李 亮，劉安平，周正新，周章武，江樹連，盛炎炎

（安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院骨傷科，安徽 合肥230031）

有研究表明，軟骨細胞凋亡是骨關節(jié)炎（Osteoarthritis，OA）關節(jié)軟骨退變的關鍵因素之一[1]，軟骨細胞過度凋亡，數(shù)量過少，引起細胞外內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)的改變，又使軟骨細胞的凋亡增加，形成惡性循環(huán)，從而導致OA 的發(fā)生[2]，消腫方是根據(jù)我院骨傷科國家級名老中醫(yī)丁鍔教授根據(jù)“補腎活血利水”法組成的中藥復方，以補腎活血利水為主，臨床用于治療OA，多年的臨床觀察結果顯示其有較理想的治療效果[3]。前期研究顯示：補腎活血利水法具有促進軟骨細胞增殖、抑制其凋亡、調控滑膜組織基因表達譜及多種細胞信號通路等多種作用[4]，為了進一步探討其療效機制，揭示其發(fā)揮療效的藥理作用特點或靶點，本研究通過建立兔OA 動物模型，觀察不同濃度消腫方對動物模型的軟骨細胞凋亡及同源細胞群數(shù)量的影響，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

6 月齡體重2.6～3.2kg 的新西蘭大耳白兔36只，雌雄各半，隨機分為6 組（模型組、空白組、陽性對照組，中藥消腫方低劑量組（40g/kg）、中劑量組（80g/kg）、高劑量組（160g/kg），每組6 只，實驗動物均購自安徽中醫(yī)藥大學動物實驗中心，普通級，實驗動物許可證號：SYXK（皖）2013-0126。

1.2 主要試劑與儀器

1.2.1 主要試劑

Bcl-2、Bax 免疫組化試劑盒和軟骨細胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德公司）。

1.2.2 主要儀器

37℃溫箱（上海三發(fā)科學儀器有限公司 型號：GNP-9160 型），干燥箱（上海精宏實驗設備有限公司 型號：DHG-9140 型），石蠟切片機（Leica2135），BM-Ⅱ型病理組織包埋機（安徽省電子科學研究所），ZT-RP 生物組織脫水機、QP 切片漂烘溫控儀（湖北省孝感市亞光醫(yī)用電子技術有限公司），88-1大功率磁力攪拌器、QT-1 漩渦混合器（上海琪特分析儀器有限公司），LX-100 手掌型離心機（上海市麒麟醫(yī)用儀器廠），Nikon80 熒光顯微鏡（新飛達光學儀器公司）。

1.3 實驗藥物

消腫方劑生藥飲片由安徽中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院中藥房提供（懷牛膝15g，茯苓皮20g，黃芪15g，當歸10g，莪術8g，萆薢10g，紅花2g 組成），將生藥飲片80g 加入920g 水中制備成中劑量組，低、高劑量組分別將生藥飲片40g，160g 加入960、840g水中制備成低、高劑量組；鹽酸氨基葡萄糖規(guī)格：0.24g*28 片/盒，四川新斯頓藥業(yè)生產(chǎn)，產(chǎn)品批號為：141004。

1.4 實驗方法

1.4.1 造模

除空白組外，所有動物采用改良Hulth 法[5]制作膝關節(jié)OA 動物模型，麻醉生效后，常規(guī)消毒、鋪巾，取兔膝關節(jié)前內(nèi)側髕旁入路，切開皮膚及皮下組織后，內(nèi)側支持帶及關節(jié)囊后，將髕骨向外側脫位，顯露膝關節(jié)腔，顯露內(nèi)側半月板及前交叉韌帶，依次切除內(nèi)側半月板，切斷內(nèi)側副韌帶，切斷前交叉韌帶（改良Hulth 法），再逐層關閉關節(jié)囊、皮下組織、皮膚，敷料包扎切口，不予外固定，建模后連續(xù)4d青霉素3×104U 肌肉注射，10d 后開始每天強迫兔活動40min，連續(xù)6 周。

1.4.2 實驗分組與給藥

隨機分為6 組后，根據(jù)人與兔體表面積比值，人與兔藥物劑量比值為1/3，分別對消腫方低劑量組、中劑量組、高劑量組采用40、80g/kg 以及160g/kg 的消腫方煎劑20mL 灌胃，空白組灌服等容積生理鹽水，陽性對照組灌服溶有6 片硫酸氨基葡萄糖的生理鹽水溶液（1d 分3 次），連續(xù)治療4 周。

1.4.3 檢測指標和檢測方法

1.4.3.1 組織形態(tài)學檢查

光鏡下觀察軟骨細胞、軟骨陷窩、軟骨囊、同源細胞群及軟骨細胞間質形態(tài)、結構和數(shù)量的變化，在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個視野觀察，每個視野計數(shù)同源細胞群數(shù)量。

