，冷凍時間最長為38.4個月）。

2.胚胎冷凍：根據(jù)Edwards評分方法［8］對第3天胚胎進行評估，分裂胚形態(tài)學評分標準分為4級。Ⅰ級：卵裂球大小均等，透亮且無碎片；Ⅱ級：卵裂球大小不均，碎片＜10%；Ⅲ級：卵裂球大小不均，碎片在10%～50%之間；Ⅳ級：卵裂球大小不均，碎片＞50%。Ⅰ～Ⅲ級定義為優(yōu)質(zhì)胚胎，選擇優(yōu)質(zhì)胚胎進行玻璃化冷凍。冷凍前將冷凍試劑盒（JY公司，加拿大）置常溫預溫30 min。根據(jù)冷凍試劑盒說明書將胚胎移至冷凍試劑V1后，胚胎迅速皺縮，之后逐漸恢復，待胚胎膨脹至最飽滿時（約5min），將胚胎轉(zhuǎn)移至冷凍試劑V2，放置30s 后，將胚胎以最小液滴裝入載桿（JY 公司，加拿大）并浸沒于液氮1min。

3.胚胎復蘇：解凍前將解凍試劑盒（JY 公司，加拿大）置常溫預溫30min。根據(jù)解凍試劑盒說明將冷凍胚胎依次經(jīng)過試劑T1、T2、T3 清洗各2min、3min、3min，每次胚胎轉(zhuǎn)移均應充分洗凈，轉(zhuǎn)入試劑T4后將培養(yǎng)皿放于37℃熱臺，3min后將胚胎轉(zhuǎn)移至G2培養(yǎng)液（Vitrolife，瑞典）中洗凈，最后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)G2 液。復蘇胚胎在37℃、6% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)2h后用于移植。

胚胎復蘇后無卵裂球融解為完整胚胎存活，1～2個卵裂球融解為基本完整胚胎存活，一半以上卵裂球融解定義為胚胎死亡；胚胎存在率＝解凍后胚胎存在數(shù)／胚胎冷凍數(shù)；復蘇存活率＝復蘇存活胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)；完整胚胎存活率＝完整胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)；基本完整胚胎率＝基本完整胚胎數(shù)／解凍后胚胎存在數(shù)。

4.移植前內(nèi)膜準備：（1）自然周期，適用月經(jīng)周期正常、排卵規(guī)律并且內(nèi)膜形態(tài)較好患者。月經(jīng)周期9～10d陰道B超監(jiān)測卵泡大小與子宮內(nèi)膜發(fā)育情況，同時監(jiān)測血E2、LH 及孕酮（P）值，排卵后3～4d且內(nèi)膜厚度≥8mm 進行復蘇胚胎移植。（2）人工周期，適用月經(jīng)周期不正常、排卵不規(guī)律等患者。月經(jīng)周期第3 天口服雌激素（補佳樂，拜耳，德國）6mg／d連續(xù)服用7d，8mg／d連續(xù)服用7d，14d時B超監(jiān)測內(nèi)膜厚度與形態(tài)，并檢測E2水平。當內(nèi)膜厚度≥8mm 時，E2＞750pmol／L時，肌肉注射黃體酮（60mg／d，浙江仙琚）進行黃體支持，第3天復蘇胚胎并移植。

5.胚胎移植與妊娠檢測：移植前將胚胎轉(zhuǎn)移至移植膠（Vitrolife，瑞典）中，三段法將胚胎移至移植管（COOK，美國）中段，腹部B超監(jiān)測下將胚胎置于距宮底1～1.5cm 處。移植后14d檢測HCG 確定妊娠情況，HCG 陽性為生化妊娠，生化妊娠患者于胚胎移植4 周后進行B 超檢查，有孕囊者為臨床妊娠。

