羅小芳，茹清靜

（1.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053；2.浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二醫(yī)院，浙江 杭州310005）

代謝組學(xué)是一種新型的、整體性的分析技術(shù)，即應(yīng)用現(xiàn)代分析儀器，對生物體體液中的內(nèi)源性代謝產(chǎn)物進行定性與定量的分析研究，獲得特征性的代謝標志物，從而揭示生物體在某一特定環(huán)境下的基因調(diào)控功能。肝臟是機體代謝的樞紐，承當(dāng)了機體大部分的合成、分解和轉(zhuǎn)化等代謝過程。故從代謝的角度研究肝臟和肝臟疾病很重要。

1 代謝組學(xué)的概況

1.1 代謝組學(xué)的概念和特點

代謝組學(xué)是晚近興起的后基因組學(xué)，是生命科學(xué)最熱門的研究領(lǐng)域之一。代謝組學(xué)（Metabonomics）的概念，由英國倫敦大學(xué)Nicholson 博士在1999 年首次提出，它被定義為代謝物質(zhì)動態(tài)響應(yīng)的定量測定和定性分析，如病理生理、遺傳修飾的生物體和外界的刺激導(dǎo)致的改變等[1]。2000 年，德國馬普所的Fiehn 教授[2]等提出了metabolomics 的概念，將代謝組學(xué)界說為一個靜態(tài)的過程，即對生物樣品的整體代謝譜研究是在特定條件下進行的。近年來，隨著探究的深入，科學(xué)家們對其概念也進行了完善和增補，將代謝組學(xué)定義為：通過分析生物體的體液、組織中內(nèi)源性小分子代謝產(chǎn)物的變化，獲取生物標記物，從而揭示不同時間與環(huán)境下的生物體整體功能狀態(tài)的差異[3]。

代謝組學(xué)來源于代謝組[4]，是以組群指標分析為基礎(chǔ)，以數(shù)據(jù)處理為手段，以信息建模整合為目標，通過對機體代謝產(chǎn)物在時間上的定量和定性分析，從總體上評價生命體的功能狀況及其改變[5]。與其他組學(xué)相比較，基因和蛋白質(zhì)表達的有效微細變化會在代謝產(chǎn)物上得到放大，便于檢測，代謝物含量的微細變化與生物表型的大改變是可以有直接相關(guān)性的[6]，如Billy David 曾言：“基因組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)告訴你可能發(fā)生什么，而代謝組學(xué)則告訴你已經(jīng)發(fā)生了什么?！盵7]

1.2 代謝組學(xué)的研究方法

代謝組學(xué)的研究程序一般包括生物樣本的采集，樣品預(yù)處理，數(shù)據(jù)的收集、剖析與詮釋，符號識別和路徑分析等環(huán)節(jié)[8]。關(guān)鍵的環(huán)節(jié)是數(shù)據(jù)的分析和處理[9]，常用的方法是核磁共振（NMR），質(zhì)譜（MS）及其聯(lián)用技術(shù)：①NMR 技術(shù)，作為結(jié)構(gòu)分析的有力工具，它可以快速無創(chuàng)、無偏向性地對生物體液等復(fù)雜混合物進行檢測，樣品不需要繁瑣處理，多種成分測定可同步進行[10]。NMR 的局限性在于其靈敏度相對較低，檢測動態(tài)范圍有限，故不適合用于分析數(shù)量較大的低濃度代謝物。②MS 技術(shù)[11]，單獨運用時速度較快，與其他技術(shù)聯(lián)合使用則具有高靈敏度、高選擇性、可定性定量分析多種代謝物等性質(zhì)，現(xiàn)已經(jīng)成為代謝組學(xué)研究中的首選技術(shù)。氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）[12]，能同時測定上千種不同化合物的化學(xué)性質(zhì)，具有較高的檢測靈敏度，我們還能參考其提供的質(zhì)譜庫來確定待分析樣品的代謝成分。最大的好處是，不需要那些非揮發(fā)性代謝產(chǎn)物的化學(xué)衍生化過程尤其適用于那些物質(zhì)熱穩(wěn)定性差，難揮發(fā)和相對分子質(zhì)量較大的物質(zhì)；毛細管電泳-質(zhì)譜（CE-MS）[13]，這是一個相對較新且具有發(fā)展前景的技術(shù)，其優(yōu)勢在于高分離效率和微量樣本量，故可以同時得到不同類代謝物的不同的代謝組學(xué)特征。