1.4.3.2 細胞凋亡檢測

采用TUNEL 法（原位缺口末端標記法）在10×40 光鏡視野下觀察，任選5 個視野觀察，平均計數(shù)100 個軟骨細胞中細胞核染色成棕色顆粒的細胞數(shù)目即為凋亡指數(shù)（AI）。

1.4.3.3 免疫組化檢測

標本石蠟切片，免疫組織化學染色（三步法）：石蠟切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育5～10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性。PBS（磷酸鹽緩沖液）浸泡5min×2 次，5%～10%正常山羊血清（PBS 稀釋）封閉，室溫孵育10min，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37℃孵育1～2h 或4℃過夜。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量生物素標記二抗工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。滴加適量的辣根酶或堿性磷酸酶標記的鏈霉卵白素工作液，37℃孵育10～30min。PBS 沖洗，5min×3 次。顯色劑顯色DAB（磷酸緩沖液）3～15min 自來水充分沖洗，復染，脫水，透明，封片。在光鏡下觀察Bcl-2 蛋白陽性表達為漿黃色顆粒，試驗以己知陽性染色切片作為陽性陽性對照，以磷酸緩沖液代替第一抗體作為陰性陽性對照，在400 倍放大率下，任選5 個高倍鏡視野，計算Bcl-2 陽性細胞所占百分比。

1.5 統(tǒng)計方法

所有數(shù)據(jù)應用SPSS 17.0 軟件包進行統(tǒng)計學分析，參數(shù)值用均數(shù)±標準差（x±s）表示。組間比較采用單因素方差分析，兩組間均數(shù)比較采用t 檢驗，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 兔膝關節(jié)軟骨細胞形態(tài)學觀察（HE 染色，10×40 倍）

圖1 空白組

圖2 模型組

圖3 陽性對照組

圖4 治療組（低劑量組）

圖5 治療組（中劑量組）

圖6 治療組（高劑量組）

由圖1-6 可知，空白組：軟骨細胞結構清晰、排列規(guī)則，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數(shù)量多，軟骨細胞間質少，模型組：軟骨細胞形態(tài)不規(guī)則、排列雜亂，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數(shù)量很少；軟骨細胞間質很多，治療組：軟骨細胞結構較清晰、排列較規(guī)則，軟骨陷窩及軟骨同源細胞群數(shù)量少，軟骨細胞間質多，介于空白組和模型組之間。

2.2 軟骨同源細胞群數(shù)量比較

由表1 統(tǒng)計結果顯示：同一時間段，在不同組別兩兩比較，高劑量治療組與中劑量治療組相比較時，P>0.05，4 周時陽性對照組與模型組比較時，P>0.05，8 周及12 周時中劑量治療組與低劑量治療組相比較時，P>0.05，其他組別兩兩比較時，P＜0.05。統(tǒng)計結果表明：模型組軟骨同源細胞群數(shù)量降低，治療后，軟骨同源細胞群數(shù)量升高，在治療早期（4周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時，其升高幅度加大，有統(tǒng)計學意義，但經(jīng)過治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時，雖升高幅度加大，無統(tǒng)計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統(tǒng)計結果為：空白組（P＜0.05），模型組（P＜0.05），陽性對照組（P＜0.01），治療組（低劑量組）（P＜0.01），治療組（中劑量組）（P＜0.05），治療組（高劑量組）為0.058，0.003，0.005，實驗結果表明：除高劑量治療組由4 周延長至8 周時，軟骨同源細胞群數(shù)量增加不明顯外，其余各組實驗動物隨時間延長，出現(xiàn)軟骨同源細胞群數(shù)量增加，有統(tǒng)計學意義。

2.3 采用TUNEL 法檢測軟骨細胞凋亡指數(shù)

由表2 可知，在同一時間軟骨細胞凋亡指數(shù)隨不同組別變化兩兩比較后統(tǒng)計結果為：4 周、8 周、12 周時P＜0.05。實驗結果表明：模型組軟骨細胞凋亡指數(shù)明顯升高，而經(jīng)過中藥消腫方治療后，軟骨細胞凋亡指數(shù)下降，而且隨中藥劑量增大，其下降幅度加大，有統(tǒng)計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較軟骨細胞凋亡指數(shù)后統(tǒng)計結果為：空白組8 周與4周相比，P=0.175，12 周與8 周相比，P=0.025＜0.05，模型組和陽性對照組8 周與4 周相比，P=0.025＜0.05，12 周與8 周相比，P=0.695，在低、中、高劑量治療組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實驗結果表明：空白組軟骨細胞凋亡指數(shù)在12 周時明顯升高，模型組和陽性對照組軟骨細胞凋亡指數(shù)在8 周時明顯升高，超過8 周后，升高不明顯，治療后，軟骨細胞凋亡指數(shù)下降，在各劑量治療組，隨治療時間由4 周逐漸延長至8 周、12 周時，其下降幅度加大，有統(tǒng)計學意義。（見圖7-12）