三、統(tǒng)計學分析

結 果

一、一般資料

3組患者冷凍時間分別為1～＜9個月、9～＜16個月與≥16個月，女方平均年齡分別為（30.20±3.95）歲、（30.24±4.29）歲與（30.94±3.78）歲，3組年齡差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；IVF比例分別為81.04%、80.56%與81.25%，授精方式無顯著性差異（P＞0.05）；3 組患者的平均解凍胚胎個數(shù)（玻璃化冷凍胚胎解凍數(shù)）和平均移植胚胎個數(shù)（玻璃化冷凍胚胎移植數(shù)）相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表1）。

二、各組復蘇胚胎質(zhì)量比較

3組患者的胚胎存在率、基本完整胚胎率相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；3組復蘇后存活率分別為98.22%、98.06%與96.33%，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；≥16個月組完整胚胎存活率高達88.07%，但與其他兩組相比較，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（表2）。

三、復蘇胚胎移植后妊娠結局比較

1～＜9 個月組移植749 例，其中生化妊娠466例（62.22%），臨 床 妊 娠440 例（58.74%）；9～＜16 個 月 組 移 植144 例，生 化 妊 娠78 例（54.17%），臨床妊娠71例（49.31%）；≥16個月組移植48 例，生 化 妊 娠26 例（54.17%），臨 床 妊 娠25例（52.08%）。3組間生化妊娠率與臨床妊娠率均無顯著性差異（P＞0.05）。3組種植率和異位妊娠率分別相比較，差異均無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。

表1 3組患者一般資料比較（±s）］

表1 3組患者一般資料比較（±s）］

組 別 周期數(shù) 女方年齡（歲） IVF比例（%）平均解凍胚胎個數(shù) 平均移植胚胎個數(shù)1～＜9個月749 30.20±3.95 81.04 2.17±0.58 1.97±0.16 9～＜16個月 144 30.24±4.29 80.56 2.16±0.59 1.97±0.18≥16個月48 30.94±3.78 81.25 2.29±0.46 1.96±0.29

表2 玻璃化冷凍保存不同時間復蘇胚胎質(zhì)量比較（%）

表3 玻璃化冷凍保存不同時間胚胎復蘇移植后妊娠結局比較（%）

討 論

胚胎冷凍技術在輔助生殖技術領域已廣泛應用。胚胎冷凍技術不僅有助于預防卵巢過激反應，為臨床選擇促排卵方案提供保障，也能夠提高患者累計臨床妊娠率。近年玻璃化凍融得到廣泛的應用。1998年Mukaida等［9］成功使用玻璃化冷凍方法冷凍鼠胚與人胚。與程序化凍融相比，玻璃化凍融因操作簡單、費用低、復蘇存活率高以及成功率較高等優(yōu)越性已逐漸取代程序化冷凍［10-11］。

玻璃化冷凍試劑采用滲透性冷凍保護劑，如DMSO 與乙二醇（EG），這些小分子物質(zhì)能夠快速穿過細胞膜而進入細胞內(nèi)，降低細胞內(nèi)外液體之間滲透壓，減緩細胞內(nèi)水分滲出從而減少細胞內(nèi)冰晶的形成。高濃度DMSO 對細胞有一定的毒性，可能是由于DMSO 能夠與蛋白質(zhì)發(fā)生不可逆性結合［12］。但是冷凍保存胚胎于-196℃液氮中對胚胎影響尚不可知，因此對玻璃化冷凍胚胎長期保存后胚胎質(zhì)量與解凍后妊娠結局進行回顧性分析是必要的。