2 代謝組學(xué)在肝臟疾病研究中的應(yīng)用

作為機體代謝的重要器官，肝臟承擔(dān)了大部分的合成、分解和轉(zhuǎn)化等過程，一些酶和功能是肝臟所特有的；肝臟一旦受損，將影響全身各個系統(tǒng)器官的功能，因此從代謝的角度研究肝臟疾病，有其物質(zhì)基礎(chǔ)[14]。故在肝臟疾病研究中具有不可或缺的作用。

2.1 代謝組學(xué)在乙型肝炎中的應(yīng)用

全球人口中約有20 億人感染乙型肝炎病毒，其中20%～35%的患者最終將死于肝硬化或肝癌[15]。楊永霞等[16]利用超導(dǎo)核磁共振譜儀分別檢測8 例正常人血清和11 例重型乙型肝炎患者血清，發(fā)現(xiàn)重癥肝患者的蛋氨酸、三甲胺和葡萄糖含量升高，而乳酸、膽堿和脂質(zhì)的含量降低。這些血清代謝物的差異可以幫助我們對重癥乙肝患者的早期識別、診斷及治療，提高預(yù)后生存率。侯麗娟等[17]采用NMR技術(shù)檢測慢性乙肝合并抑郁患者的尿液中的代謝物質(zhì)，發(fā)現(xiàn)慢乙肝合并抑郁的患者尿液中乙酸鹽、馬尿酸鹽和二甲基甘氨酸的含量顯著升高，本研究結(jié)果有助于未來解決臨床實踐中抑郁癥診斷不確定的困境。

2.2 代謝組學(xué)在脂肪肝中的應(yīng)用

非酒精性脂肪肝是一種與肥胖、胰島素抵抗及遺傳因素有關(guān)的代謝性疾病[18]，是隱源性肝硬化的最主要病因[19]，70%隱源性肝硬化由非酒精性肝炎導(dǎo)致[20]，肝活檢是其臨床診斷的金標準，但由于是一種有創(chuàng)技術(shù)，故臨床推廣受限。劉曉琳等[21]通過液相色譜-四級桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)在大鼠的肝臟和血清中檢測差異表達的代謝物，結(jié)果發(fā)現(xiàn)40 只大鼠都出現(xiàn)了代謝紊亂，且硬脂酰肉毒堿在非酒精性脂肪肝的不同表型中都穩(wěn)定升高，為臨床提供了一個敏感且無創(chuàng)的診斷脂肪肝的方法。酒精性肝病[22]（Alcoholic liver disease，ALD）是由于酒精直接對肝臟細胞造成損害，引起肝細胞發(fā)生脂肪變性、壞死，孫長海等[23]用GC-MS 梁琦等[25]結(jié)合代謝組學(xué)結(jié)果檢測：確定了肌酐、氨基酸和谷胱甘肽等7 種可早期診斷酒精性肝病患者的尿液中生物標記物。

2.3 代謝組學(xué)在肝損傷中的應(yīng)用

肝損藥物及其代謝產(chǎn)物的毒性作用、化學(xué)品及過敏反應(yīng)等非病毒性因素是造成肝損傷的主要原因[24]，而臨床上對肝損傷的診斷目前主要依靠排除法。廣防己、漢防己的使用會影響涉及葡萄糖和脂質(zhì)代謝的肝毒性和肝線粒體功能的影響；且涉及到能量代謝紊亂。Schoonen W[26]等發(fā)現(xiàn)用溴苯誘導(dǎo)肝壞死的小鼠模型，其肝壞死的程度與溴苯的劑量成正相關(guān)，處理組小鼠的血清及尿液中的乳酸鹽、酪氨酸等代謝產(chǎn)物的含量與對照組小鼠不同，提示我們可以通過檢測代謝產(chǎn)物的改變來發(fā)現(xiàn)具有特異性生物學(xué)標記物的肝損傷。