表2 軟骨細胞凋亡指數(shù)

圖7 空白組

圖8 模型組

圖9 陽性對照組

圖10 低劑量治療組

圖11 中劑量治療組

圖12 高劑量治療組

2.4 BCL-2 陽性細胞百分比

由表3 可知，在同一時間軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比隨組別變化兩兩比較后統(tǒng)計結果為：4周、8 周、12 周時P＜0.05。實驗結果表明：模型組BCL-2 陽性細胞百分比最低，隨組別變化至陽性對照組、低、中、高劑量治療組時，軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比逐漸升高，而且隨中藥劑量增大，其升高幅度加大，有統(tǒng)計學意義。

在各組隨時間變化（4 周，8 周，12 周）兩兩比較后統(tǒng)計結果為：空白組12 周與8 周相比，P＜0.05，其余5 組8 周與4 周相比，12 周與8 周相比，P＜0.05。實驗結果表明：隨時間延長，各組實驗動物均出現(xiàn)BCL-2 陽性細胞百分比明顯升高，有統(tǒng)計學意義。（見圖13-18）

表3 BCL-2 陽性細胞百分比

圖13 空白組

圖14 模型組

圖15 陽性對照組

圖16 低劑量治療組

圖17 中劑量治療組

圖18 高劑量治療組

3 討論

OA 發(fā)病率高，是老年人的最常見的慢性關節(jié)疾病，尤以膝關節(jié)OA（KOA）常見。北京市區(qū)的調查結果顯示60 歲以上老年人膝關節(jié)X 線OA 患病率女性為42.8%，男性為21.5%；臨床KOA 患病率女性為15%，男性為5.6%[6]。

OA 指由多種因素引起關節(jié)軟骨纖維化、皸裂、潰瘍、脫失而導致的關節(jié)疾病。目前病因尚不明確，其發(fā)生與年齡、肥胖、炎癥、創(chuàng)傷及遺傳因素等有關。其病理特點為軟骨蛋白多糖含量減少，導致軟骨破壞，進而全層軟骨消失，深達骨質，關節(jié)邊緣骨贅形成，軟骨下骨增厚、囊性變、硬化，滑膜呈慢性炎癥改變，同時滑膜釋放細胞因子，進一步破壞軟骨[7]，其病變涉及整個滑液關節(jié)，包括軟骨、滑膜和軟骨下骨、其發(fā)病過程最主要的特點是以膝關節(jié)軟骨的退行性改變和繼發(fā)性骨質增生為主要病理改變，表現(xiàn)為關節(jié)間隙變窄，軟骨下骨硬化[8]，OA 的發(fā)病機制尚不完全清楚，研究表明細胞外基質的降解、軟骨細胞凋亡等是該病發(fā)生的重要因素。

同源細胞群是由一個軟骨細胞分裂增殖形成的軟骨細胞群，位于軟骨組織的中部。每個同源細胞群有2～8 個軟骨細胞，包含在一個大的軟骨陷窩內(nèi)，后者又分成幾個小的陷窩，各含一個軟骨細胞。軟骨的同源細胞群深層的軟骨組織內(nèi)軟骨陷窩較少，但形態(tài)較大，內(nèi)含多個軟骨細胞，但細胞較成熟，代謝緩慢，越靠近軟骨的中部，同源細胞群的數(shù)目越多，反映了軟骨細胞外基質的生長，同源細胞群的數(shù)目下降，則表明細胞外基質的降解，目前對于同源細胞群數(shù)目的相關研究較少，因此關于這方面的研究有待進一步開展。

軟骨細胞凋亡在OA 病理過程中發(fā)揮的作用越來越受到重視[9]，細胞凋亡（細胞程序性死亡）是一個主動的、信號依賴的過程，并由基因控制的主動的、高度有序的死亡過程。線粒體凋亡、內(nèi)質網(wǎng)應激性凋亡、細胞自噬在OA 的發(fā)病過程中發(fā)揮重要的調控作用[10]。因此關于軟骨細胞凋亡的實驗研究成為目前的熱點之一。目前有研究表明Bcl-2 家族是調節(jié)細胞凋亡相關蛋白中的關鍵調因子，其抗凋亡與促凋亡成員協(xié)調作用[11]，Bcl-2 家族蛋白的一個顯著特征是具有Bcl-2 同源結構域，主要體現(xiàn)在4個保守的區(qū)域，即BH1、BH2、BH3、BH4 結構域，典型的抗凋亡成員如Bcl-2、Bcl-XL、Mcl-1、Bcl-W 等含有4 個短的保守的BH 結構域和一個C 端疏水尾狀結構，即跨膜結構域，這類成員具有抗凋亡活性，在免疫調節(jié)中發(fā)揮重要作用。