現(xiàn)在對于胚胎冷凍保存時間是否影響胚胎質(zhì)量和妊娠結局觀點不一。1987 年Testart等［13］指出冷凍胚胎保存時間在1～2個月內(nèi)解凍移植有助于提高妊娠率，但認為胚胎長時間保存于液氮中會降低胚胎存活率。而Riggs等［14］在2010年對11 768枚冷凍合子與胚胎回顧性分析發(fā)現(xiàn)，隨著冷凍時間的延長，無論是普通IVF 周期還是供卵周期，臨床妊娠率、流產(chǎn)率、胚胎種植率以及活產(chǎn)率均無顯著性差異，但是解凍后妊娠結局與取卵時患者年齡、解凍后胚胎存活率以及移植胚胎數(shù)均有關。2011年趙慶紅等［15］將胚胎保存時間分為3組，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍胚胎保存時間對復蘇胚胎質(zhì)量與FET 結局沒有影響。2013年Aflatoonian等［16］根據(jù)玻璃化冷凍胚胎保存時間不同，將651枚胚胎分為5組，發(fā)現(xiàn)5組患者胚胎種植率與臨床妊娠率均無明顯差異，但認為仍需對長期保存胚胎種植后出生嬰兒進一步跟蹤研究。

2011年Dowling-Lacey等［17］報道冷凍保存時間長達20年的合子獲得新生兒1例。1990年34歲患者成功妊娠后捐獻了剩余5枚冷凍合子，20年后42歲受體患者因卵巢反應低下接收捐贈：5枚合子解凍后存活2枚，培養(yǎng)至第2天移植到受者體內(nèi)并成功獲得一健康男嬰。這是目前人胚胎保存最長并獲得成功的案例。另外2011 年Lavara等［18］報道玻璃化冷凍保存兔胚，于液氮中保存15年后，存活率、種植率以及活產(chǎn)率均未降低。2013年Wirleitner等［19］對1 077枚解凍囊胚進行分析，發(fā)現(xiàn)玻璃化冷凍囊胚6 年其解凍存活率與妊娠結局沒有降低，出生嬰兒畸形率也沒有顯著上升。上述研究表明冷凍保存不降低合子、分裂胚或者囊胚的質(zhì)量。Wong等［20］認識到胚胎冷凍技術發(fā)展迅速，F(xiàn)ET 成功率與新鮮胚胎移植成功率接近，因而提出全胚胎冷凍策略，他認為全胚胎冷凍可以完全避免卵巢過激反應。

胚胎冷凍在ART 中具有重要的地位，因此有必要尋找影響玻璃化凍融胚胎質(zhì)量的因素。趙慶紅等［21］分析了323個玻璃化胚胎凍融周期，發(fā)現(xiàn)隨著患者年齡增加，妊娠率明顯降低?？赡芘c高齡婦女卵巢儲備功能降低、子宮內(nèi)膜容受性差有關。另外胚胎復蘇存活比例也是重要影響因素，解凍胚胎完全存活組種植率與臨床妊娠率均顯著高于非完全存活組。Cercas等［22］提出玻璃化冷凍胚胎解凍后繼續(xù)培養(yǎng)1d，有胚胎發(fā)育成桑椹胚或者囊胚的患者比仍處于分裂期胚胎患者妊娠率高。胚胎繼續(xù)發(fā)育潛能也是影響胚胎妊娠結局的重要因素。

由于玻璃化法冷凍采用高濃度的冷凍保護劑，這些冷凍劑對胚胎的毒性作用是否會對子代造成不良影響，目前尚無定論。有必要對胚胎冷凍安全性進一步研究。Yao等［23］發(fā)現(xiàn)綿羊胚胎保存0.5 年后，胚胎解凍后綿羊活產(chǎn)率、后代死亡率以及出生時體重較冷凍保存7.5d者無統(tǒng)計學差異。

本文研究結果顯示胚胎玻璃化冷凍保存時間延長未降低胚胎復蘇存活率與完整胚胎率，同時，F(xiàn)ET周期生化妊娠率、臨床妊娠率以及胚胎種植率未隨胚胎保存時間延長而降低。提高解凍胚胎質(zhì)量與妊娠結局，不僅需要獲得優(yōu)質(zhì)胚胎，還要與患者溝通，盡早移植。玻璃化凍融胚胎移植技術不僅安全可靠，還能降低患者費用，預防OHSS，提高累計臨床妊娠率，值得臨床上推廣應用。

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