2.4 代謝組學(xué)在肝硬化中的應(yīng)用

肝硬化是由一個或多個病因長期或反復(fù)作用形成的彌漫性肝損害，目前代謝組學(xué)技術(shù)廣泛應(yīng)用于肝硬化的診斷[27]。楊永霞等[28]等用核磁共振氫譜（1H NMR）技術(shù)研究乙肝后肝硬化患者血清的代謝組學(xué)變化，發(fā)現(xiàn)磷酸膽堿/脂和膽堿含量降低，而乳酸、甲硫氨酸及葡萄糖的含量升高，這些代謝產(chǎn)物的差異提供了肝硬化在可靠的分子水平上的診斷依據(jù)，可盡早區(qū)分出乙肝和乙肝后肝硬化患者，便于及時進行治療。

2.5 代謝組學(xué)在肝衰竭中的應(yīng)用

肝衰竭[29]是由多種因素引起的嚴重肝臟損害，導(dǎo)致其合成、解毒和排泄等功能發(fā)生嚴重障礙甚至失代償，病死率極高。Yang 等[30]研究肝功能衰竭鼠模型的代謝組學(xué)特征，發(fā)現(xiàn)肝功能衰竭組與對照組之間的血清膽汁酸峰值有明顯差異，提示血清膽汁酸水平可以為肝衰竭的病因分析及進一步研究提供依據(jù)。Feng 等[31]應(yīng)用CG-MS 研究了急性肝功能衰竭大鼠的血清代謝產(chǎn)物，發(fā)現(xiàn)血清中β-羥丁酸鹽、5-羥吲哚乙酸和磷酸鹽含量水平均增高，提示代謝產(chǎn)物的變化能幫助急性肝功能衰竭的診斷。

2.6 代謝組學(xué)在原發(fā)性肝癌中的應(yīng)用

原發(fā)性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）目前發(fā)病率位居惡性腫瘤第5 位，病死率居第3 位[32]，同時它的5 年生存率還不到7%[33]。甲胎蛋白（AFP）不是原發(fā)性肝癌獨有的客觀輔助指標，鑒于AFP 的非特異性，張蕾等[34]選擇27 例肝癌患者、31 例肝硬化患者及22 例健康志愿者的尿液樣本，采用超高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進行代謝組學(xué)的分析研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)四氫醛固酮3 葡萄糖甘酸、膽汁甘氨酸等代謝物在肝癌組尿液中含量高于肝硬化組，而鵝脫氧膽酸、乳果糖、吡啶酚等代謝物的含量均低于肝硬化組，這些代謝標志物的變化可以為原發(fā)性肝癌的發(fā)病機理及早期診斷提供重要的分子學(xué)依據(jù)。

2.7 代謝組學(xué)在肝移植中的應(yīng)用

肝移植是治療各種終末期肝臟疾病的主要手段。因為肝移植術(shù)前、術(shù)后患者易發(fā)生多器官的生理功能障礙和代謝代謝紊亂，故及時準確地監(jiān)測病情變化，是患者能否實施肝移植和評估移植肝功能狀態(tài)的關(guān)鍵。有相關(guān)肝移植的研究[35]表明，許多重要的生物標記物都與尿素代謝循環(huán)有關(guān)，如供肝者肝中甲基化精氨酸衍生物的濃度可以靈敏地預(yù)測移植肝的功能狀態(tài)，而血清和尿液中的尿素異常降低、谷氨酰胺異常升高的水平均可以用來判斷是否出現(xiàn)肝移植腎功能異常及急性排異反應(yīng)。

3 小結(jié)與展望

代謝組學(xué)技術(shù)正處于快速發(fā)展的階段，能全面評估細胞在其自身微環(huán)境中的狀態(tài)，具有巨大的應(yīng)用潛力和科學(xué)價值，其在肝臟疾病中的應(yīng)用范圍也越來越廣泛。我們有理由相信，隨著代謝組學(xué)技術(shù)的進一步革新及分析技術(shù)的不斷完善，我們能尋找出更多特征性代謝標志物，從而為其發(fā)病機理、診斷治療提供新的客觀依據(jù)。

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