KOA 屬中醫(yī)“痹證”范疇，是臨床難治性疾病之一，晚期致殘率高，多數(shù)患者最終需要人工關節(jié)置換以改善功能，所以本病治療的關鍵在于早期防治[12]，從西醫(yī)來說，即使僅以緩解癥狀、改善功能為目的，也缺少療效更好、不良反應更少的治療方法，因此中醫(yī)藥治療骨關節(jié)炎已經(jīng)逐漸受到重視。中醫(yī)對其認識歷史悠久，治療手段多樣，有臨床效果好、副作用少等優(yōu)勢[13]。中醫(yī)認為中老年膝骨關節(jié)炎的主要病機是肝腎不足，氣虛血瘀，虛損與瘀實并存，虛損為本，成其病，瘀實為標，其病在筋骨，與肝腎密切相關[14]，消腫方是根據(jù)我院骨傷科國家級名老中醫(yī)丁鍔教授根據(jù)“補腎活血利水”法組成的中藥復方，有補腎利水、活血化瘀之功，對痰、瘀、水互阻所致的骨關節(jié)炎能起較好的治療作用[15]。

氨基葡萄糖是構成關節(jié)軟骨的內(nèi)源性物質，可刺激黏多糖的生化合成及增加骨骼鈣質的攝取，以提高骨與軟骨組織的代謝功能和營養(yǎng)，同時改善與增強滑膜液的黏稠度，增加滑膜液合成，提供關節(jié)潤滑功能，還可阻斷OA 的病理過程，防止疾病進展，抑制和消退關節(jié)變性形成，從而有效修復軟骨關節(jié)，持久緩解疼痛，阻止疾病進展，具有優(yōu)越的耐受性和安全性，臨床廣泛用于骨關節(jié)炎的治療，是第一個經(jīng)臨床證明的骨關節(jié)炎疾病改善藥物[16]，因此在本研究中作為陽性對照藥物。

在制作模型方法上，本研究采用經(jīng)典的改良Hulth 法建立骨關節(jié)炎家兔模型，通過切除內(nèi)側半月板，切斷前交叉韌帶、內(nèi)側副韌帶造成膝關節(jié)的不穩(wěn)，使關節(jié)軟骨承受了異常的機械壓力，從而導致軟骨退變及破損[17]，并且采取強迫活動方式誘導模型建立。兔膝骨關節(jié)炎模型中關節(jié)內(nèi)手術方法，如改良Hulth 法等模型誘導成功率高，穩(wěn)定性好，應用廣泛，特別適用于膝關節(jié)內(nèi)注藥預防和減輕OA病理改變的研究[18]。

本實驗研究表明：空白組軟骨細胞凋亡指數(shù)在12 周時明顯升高，模型組和陽性對照組軟骨細胞凋亡指數(shù)在8 周時明顯升高，超過8 周后，升高不明顯，而經(jīng)過中藥消腫方治療后，軟骨細胞凋亡指數(shù)下降，其下降幅度與治療時間以及中藥劑量有相關性，消腫方具有抑制軟骨細胞凋亡作用；模型組軟骨同源細胞群數(shù)量降低，在治療早期（4 周），隨中藥劑量由低劑量組到中劑量組增加時，其升高幅度加大，有統(tǒng)計學意義，但經(jīng)過治療8 周及12 周后，隨中藥劑量增加時，雖升高幅度加大，無統(tǒng)計學意義，除高劑量治療組由4 周延長至8 周時，軟骨同源細胞群數(shù)量增加不明顯外，其余各組實驗動物隨時間延長，出現(xiàn)軟骨同源細胞群數(shù)量增加，有統(tǒng)計學意義，表明消腫方能增加軟骨同源細胞群數(shù)量，并與治療時間以及中藥劑量有相關性；模型組BCL-2 陽性細胞百分比最低，通過消腫方治療后，軟骨細胞BCL-2 陽性細胞百分比逐漸升高，表明消腫方能升高BCL-2 陽性細胞百分比，并且其升高幅度與治療時間以及中藥劑量有相關性；但其抑制軟骨細胞凋亡與升高同源細胞群數(shù)量及BCL-2 陽性細胞百分比內(nèi)在關系以及是否通過某些信號通路發(fā)揮其干預作用，尚有待進一步研究證實。

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